Методика комплексного исследования слюны, потожировых выделений, волос и ногтей человека на присутствие остаточных количеств наркотических средств (морфина, героина и его метаболита 6-моноацетилморфина, кодеина, метадона, кокаина, фенциклидина). Методические рекомендации

(утв. Постоянным комитетом по контролю наркотиков, Протокол от 15.12.1997 № 8/62-97)

Утверждена на заседании Постоянного комитета по контролю наркотиков 15 декабря 1997 года (протокол № 8/62-97)

МЕТОДИКА КОМПЛЕКСНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СЛЮНЫ, ПОТОЖИРОВЫХ ВЫДЕЛЕНИЙ, ВОЛОС И НОГТЕЙ ЧЕЛОВЕКА НА ПРИСУТСТВИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ (МОРФИНА, ГЕРОИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА 6-МОНОАЦЕТИЛМОРФИНА, КОДЕИНА, МЕТАДОНА, КОКАИНА, ФЕНЦИКЛИДИНА)

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Выделения человека, особенно кровь, моча, а также секционный материал, являются обычными объектами исследования для установления факта употребления вещества или простого контакта с контролируемым веществом. Уровень содержания наркотиков в этих объектах может быть определен лишь в течение 3 — 5 дней после приема. Нетрадиционные образцы — ногти и волосы — удерживают наркотики и их метаболиты в течение более продолжительного времени — от месяцев до лет. Легкость получения образцов и устойчивость наркотиков при нахождении в них — свидетельство «превосходства» этого материала над биологическими жидкостями человека. Например, образцы волос, ногтей, слюны, пота можно легко отбирать, не посягая на права человека, в противоположность отбору крови. Разработка высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии и хромато-масс-спектрометрии, позволяющих определять незначительные концентрации наркотиков, стимулировала разработку методов исследования таких нетрадиционных образцов, как волосы и ногти.

Основными преимуществами волос, ногтей и потожировых выделений человека как объектов исследования с целью установления присутствия в них остатков лекарственных препаратов и наркотиков являются:

• возможность обнаруживать употребление наркотиков в организме человека спустя недели, месяцы или даже годы после окончания их приема;
• возможность проследить во времени динамику поступления наркотика или лекарственного средства в организм;
• возможность осуществления скрытного отбора образцов, главным образом образцов волос и образцов потожировых выделений на предметах одежды, при проведении оперативно-розыскных мероприятий;
• возможность исследования широкого диапазона концентраций от субтерапевтических до сублетальных для наркотических и лекарственных средств;
• возможность проведения комплексной оценки объектов, так как данные, получаемые при исследовании волос, ногтей, а также потожировых выделений и прочих загрязнений на них, взаимодополняют и углубляют друг друга;
• простота отбора и хранения проб.

1. Исследование слюны и потожировых выделений

Исследование остатков наркотических средств в потожировых выделениях и слюне проводят методами тонкослойной хроматографии и методом хромато-масс-спектрометрии при использовании режима электронного удара при 70 эВ с последующим сканированием в диапазоне от 50 до 550 m/z масс.

1.1. Экстракция потожировых выделений с поверхности волос и ногтей

Представленные на исследование образцы волос и ногтей настаивают с этанолом (или метанолом) в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем спиртовые вытяжки фильтруют и упаривают досуха на роторном испарителе при 40 °C. Сухой остаток растворяют в 50 — 200 мкл этанола (или метанола). В качестве контроля используют смывы с образцов волос и ногтей лабораторного персонала, полученные аналогичным способом.

1.2. Подготовка образцов слюны и потожировых выделений

Слюну или потожировые выделения, нанесенные на марлевые или ватные тампоны, экстрагируют методом мацерации 75 мл этанола (или метанола) в течение 4 ч. Затем спиртовые вытяжки фильтруют и упаривают досуха на роторном испарителе при 40 °C. Сухой остаток растворяют в 50 — 200 мкл этанола (или метанола). В качестве контроля используют смывы с рук, лица и шеи лабораторного персонала, полученные аналогичным способом.

1.3. Предварительное исследование методом тонкослойной хроматографии

Для проведения предварительных исследований этанольные вытяжки в количестве 5 мкл наносят на хроматографические пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии с Кизельгелем 60 F254, производства фирмы «МЕРК» (Германия), размером 10 x 10 см. Одновременно на пластины в качестве метчиков наносят стандартные растворы 100 мкг/мл исследуемых веществ в этаноле. Количество наносимых метчиков определяется экспертом в каждом конкретном случае в зависимости от количества исследуемого образца, обстоятельств дела и прочих причин. Количество метчиков не может быть меньше двух наименований. Хроматографирование рекомендуется проводить в системах:

• метанол-концентрированный аммиак (100:1,5);
• циклогексан-толуол-диэтиламин (75:15:10).

