ОФС.1.8.2.0013.18. Общая фармакопейная статья. Определение содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах из плазмы крови человека

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Определение содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах из плазмы крови человека	ОФС Вводится впервые

Настоящая фармакопейная статья распространяется на метод определения содержания активатора прекалликреина в лекарственных препаратах альбумина человека и иммуноглобулинов человека для внутривенного ведения.

Метод определения содержания активатора прекалликреина основан на превращении прекалликреина в калликреин в присутствии активатора прекалликреина (АПК), образовавшийся калликреин способен отщеплять хромофор от синтетического хромогенного субстрата, количество которого прямо пропорционально содержанию АПК в образце. Образующийся хромофор определяют спектрофотометрическим методом.

Содержание АПК вычисляют путем сравнения со стандартным образцом (СО), калиброванным в международных единицах (МЕ). За международную единицу (МЕ) принята активность установленного количества международного СО. Эквивалентность международного СО в МЕ устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.

Оценка количественного содержания активатора прекалликреина в образце препарата крови может осуществляться двумя способами:

• по измерению скорости образования хромофора в реакционной смеси (скорости изменения окраски в минуту) — кинетический тест, Способ A;
• по измерению интенсивности окраски реакционной смеси после остановки реакции через оптимальный промежуток времени — тест по конечной точке, Способ B.

Допустимый предел содержания АПК для инфузионных лекарственных препаратов из плазмы крови человека составляет не более 35 МЕ/мл.

Кинетический тест (Способ A)

В лунки 96-ти луночного планшета с плоским дном вносят испытуемый образец и соответствующие разведения СО в трех повторностях. В лунки двух повторностей вносят раствор прекалликреина в соотношении не менее 9:1 от общего объема смеси, в лунку третьей повторности (холостая проба) — буферный раствор в количестве, равном объему раствора прекалликреина. Содержимое перемешивают и выдерживают при температуре 37 +/- 1 °C в течение необходимого времени в соответствии с указаниями в нормативной документации. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят рабочий раствор хромогенного субстрата, подогретый до температуры 37 +/- 1 °C, в количестве, не менее чем равном объему смеси образца с раствором прекалликреином в соответствии с указаниями в нормативной документации. Содержимое перемешивают, планшет устанавливают в анализатор/спектрофотометр и при температуре 37 +/- 1 °C регистрируют скорость изменения оптической плотности в мин (\Delta\text{А}/\text{мин}) в течение со 2-й по 10 мин при длине волны 405 нм.

Тест по конечной точке (Способ B)

В лунки 96-ти луночного планшета с плоским дном вносят испытуемый образец и соответствующие разведения СО в трех повторностях. В лунки двух повторностей вносят раствор прекалликреина в соотношении не менее 9:1 от общего объема смеси, в лунку третьей повторности (холостая проба) — буферный раствор в количестве, равном объему раствора прекалликреина. Содержимое перемешивают и выдерживают при температуре 37 +/- 1 °C в течение необходимого времени в соответствии с указаниями в нормативной документации. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят рабочий раствор хромогенного субстрата, подогретый до температуры 37 +/- 1 °C, в количестве, не менее чем равном объему смеси образца с раствором прекалликреином в соответствии с указаниями в нормативной документации. Содержимое перемешивают и выдерживают при температуре 37 +/- 1 °C в течение необходимого времени в соответствии с указаниями в нормативной документации. По окончании инкубации в лунки всех повторностей вносят стоп-реагент в соответствии с указаниями в нормативной документации, перемешивают и регистрируют оптическую плотность при длине волны 405 нм.

Для расчета активности АПК из значений двух повторов изменения оптической плотности в минуту в кинетическом тесте или значений оптической плотности в тесте по конечной точке вычитают соответствующие значения, полученные в холостых пробах. Вычисляют среднее значение изменения оптической плотности или оптической плотности для каждого образца. По результатам средних значений для разведений СО строят линейную калибровочную зависимость изменений оптической плотности или оптической плотности от концентрации СО, по которой вычисляют активность АПК в испытуемом образце.

Допустимо применение готовых наборов реагентов, содержащих все компоненты для хромогенного теста кинетического/по конечной точке в соответствии с фармакопейной методикой. При использовании набора должна быть проведена верификация фармакопейной методики.

Примечания

1. Приготовление буферного раствора 6,055 г трис(гидроксиметил)аминометана и 8,77 г натрия хлорида помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в воде очищенной, доводят pH до 7,95 — 8,05 2 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора водой очищенной до метки и вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 6 мес.

2. Приготовление раствора прекалликреина. Может быть применен как раствор прекалликреина, изготовленный в лабораторных условиях из плазмы крови доноров, так и раствор прекалликреина, приготовленный из готового реагента прекалликреина.

2.1 Приготовление раствора прекалликреина из плазмы крови доноров.

Приготовление буфера A.

6,055 г трис(гидроксиметил)аминометана, 1,17 г натрия хлорида, 50 мг гексадиметрин бромида и 10 мг натрия азида помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, растворяют в воде очищенной, доводят pH до 7,95 — 8,05 2 М раствором кислоты хлористоводородной, перемешивают, доводят объем раствора водой до метки и вновь перемешивают. Раствор хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 6 мес.

Аликвоту плазмы крови доноров диализуют против 10 объемов буфера A в течение 20 час. Отдиализованную плазму наносят на колонку ДЭАЭ-агарозы, уравновешенную буфером A, объем которой в 2 раза превышает объем плазмы. Проводят элюцию буфером A со скоростью 20 мл/см2/час. Собирают фракции первого пика, поглощающие при 280 нм. Полученный пул контролируют на отсутствие активности калликреина: аликвоту пула смешивают с предварительно подогретым рабочим раствором хромогенного субстрата в соотношении 1:20, инкубируют при 37 °C в течение 2 мин и определяют изменение оптической плотности в минуту (\Delta\text{А}/\text{мин}) при длине волны 405 нм. Полученный пул прекалликреина пригоден, если \Delta\text{А}/\text{мин} не превышает 0,001. К собранной фракции добавляют натрия хлорид из расчета 7 г/л, фильтруют через мембранный фильтр с порами 0,45 мкм, разделяют на аликвоты и хранят при температуре ниже минус 25 °C в течение 12 мес. Аликвоту после размораживания используют в течение рабочего дня.

2.2. Приготовление раствора прекалликреина из готового реагента прекалликреина проводят в соответствии с указаниями в инструкции по применению реагента, если иное не указано в нормативной документации.

3. Приготовление рабочего раствора синтетического хромогенного субстрата. 25 мг хромогенного субстрата (например, S-2302, H-D-пролил-L-фенилаланил-L-аргинина-p-нитроанилин дигидрохлорид) растворяют в буферном растворе до получения раствора с необходимой концентрацией в соответствии с указаниями в нормативной документации.

4. Подготовка испытуемого образца. Испытуемый препарат иммуноглобулина человека разводят буферным раствором до содержания белка 30 г/л. Необходимость разведения испытуемого препарата альбумина человека указывают в нормативной документации с учетом данных по валидации методики на основании предполагаемого содержания АПК и выбранного диапазона значений калибровочной кривой.

5. Подготовка СО. Подготовку СО осуществляют в соответствии с прилагаемой инструкцией по применению к СО. Готовят ряд разведений СО с использованием буферного раствора. Разведения и кратность их приготовления выбирают таким образом, чтобы зависимость регистрируемой скорости реакции (или оптической плотности) от концентрации АПК имела линейный характер.

---