--- title: "\"Применение методов ионометрии и пламенной фотометрии для оценки питательных сред на содержание натрия, калия, кальция и хлора. Методические рекомендации\"" issuer: "Министерство здравоохранения РСФСР" status: утратил силу canonical: "https://bukva.ai/docs/primenenie-metodov-ionometrii-i-plamennoy" --- ## "Применение методов ионометрии и пламенной фотометрии для оценки питательных сред на содержание натрия, калия, кальция и хлора. Методические рекомендации" # "Применение методов ионометрии и пламенной фотометрии для оценки питательных сред на содержание натрия, калия, кальция и хлора. Методические рекомендации" (утв. Минздравом РСФСР 30.06.1988) > [!WARNING] > Документ утратил силу в связи с изданием Приказа Роспотребнадзора от 04.12.2020 N 797.
Утверждаю
Заместитель Министра
**В.Г.ПАНОВ**
30 июня 1988 года Согласовано
Заместитель Начальника
Главного управления
научных учреждений
**А.М.НАУМЕНКО**
30 июня 1988 года
**ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ ИОНОМЕТРИИ И ПЛАМЕННОЙ ФОТОМЕТРИИ** **ДЛЯ ОЦЕНКИ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД НА СОДЕРЖАНИЕ НАТРИЯ,** **КАЛИЯ, КАЛЬЦИЯ И ХЛОРА** **МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ** Методы ионометрии и пламенной фотометрии позволяют быстро и точно определить содержание ионов натрия, калия, кальция и хлора в питательных средах. Второй метод определяет содержание макроэлементов, находящихся и в недиссоциированном состоянии, выявляет в средах дополнительные источники этих элементов. При разработке питательных сред и их контроле необходимы сведения о минеральном составе питательных основ, отдельных ингредиентов ее, самих питательных сред. В действующих "Методических указаниях по применению физико-химических методов контроля питательных сред" МЗ СССР (М., 1977) приводится методика определения хлорида натрия. Настоящее дополнение составлено с целью расширения набора методик для аналитического контроля питательных сред, в частности, определения содержания отдельно натрия, калия, кальция, хлора. Определение этих элементов возможно с помощью методов потенциометрии с ионоселективными электродами и пламенной фотометрии. Применение этих методов в микробиологии мало освоено, в то время как они являются специфичными, информативными, простыми и доступными экспресс-методами. Настоящие дополнения к методическим указаниям по определению химического состава (ПС) обоснованы результатами сравнительного изучения описанных методов с известным, используемым для определения хлорида натрия в питательных средах с помощью азотнокислого серебра и роданида аммония, выявляющего общее содержание хлорид-ионов в растворе независимо от присутствия одного соединения хлора или нескольких с катионами натрия, калия, магния и др. Возможность применения ионометрии и пламенной фотометрии для определения ионов натрия, калия, хлора и кальция в питательных средах изучена на наборе широко применяемых сред на основе перевара мяса по Хоттингеру и образцах экспериментальных сред. Предлагаемые методики позволили определить присутствие ионов натрия, калия, хлора в средах и их компонентах, вести целенаправленное конструирование среды. С помощью этих двух методов получены количественные данные отдельно ионов натрия, калия, хлора, находящихся как в диссоциированном, так и в "связанном" состоянии. ## 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ НАТРИЯ И ХЛОРА МЕТОДОМ ИОНОМЕТРИИ Ионометрия - раздел потенциометрии, использующей в качестве аналитических детекторов ионоселективные электроды (ИСЭ). ИСЭ - представляют собой электрохимические полуэлементы, для которых разность потенциалов на границе раздела фаз "электрод-раствор" зависит от + концентрации определяемого иона в растворе. Катионочувствительные (Na ) стеклянные электроды селективны (по отношению к другим катионам), устойчивы в редокс-системах, на них не воздействуют белки, они индифферентны к анионам. Аниончувствительные электроды - индифферентны к катионам. Для определения концентрации ионов с помощью ИСЭ используют прямую потенциометрию в среде с высокой ионной силой (методы градуировочного графика и стандартных добавок) и потенциометрическое титрование. Техника измерения аналогична измерению pH: необходимы потенциометр (pH-метр) и электрод сравнения. ИСЭ выпускает ЗИП в г. Гомеле и НПО "Аналитприбор", г. Тбилиси. ### Определение ионов хлора и натрия методом двойной стандартной добавки Методика определения ионов хлора и натрия в сложных микробиологических питательных средах, содержащих высокие концентрации посторонних компонентов, основана на измерении потенциала селективного электрода до и после введения в анализируемый раствор двух идентичных порций (добавок) раствора с известной концентрацией определяемого иона. Анализ проводят с использованием натриевого (ЭСЛ-51Г-05) и хлоридного - (ЭМ-Cl 01) селективных электродов. Измерение сигнала индикаторного электрода проводят на потенциометре типа pH-121 и других типов относительно хлорсеребряного электрода сравнения (ЭВЛ-1МЗ), соединенного с исследуемым раствором посредством электролитического моста, заполненного 3% гелем агар-агара с 10% раствором KNO , при перемешивании раствора. Для 3 приготовления геля навески агар-агара (0,75 г) и KNO 2,5 г, помещают в 3 25 мл H O и смесь оставляют для набухания, затем при интенсивном 2 перемешивании доводят до кипения и горячий раствор заливают в трубку, избегая появления пузырьков воздуха. Постоянство ионной силы в системе осуществляется введением 2 М раствора нитрата аммония к исследуемому раствору (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся). + Определение ионов Na Подготовка электрода к работе. + Перед проведением серии анализов по определению ионов Na в питательных - средах Na - селективный электрод готовят к работе следующим образом: -1 1) выдерживают электрод в 10 М растворе NaCl в течение суток для приведения мембраны в рабочее состояние; 2) по точной навеске готовят исходный 1 М раствор NaCl (5,85 г в 100 мл), затем для калибровки электрода методом последовательного разбавления получают рабочие растворы следующих концентраций:
Таблица 1
**КАЛИБРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ НАТРИЕВОГО ЭЛЕКТРОДА**
| Конц. NaCl, М | -3 1 x 10 | -2 1 x 10 | -1 1 x 10 | 1,0 | | --- | --- | --- | --- | --- | | pNa = -lg a Na | 3,02 | 2,04 | 1,11 | 0,22 | Примечание: Таблица приведена из технического описания и инструкции по эксплуатации "pH-метр - милли-вольтметр pH-121". 3) в каждом из приготовленных растворов, начиная с более разбавленного, + измеряют значение потенциала индикаторного электрода (Na ) относительно электрода сравнения и строят график зависимости потенциала электрода (E) натрий ионов (pNa) в координатах E - pNa; 4) определяют наклон (S) графика, имеющего вид прямой линии, по E - E 1 2 соотношению S = -----------. Если S близко к теоретическому значению pNa - pNa 1 2 (59,16), то электрод пригоден к работе. Проверка работы электрода и построение градуировочного графика проводится один раз перед проведением серийных анализов образцов с близким содержанием определяемых компонентов. При постоянной эксплуатации электрода его характеристику достаточно проверять один раз в месяц по двум значениям концентраций в средней области градуировочного графика. При длительном хранении электрода подготовку его к работе необходимо