После удаления растворителя пластинки просматривают в УФ-свете при \lambda = 254 и \lambda = 366 нм. Обработку пластин рекомендуется проводить одним из нижеперечисленных реактивов:

реактив Марки (раствор формальдегида в серной кислоте);

реактив Драгендорфа (раствор висмута субнитрата и йодида калия в разбавленной уксусной кислоте);

раствор йодплатината (раствор платины хлорида и йодида калия в разбавленной соляной кислоте).

При обнаружении на хроматограммах хроматографических зон, совпадающих по значению Rf, поглощению в УФ-свете и характеру окрашивания после обработки предлагаемыми реактивами с хроматографическими зонами стандартных растворов наркотических средств, проводят подтверждающее исследование методом хромато-масс-спектрометрии. Появление на пластинах после обработки приведенными выше реактивами окрашенных хроматографических зон, не совпадающих по значению Rf с метчиками, также является причиной для проведения исследований методом хромато-масс-спектрометрии.

1.4. Исследование методом хромато-масс-спектрометрии

Исследование методом хромато-масс-спектрометрии проводят на газовом хроматографе, оборудованном кварцевой капиллярной колонкой с неполярной неподвижной фазой. Для обнаружения соединений используют масс-селективный детектор.

Для проведения работ рекомендуется следующее оборудование фирмы «Хьюлетт Паккард» (США):

• газохроматографическая колонка HP-1, HP-5 или HP-5 MS с внутренним диаметром 0,1 или 0,25 мм и длиной 10 — 30 м;
• газовый хроматограф серии HP5890 или HP6890;
• масс-селективный детектор HP5970 или его более новые аналоги.

Расход газа-носителя и температурные условия подбираются индивидуально в зависимости от применяемой хроматографической системы на основании параметров удерживания исследуемых веществ.

Типовые условия проведения исследований:

1. хроматограф HP5890 с колонкой HP-1 внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м;

2. газ-носитель: гелий;

3. скорость расхода газа-носителя: 1,4 мл/мин.;

4. температура инжектора и интерфейса 240 и 280 °C соответственно;

5. температура колонки программируется от 100 до 270 °C со скоростью 20 °C в мин.;

6. объем пробы 1 — 3 мкл;

7. способ введения: без деления потока газа-носителя.

После проведения исследований масс-спектры, снятые с вершин хроматографических пиков, сравнивают по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «NBS75K» и «WILEY», производства фирмы «Хьюлетт Паккард».

Вещество считается идентифицированным при совпадении его масс-спектра с библиотечным масс-спектром со значением коэффициента подобия более 90% и совпадении его времени удерживания со временем удерживания стандарта идентифицированного вещества.

2. Исследование волос и ногтей на присутствие следовых количеств наркотических средств

Исследование остатков наркотических средств в отмытых от посторонних примесей образцах волос и ногтей проводят методом хромато-масс-спектрометрии при использовании режима электронного удара при 70 эВ с последующим детектированием характеристических для исследуемых веществ ионов.

2.1. Подготовка образцов к исследованию

Для удаления внешних загрязнений волосы и ногти отмывают 2N раствором хлористо-водородной кислоты и метанолом (или этанолом) до полного исчезновения в последнем растворителе (после его упаривания) следов наркотического средства.

Присутствие исследуемых веществ определяют по описанной выше методике хромато-масс-спектрального исследования, за исключением того, что прибор работает в режиме регистрации характеристических для исследуемых веществ или их трифторуксусных производных (далее ТФА-производных) ионов. Времена удерживания и характеристические ионы приведены в табл. 1.

По данной методике вещество считают идентифицированным при совпадении времени удерживания всех характеристических ионов, а также соотношения площадей их хроматографических пиков с аналогичными показателями стандартного образца.

Количество исследуемых характеристических ионов для каждого вещества определяется экспертом на основании выбранных им условий хроматографирования и используемого оборудования. При проведении экспертных исследований данное количество не может быть меньше 3.

Отсутствие одного хроматографического пика характеристического иона в пределах 0,02 мин. времени удерживания при наличии всех других пиков указывает на отсутствие данного соединения в пробе. На рис. 1 приведены хроматограммы характеристических ионов кокаина, выделенного из волос проверяемого лица.

Таблица 1

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКИЕ ИОНЫ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ <*>

<*> Время удерживания стандартов может изменяться в зависимости от используемых хроматографических условий.

Рис. 1. Хроматограммы характеристических ионов кокаина, выделенного из волос проверяемого лица

Пределы обнаружения всех исследуемых веществ составляют 0,50 — 0,75 нг во вводимой пробе.

2.2. Методика получения трифторуксусных производных опиатов

Получение ТФА-производных проводят по следующей методике: после удаления растворителя к сухому остатку экстракта добавляют 100 мкл ангидрида трифторуксусной кислоты и нагревают при 80 °C в течение 10 мин. После этого смесь охлаждают и упаривают в токе инертного газа или воздуха. Сухой остаток растворяют в 50 — 250 мкл этилацетата.

2.3. Методики выделения веществ из волос и ногтей

Отмытые по приведенной выше методике волосы и ногти сушат при комнатной температуре. Отбирают навеску 10 — 30 мг образца, которые далее обрабатывают двумя методами.

Методика 1. Навески образцов заливают 1 — 3 мл метанола и обрабатывают ультразвуком не менее 1 ч при проведении качественных исследований и не менее 6 ч при количественном исследовании. После этого жидкость сливают. Образцы промывают метанолом и объединенные метанольные экстракты упаривают досуха.

Измельчение образцов в ступке пестиком с применением битого стекла может ускорить процесс выделения исследуемых веществ. Однако при этом также увеличивается выход соэкстрактивных веществ.

Методика 2. Навески разрушают в ступке пестиком с использованием битого стекла. Полученные гомогенаты настаивают при постоянном перемешивании при температуре 80 °C с 1 мл 6N HCL в течение 6 ч. Затем надосадочную жидкость отделяют от образцов. Оставшиеся образцы промывают 1 мл дист. воды. Объединенные водные вытяжки подщелачивают раствором аммиака до pH10 и экстрагируют 3 раза 2 мл смеси хлороформ — изопропанол (9:1). Объединенные хлороформные вытяжки сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха. Данная методика приводит к гидролизу героина и его моноацетильных метаболитов до морфина. В результате происходит увеличение чувствительности метода исследования в целом при снижении его селективности.

Выбор методики проводится экспертом на основании анализа обстоятельств дела и поставленных перед ним вопросов.

Пример типового заключения эксперта

Эксперты криминалистической лаборатории Семенов Анатолий Иванович (образование высшее, специальность врач-лаборант, стаж экспертной работы 16 лет) и Сидоров Александр Николаевич (кандидат химических наук, стаж экспертной работы 18 лет) на основании постановления заместителя начальника Управления по расследованию организованной преступной деятельности МВД России полковника юстиции Жиглова И.А. от 9 декабря 1996 г. провели экспертизу по материалам уголовного дела № 13/1050.

На разрешение эксперта поставлен вопрос: имеются ли следы наркотических средств в изъятых у Филиппова М.В. ногтевых срезах, срезах волос, смывах с рук, лица и шеи, если да, то каких именно?

В распоряжение эксперта представлены ногтевые срезы и образцы волос, упакованные в почтовый пакет, опечатанный печатью № 9 МВД России, а также смывы с рук, лица и шеи, упакованные в почтовый пакет, опечатанный печатью № 9 МВД России.

Внешний осмотр. На исследование объекты поступили в двух бумажных почтовых пакетах голубого цвета, опечатанных печатями «С/Ч. МВД РФ. № 9» и заверенных подписями. На пакетах имелись надписи: «1. Образцы волос. 2. Ногтевые срезы Филиппова М.В.» и «Смывы с рук, с лица и шеи Филиппова М.В.» соответственно. Целостность пакетов и печатей в момент поступления нарушена не была. При их вскрытии в них обнаружены:

прядь волос темного цвета, весом 0,249 г, длиной 4,5 см;

обрезки ногтей весом 0,047 г;

ватные тампоны в полимерных пакетах с надписями «смывы с рук» и «смывы с лица и шеи».

Исследование

Исследование смывов (тампонов) с рук, лица и шеи

Исследование остатков наркотических средств на представленных тампонах осуществляли методом тонкослойной хроматографии и методом хромато-масс-спектрометрии.

Представленные на исследование тампоны замачивали в 75 мл этанола в течение 4 ч. Затем спиртовые вытяжки фильтровали и упаривали досуха на роторном испарителе при 40 °C. Сухой остаток растворяли в 200 мкл этанола. В качестве контроля использовали смывы с рук, лица и шеи лабораторного персонала, полученные аналогичным способом.