начинать с "замачивания" мембраны. Градуировочный график необходим для приближенного определения содержания ионов в исследуемом образце, а также для выбора концентрации и величины вводимой добавки стандартного раствора. Ход анализа. Навеску сухой среды или точно измеренный объем исследуемой жидкой или растопленной агаризованной питательной среды разбавляют дважды перегнанной водой в мерной колбе, тщательно перемешивают. Размер навески и кратность разбавления H O в мерной колбе подбирается в зависимости от содержания 2 + ионов Na в исследуемом образце. В случае изучения агаризованной среды используют для разбавления подогретую воду до 45 - 50 °C. Пипеткой отбирают 5 мл полученного раствора, помещают в стаканчик, прибавляют равный объем 2 М NH NO , погружают Na-селективный электрод. 2 М раствора нитрата аммония 4 3 добавляют к раствору исследуемого образца в измерительной ячейке для поддержания постоянной ионной силы. Связь исследуемого раствора с раствором электрода сравнения осуществляют посредством электролитического моста. Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки. Отсчет значений потенциала E , мВ, по шкале прибора производят через 1 - 2 мин. после 1 погружения индикаторного электрода. Затем пипеткой вводят добавку V ст стандартного раствора C NaCl 1 М (чтобы изменением объема можно было ст пренебречь, вводимая добавка не должна превышать 0,5 мл, а концентрация добавляемого раствора должна быть на 2 порядка больше исследуемого). Фиксируют значение E , мВ, введение добавки стандартного раствора должно 2 вызвать изменение потенциала не менее, чем на 30 - 40 мВ. Затем вводят в исследуемый раствор вторую идентичную добавку и измеряют E , мВ. 3 Расчет содержания анализируемого иона проводят следующим образом: вычисляют разность значений потенциалов между первоначально измеренным и после введения каждой добавки: E - E ; E - E , находят их отношение: 1 2 1 3 E - E 1 3 R = -------; E - E 1 2 C х пользуясь [табл. 3](#p100060) определяют, какое значение A = -------- соответствует ДЕЛЬТА C вычисленному значению R; преобразуют выражения относительно C = A x ДЕЛЬТА C; х C x V ст ст подставляют ДЕЛЬТА C = ---------, V пробы C x V ст ст тогда C , Моль/л = A ---------, х V пробы где: C - концентрация стандартного раствора, используемого в виде добавки, ст моль/л; V - объем добавки, мл; ст V - объем пробы, взятой для анализа, мл. пробы Конечный результат в г/л определяют с учетом разбавления исходного образца: C x M x V х м.к C = ------------- x 1000 г/л иссл. V x 1000 иссл. или величины навески, растворенной в мерной колбе, C x M x V х м.к C = ------------- x 1000 г/л, иссл. a x 1000 где: V - объем мерной колбы, мл; м.к V - объем пробы, взятой для разбавления, мл; иссл. a - навеска образца, г; M - мольная масса определяемого иона (Na = 23,0 г); или в %: C x M x V х м.к C = ------------- x 100%. иссл. V x 1000 иссл. - Определение ионов Cl Подготовка электрода к работе. -3 1. Выдерживают хлорид-селективный электрод в 10 М растворе KCl в течение суток для приведения мембраны в рабочее состояние. 2. По точной навеске готовят исходный раствор KCl 1 М растворением 7,45 г реактива в мерной колбе емкостью 100 мл. 3. Последовательным разбавлением в мерной колбе емкостью 25 мл готовят серию калибровочных растворов KCl следующих концентраций:
Таблица 2
**КАЛИБРОВОЧНЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ ХЛОРИДНОГО ЭЛЕКТРОДА**
| Конц. KCl, М | -1 10 | -2 10 | -3 10 | -4 5 x 10 | -4 3 x 10 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | pCl = -lg a _ Cl | 1,11 | 2,04 | 3,02 | 3,30 | 3,50 | Примечание: Таблица приведена из паспорта электрода мембранного ЭМ-Cl-01.