Этанольные вытяжки в количестве 5 мкл наносили на хроматографические пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии с Кизельгелем 60 F254, производства фирмы «МЕРК» (Германия), размером 10 x 10 см. Одновременно на пластины наносили стандартные растворы 100 мкг/мл морфина, героина, кокаина и метадона в этаноле. Хроматографирование проводили в системах:

• метанол — конц. аммиак (100:1,5),
• циклогексан-толуол-диэтиламин (75:15:10).

После удаления растворителя пластинки просматривали в УФ-свете при \lambda = 254 и \lambda = 366 нм и обрабатывали реактивом Драгендорфа (раствор висмута субнитрата и йодида калия в разбавленной уксусной кислоте).

В результате проведенных исследований на хроматограммах смывов с ладоней рук, лица и шеи Филиппова М.В. хроматографических зон, совпадающих по значению Rf, поглощению в УФ-свете и характеру окрашивания реактивом Драгендорфа с хроматографическими зонами стандартных растворов морфина, героина, кокаина и метадона, не обнаружено (предел обнаружения метода составляет 10-7 г).

Исследование методом хромато-масс-спектрометрии проводили на газовом хроматографе HP-5890 серии 2, оборудованном капиллярной колонкой HP-1 с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м. Для обнаружения соединений использовали масс-селективный детектор HP-5970. Все оборудование произведено фирмой «Хьюлетт Паккард». В качестве газа-носителя применяли гелий со скоростью 1,4 мл/мин. Условия хроматографирования: температура инжектора и интерфейса 240 и 280 °C соответственно; температура колонки программировалась от 100 до 270 °C со скоростью 20 °C в мин. Пробу объемом 3 мкл вводили в колонку с применением метода без деления потока газа-носителя. Масс-детектор работал в режиме электронного удара при 70 эВ. Масс-спектры, снятые с вершин хроматографических пиков, сравнивали по стандартной методике с масс-спектрами библиотек «NBS75K» и «WILEY» производства фирмы «Хьюлетт Паккард».

Вещество считалось идентифицированным при совпадении его масс-спектра с библиотечным со значением коэффициента подобия более 90% и совпадении его времени удерживания со временем удерживания стандарта идентифицированного вещества.

В результате проведенных исследований в смывах с ладоней рук, лица и шеи Филиппова М.В., а также во всех контрольных смывах следы наркотических средств не обнаружены (предел обнаружения метода составляет 10-9 г).

Комплексное исследование представленных образцов волос и ногтей с целью обнаружения в них следовых количеств наркотических средств проводили следующим образом:

а) исследование поверхности волос и ногтей на присутствие наркотических средств;

б) удаление посторонних примесей с поверхности представленных образцов;

в) исследование отмытых от посторонних примесей образцов.

Исследование поверхности волос и ногтей на присутствие наркотических средств

Представленные на исследование образцы волос и ногтей настаивали с этанолом в течение 4 ч. Затем спиртовые вытяжки фильтровали и упаривали досуха на роторном испарителе при 40 °C. Сухой остаток растворяли в 50 мкл этанола. В качестве контроля использовали смывы с образцов волос и ногтей лабораторного персонала, полученные аналогичным способом.

Далее исследовали полученные экстракты методами тонкослойной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии, как описано выше.

В результате проведенных исследований в смывах с поверхности волос и ногтей Филиппова М.В., а также во всех контрольных смывах следовые количества наркотических и сильнодействующих средств не обнаружены (предел обнаружения метода составляет 10-9 г).

Удаление посторонних примесей с поверхности волос и ногтей

Для удаления мешающих дальнейшему исследованию потожировых выделений и прочих загрязнений волосы и ногти промывались. При этом осуществляли приборный контроль за качеством проведения данной операции.

Волосы и ногти Филиппова М.В., а также контрольные волосы и ногти последовательно отмывали 2N раствором хлористоводородной кислоты и метанолом. Операция проводилась однократно. Отсутствие исследуемых веществ проверяли по описанной выше методике хромато-масс-спектрального исследования, за исключением того, что прибор работал в режиме регистрации характеристических ионов фенциклидина, метадона, героина, кокаина и трифторуксусных производных морфина (морфин-2ТФА) и 6-моноацетилморфина (6-МАМ-ТФА).

Получение трифторуксусных производных проводили по следующей методике: после удаления растворителя к сухому остатку экстракта добавляли 100 мкл ангидрида трифторуксусной кислоты и нагревали при 80 °C в течение 10 мин. После этого смесь охлаждали и упаривали в токе инертного газа. Сухой остаток растворяли в 50 мкл этилацетата. Время удерживания и характеристические ионы приведены в табл. 2.

Таблица 2

ВРЕМЯ УДЕРЖИВАНИЯ И ХАРАКТЕРИСТИЧЕСКИЕ ИОНЫ ИССЛЕДУЕМЫХ ВЕЩЕСТВ

По данной методике вещество считали идентифицированным при совпадении времени удерживания всех характеристических ионов и соотношения площадей их хроматографических пиков с аналогичными показателями стандартного образца.

Исследование отмытых от посторонних примесей волос и ногтей

Исследование следовых количеств наркотических средств в представленных образцах волос и ногтей, отмытых от посторонних примесей, проводили методом хромато-масс-спектрометрии после получения трифторуксусных производных некоторых из исследуемых веществ.

Отмытые от посторонних примесей волосы и ногти сушили при комнатной температуре и после этого разрушали в ступке пестиком с использованием битого стекла. Полученные гомогенаты настаивали при постоянном перемешивании и при повышенной температуре с метанолом в течение 6 ч. Метанольные вытяжки отделяли от образцов и упаривали досуха на роторном испарителе. Сухой остаток исследовали методом хромато-масс-спектрометрии после обработки трифторуксусным ангидридом, как описано выше. Результаты проведенных исследований приведены в табл. 3.

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ В ВОЛОСАХ И НОГТЯХ ФИЛИППОВА М.В.

Примечание: пропуск означает, что вещество не обнаружено.

Как следует из табл. 3, в отмытых от посторонних примесей образцах волос и ногтей Филиппова М.В. следовые количества наркотических средств: фенциклидин, метадон, кокаин, морфин и героин, а также 6-моноацетилморфин — не обнаружены. Предел обнаружения метода составляет 10-10 г.

Исследования по обнаружению следовых количеств других наркотических средств в отмытых от посторонних примесей образцах волос и ногтей не проводились ввиду отсутствия утвержденных методик их исследования.

Таким образом, в результате проведенных исследований на поверхности рук, лица и шеи, волос и ногтей, а также в отмытых от посторонних примесей образцах волос и ногтей Филиппова М.В. следовые количества наркотических средств: кокаин, метадон, морфин, фенциклидин, героин, а также 6-моноацетилморфин не обнаружены.

Объекты исследования израсходованы полностью.

Выводы

На поверхности рук, лица и шеи, волос и ногтей Филиппова М.В. следовые количества наркотических средств не обнаружены.

В отмытых от посторонних примесей образцах волос и ногтей Филиппова М.В. наркотические средства: фенциклидин, кокаин, метадон, морфин, героин, а также 6-моноацетилморфин — не обнаружены.

3. Оценка результатов

Предлагаемая экспертная методика позволяет дифференцировать потребителей наркотических средств (наркоманов), лиц, занимающихся распространением, сбытом и изготовлением наркотиков, а также лиц, имевших контакт с наркотическим средством.

При выявлении остаточных количеств наркотических средств на поверхности кожи, волос или ногтей и одновременном их отсутствии в отмытых от посторонних примесей волосах, ногтевых срезах указывает на факт контакта проверяемого лица с наркотическим средством. Случай выявления наркотических средств в отмытых от посторонних загрязнений волосах и ногтевых срезах может указывать на вероятность употребления наркотического средства этим лицом. Однако окончательная постановка такого диагноза остается за врачом-наркологом.

Установление продолжительности и интенсивности потребления наркотика является одним из важных достоинств данной методики и проводится методом секционного анализа. С этой целью пучки волос нарезаются на отдельные части длиной 10 мм и исследуются по разработанной экспертной методике. Получаемые результаты указывают на динамику потребления этого вещества.

Приложение

Рис. 2. Масс-спектр фенциклидина

Рис. 3. Масс-спектр метадона

Рис. 4. Масс-спектр кокаина

Рис. 5. Масс-спектр героина

Рис. 6. Масс-спектр морфина-2ТФА

Рис. 7. Масс-спектр кодеина-ТФА

Рис. 8. Масс-спектр 6-ацетилморфина-ТФА

Литература

1. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. М.: Мысль, 1993.

2. Симонов Е.А., Изотов Б.Н.//Вопросы наркологии, 1993. 4. С. 52 — 58.

3. Симонов Е.А., Изотов Б.Н.//Вопросы наркологии, 1994. 3. С. 48 — 52.

4. Камаев А.В., Алексеев М.Г., Симонов Е.А. и др.//Методические рекомендации. ЭКЦ МВД. М, 1997.