Таблица 3
**РАСЧЕТ АНАЛИЗА ПО МЕТОДУ ДВОЙНЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК**
**(ПО ДАННЫМ ФИРМЫ "ORION") <*>**
--- <*> Таблица приведена из Камман К. (Cammann K.). В кн.: Работа с ионоселективными электродами. М., Мир., 1980. С. 264. | R | C x A = -------- ДЕЛЬТА C | R | C x A = -------- ДЕЛЬТА C | R | C x A = -------- ДЕЛЬТА C | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | 1,270 | 0,100 | 1,520 | 0,694 | 1,670 | 1,598 | | 1,280 | 0,113 | 1,525 | 0,714 | 1,675 | 1,643 | | 1,290 | 0,126 | 1,530 | 0,735 | 1,680 | 1,691 | | 1,300 | 0,140 | 1,535 | 0,756 | 1,685 | 1,738 | | 1,310 | 0,154 | 1,540 | 0,778 | 1,690 | 1,787 | | 1,320 | 0,170 | 1,545 | 0,801 | 1,695 | 1,840 | | 1,330 | 0,186 | 1,550 | 0,823 | 1,700 | 1,894 | | 1,340 | 0,203 | 1,555 | 0,847 | 1,705 | 1,948 | | 1,350 | 0,221 | 1,560 | 0,870 | 1,710 | 2,006 | | 1,360 | 0,240 | 1,565 | 0,896 | 1,715 | 2,066 | | 1,370 | 0,260 | 1,570 | 0,920 | 1,720 | 2,126 | | 1,380 | 0,280 | 1,575 | 0,946 | 1,725 | 2,190 | | 1,390 | 0,302 | 1,580 | 0,973 | 1,730 | 2,256 | | 1,400 | 0,325 | 1,585 | 1,000 | 1,735 | 2,326 | | 1,410 | 0,349 | 1,590 | 1,029 | 1,740 | 2,397 | | 1,420 | 0,373 | 1,595 | 1,056 | 1,745 | 2,470 | | 1,430 | 0,399 | 1,600 | 1,086 | 1,750 | 2,549 | | 1,440 | 0,427 | 1,605 | 1,116 | 1,755 | 2,629 | | 1,450 | 0,455 | 1,610 | 1,147 | 1,760 | 2,711 | | 1,460 | 0,485 | 1,615 | 1,179 | 1,765 | 2,801 | | 1,470 | 0,516 | 1,620 | 1,213 | 1,770 | 2,892 | | 1,475 | 0,532 | 1,625 | 1,245 | 1,775 | 2,985 | | 1,480 | 0,548 | 1,630 | 1,280 | 1,780 | 3,088 | | 1,485 | 0,565 | 1,635 | 1,315 | 1,785 | 3,193 | | 1,490 | 0,582 | 1,640 | 1,353 | 1,790 | 3,301 | | 1,495 | 0,600 | 1,645 | 1,391 | 1,795 | 3,416 | | 1,500 | 0,618 | 1,650 | 1,430 | 1,800 | 3,536 | | 1,505 | 0,637 | 1,655 | 1,469 | 1,805 | 3,664 | | 1,510 | 0,655 | 1,660 | 1,510 | 1,810 | 3,797 | | 1,515 | 0,675 | 1,665 | 1,554 | 1,815 | 3,939 | Калибровочные [таблицы 1](#p100021) и [2](#p100055) указывают область концентраций, в которой работает данный электрод. Таблицы дают конкретные значения концентраций калибровочных растворов, которые необходимы для проверки работы электродов. 4. В каждом из приготовленных растворов, начиная с более разбавленного, измеряют значение потенциала. Для этого калибровочный раствор помещают в стаканчик, погружают хлорид-селективный электрод. Электрод сравнения помещают в другой стаканчик с насыщенным раствором KNO . Оба раствора 3 соединяют электролитическим ключом, электроды подключают к клеммам измерительного прибора. 5. По значениям E, измеренным в растворах с различной концентрацией KCl, строят график зависимости E, мВ - pCl. Находят крутизну электродной E - E 1 2 характеристики S = -----------; если соблюдается прямолинейная зависимость pCl - pCl 1 2 E от pCl и значение S близко к теоретическому (59,16), электрод пригоден к работе. Ход анализа. - Методика проведения анализа по определению содержания Cl -ионной - аналогична описанной ранее. Молярная масса (М) определяемого иона Cl = 35,5 г. В качестве стандартного раствора используют 1 М KCl. Если образец сухой, то берется навеска среды и растворяется в мерной колбе определенного объема. Величина навески и кратность разбавления водой подбирается в каждом конкретном случае в зависимости от содержания ионов + - Na или Cl в образце. При этом руководствуются тем, что потенциал, измеренный в исследуемом растворе, должен лежать на среднем участке калибровочного графика. Работа в этой области чувствительности электрода дает наиболее точные результаты. В качестве примера приведем методики анализа жидкого образца (бульона) и сухой пробы питательной среды. - Анализ бульона на содержание Cl -ионов 1 мл пробы растворяем в мерной колбе емкостью 10 мл. Отбираем 5 мл, помещаем в стаканчик, прибавляем 5 мл 2 М NH NO , погружаем индикаторный 4 3 электрод. Исследуемый раствор соединяем с электродом сравнения посредством электролитического ключа. Электроды подключаем к клеммам прибора pH-121. Измеряем значение потенциала E . Делаем две идентичные добавки (V ) 1 ст стандартного C 1 М KCl по 0,3 мл, каждый раз измеряя значения потенциала ст E и E . 2 3 Результаты измерений заносим в таблицу: | V мл KCl 1 М | E, мВ | | --- | --- | | - 0,3 | 236 196 | | 0,3 | 179 | Производим вычисления: E - E = 236 - 196 = 40 мВ, 1 2 E - E = 236 - 179 = 57 мВ, 1 3 E - E 1 3 57 R = ------- = -- = 1,42. E - E 40 1 2 По [таблице 3](#p100060) находим, что R = 1,42 соответствует значение C х A = -------- = 0,373; подставляем значение ДЕЛЬТА C и решаем относительно: ДЕЛЬТА C C x V ст ст 1 x 0,3 C = A ---------; C = 0,373 x ------- = 0,011 моль/л. х V х 10 иссл. Учитывая разбавление исходной пробы (V ), выразим результат м.к - определения Cl ионов в г/л: C x M _ x V х Cl м.к 0,011 x 35,5 x 10 C = ---------------- = ----------------- = 3,9 г/л иссл. V 1 иссл. или в %: C x M _ x V х Cl м.к C = ---------------- x 100% = 0,39%. иссл. V x 1000 иссл. ### Анализ сухой пробы питательной среды Навеску пробы <*> 0,65 г растворяем в мерной колбе емкостью 10 мл. Отбираем 5 мл раствора, помещаем в стаканчик, прибавляем 5 мл 2 М NH NO . 4 3 Дальнейший ход анализа аналогичен описанному выше. --- <*> Навеску берут в соответствии с рецептурой из расчета на 100 мл изучаемой среды. Приводим результаты измерений: | V мл KCl 1 М | E, мВ | | --- | --- | | - 0,4 | 266 231 | | 0,4 | 216 | Производим вычисления: E - E = 266 - 231 = 35 мВ, 1 2 E - E = 266 - 216 = 50 мВ, 1 3 E - E 1 3 50 R = ------- = -- = 1,43. E - E 35 1 2 По [таблице 3](#p100060) находим, что R = 1,43 соответствует значение C х A = -------- = 0,399; подставляем значение ДЕЛЬТА C и решаем относительно: ДЕЛЬТА C C x V ст ст 1 x 0,4 C = A ---------; C = 0,399 x ------- = 0,016 моль/л. х V х 10 иссл. Учитывая величину навески (a, г) и объем колбы (V ), используемый для м.к - ее растворения, выразим результат определения Cl ионов в г/л: C x M _ x V х Cl м.к 0,016 x 35,5 x 10 C = ---------------- = ----------------- = 8,7 г/л иссл. a 0,65 или в %: C x M _ x V х Cl м.к 0,016 x 35,5 x 10 C = ---------------- x 100% = ----------------- x 100% = 0,87%. иссл. a x 1000 0,65 x 1000 ## 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАТРИЯ, КАЛИЯ И КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ ПЛАМЕННОЙ ФОТОМЕТРИИ Пламенная фотометрия является разновидностью эмиссионного спектрального анализа, широко применяется в клинических лабораториях для определения щелочных и щелочно-земельных металлов в биологических средах и тканях. Метод основан на измерении интенсивности излучения соответствующих элементов. Анализируемый раствор в виде мелких брызг (аэрозоля) с помощью распылителя вводят в пламя горелки. Излучение определяемого элемента отделяют посредством светофильтров (монохроматора) от других и направляют на фотоэлемент. Возникающий при этом фототок измеряют микроамперметром. Количественное определение натрия, калия и кальция в растворах проводят на пламенном фотометре - ФПЛ-1, функциональная схема которого представлена на рис. 2. Метод надежнее химического, особенно при определении малых концентраций и одновременном присутствии нескольких элементов. Нижний предел определения: а) натрия и калия - 0,5 мг/л, для кальция - 5,0 мг/л. Верхний предел всех элементов составляет 100 мг/л, расход анализируемого раствора до 5 мл/мин. Продолжительность измерения 30 секунд. Приборы и реактивы: пламенный фотометр ФПЛ-1, стандартные растворы калия, натрия и кальция, мерные колбы вместимостью 50 и 100, градуированные пипетки на 1,0 и 5,0 мл, испытуемые вещества, дистиллированная вода. В случае определения содержания элементов в сухих средах берут навеску в соответствии с рецептурой из расчета на 100 мл среды и разводят бидистиллированной водой. Агаризованные среды перед исследованием расплавляются, в случае необходимости могут дополнительно разводиться подогретой бидистиллированной водой (t 45 - 55 °C). а Анализируемый раствор в виде аэрозоля с помощью распылителя вводится в пламя горелки. Наилучшие показатели получаются при величине внутренних конусов пламени 3 - 4 мм и голубовато-зеленом их цвете (рис. 3). Прямая пропорциональность между интенсивностью спектральной линии и концентрацией анализируемого раствора наблюдается лишь при определенных концентрациях и зависит от природы спектральной линии и пламени. Возникающий фототок, регистрируемый микроамперметром, является функцией концентрации определяемого элемента. Для выделения спектральной линии измеряемого элемента применяются интерференционные светофильтры со следующими длинами волн в максимуме пропускания: для измерения эмиссии натрия, калия и кальция лямбда соответственно равно 589 +/- 5; 768 +/- 5 max и 622 +/- 5 нм.
Определение натрия, калия и кальция
Для каждого элемента готовится разбавлением исходного раствора дистиллированной водой серия стандартных растворов в мерных колбах вместимостью 50 мл. Исходный стандартный раствор NaCl и KCl содержит 200 мг/л натрия и 200 мг/л калия соответственно. Исходный стандартный раствор хлорида кальция содержит 1,0 г/л кальция. Эти растворы используются для приготовления пяти более разбавленных растворов (табл. 4).
Таблица 4
**ПРИГОТОВЛЕНИЕ СТАНДАРТНЫХ РАСТВОРОВ**
| Порядковые номера разведенных стандартных растворов Объем исходного стандартного раствора, мл Содержание натрия, калия, мг/л Содержание кальция, мг/л | 1 0,25 1 5 | 2 0,5 2 10 | 3 1,0 4 20 | 4 1,5 6 30 | 5 2,0 8 40 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | Фотометрирование начинают с раствора, имеющего наибольшую концентрацию, чтобы избежать отклонения стрелки микроамперметра за пределы шкалы. Затем последовательно переходят от меньшей концентрации к большей. По полученным данным строят график зависимости i = f(C), где i - сила фототока (мА), f - функция, (C) - концентрация (мг/л). Перед фотометрированием анализируемых растворов распылитель и газовую горелку тщательно промывают дистиллированной водой в течение 2 - 3 мин., анализируемые растворы фотометрируют и по графику i = f(C) находят искомые концентрации с учетом разбавления питательных сред. Методические дополнения составлены сотрудниками: Казанского химико-технологического института им. С.М. Кирова; Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии. ---