--- title: "\"ОФС.1.8.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы\"" number: "ОФС.1.8.2.0009.15" issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-8-2-0009-15" --- ## "ОФС.1.8.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы" # "ОФС.1.8.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы" (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749) ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II") > [!IMPORTANT] > В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. > Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 01.06.2021 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.
**МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ | Определение однородности лекарственных препаратов из сыворотки крови человека и животных методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы | ОФС.1.8.2.0009.15 | | --- | --- | Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы, который предназначен для определения однородности (идентичности) иммунобиологических лекарственных препаратов (иммуноглобулинов). Метод основан на различной скорости перемещения белков в электрическом поле в зависимости от соотношения основных и кислотных групп белка, pH, ионной силы буферного раствора, величины заряда и молекулярной массы частиц. Белки движутся в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, движутся к аноду (+), а положительно заряженные - к катоду (-). По скорости движения в электрическом поле белки делятся на 5 основных фракций: альбумины, $\alpha 1 - \text{глобулины}$ , $\alpha 2 - \text{глобулины}$ , $\beta - \text{глобулины}$ и $\gamma - \text{глобулины}$ . Наименьшей скоростью продвижения обладают $\gamma - \text{глобулины}$ (молекулярная масса 150 - 160 тыс. кДа); они практически остаются на линии старта, т.к. их заряд близок к нейтральному. Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и меньшей молекулярной массой (67 - 70 тыс. кДа), поэтому в электрическом поле они движутся с наибольшей скоростью и в результате обнаруживаются дальше других белковых фракций от линии старта. С меньшей скоростью, чем альбумины, в электрическом поле перемещаются $\alpha 1 -$ , $\alpha 2 -$ и $\beta - \text{глобулины}$ . Электрофорез на пленках из ацетата целлюлозы На увлажненную пленку из ацетата целлюлозы размером 90x90 мм, заправленную в специальную рамку (трафарет), наносят 2 - 4 мкл исследуемых образцов (5 образцов в 2-х параллельных определениях) и для идентификации контрольный образец - сыворотку для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Определение проводят в 2-х параллельных определениях. Предварительно в электродные секции камеры (аппарат для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы) наливают барбиталовый буферный раствор (pH 8,4). Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой подходящий коммерческий буферный раствор с указанным значением pH. Рамку с пленкой из ацетата целлюлозы помещают в разделительную камеру прибора для электрофореза, закрывают крышкой, включают источник питания (сила тока 8 - 10 мА, напряжение 100 - 129 В). Разделение проводят в течение 30 - 40 мин. После проведения электрофореза снимают крышку разделительной камеры, не допуская попадания конденсационной воды на пленку. Рамку с пленкой извлекают из камеры, избегая контакта с участками, где происходил электрофорез испытуемых образцов. Пленку достают из рамки пинцетом и дают подсохнуть на воздухе. Затем пленку обрезают с обоих концов (около 2,5 мм), помещают в кювету с 50 мл раствора красителя и выдерживают в течение не более 5 мин (контакт с красителем в течение более длительного времени может деформировать пленку). Пленку вынимают из кюветы и после стекания избыточной жидкости помещают на 5 мин поочередно в 3 кюветы, со 100 мл отмывочной жидкости (для ускорения процесса отмывки кювету покачивают). После отмывки фон пленки должен приобрести бледно-голубое окрашивание или стать почти прозрачным. Далее пленку тщательно промывают водой, помещают между листами фильтровальной бумаги и слегка промокают. Идентификацию белковых фракций проводят путем сравнения электрофореграммы испытуемых образцов с электрофореграммой контрольной сыворотки для контроля качества электрофоретического разделения белковых фракций. Сыворотка должна разделиться не менее, чем на 5 фракций в следующей последовательности от линии старта: альбумин, $\alpha 1 -$ и $\alpha 2 - \text{глобулины}$ , $\beta - \text{глобулин}$ и $\gamma - \text{глобулин}$ . После проведения электрофореза проводят количественное определение фракций иммуноглобулина путем извлечения краски из пленки элюирующим раствором с последующим колориметрированием или путем денситометрии электрофореграмм. Количественное определение фракций иммуноглобулина Колориметрическое определение. Извлечение краски каждой фракции проводят в 3 мл элюирующего раствора с 2-х параллельных электрофореграмм. Элюцию проводят в течение 40 мин при многократном встряхивании. Оптическую плотность полученного элюата измеряют на спектрофотометре при длине волны 620 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по отношению к элюату неокрашенного участка электрофореграммы. Сумму оптических плотностей всех белковых фракций принимают за 100% и рассчитывают процентное содержание каждой фракции препарата иммуноглобулина. Денситометрическое определение. Электрофореграммы исследуемых образцов высушивают между листами фильтровальной бумаги в полиэтиленовом пакете (такие условия высушивания исключают деформацию пленки). Высушенные пленки просветляют вазелиновым маслом, пропитывая их таким образом, чтобы в пленке не остались пузырьки воздуха. Для этого пленку следует держать горизонтально и нижней поверхностью осторожно касаться масла. Избыток вазелинового масла удаляют, промокая пленку между листами фильтровальной бумаги. Фракции иммуноглобулина записываются денситометром в виде пиков. Величина площади каждого пика пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком. С помощью автоматического интегратора площадь каждого пика вычисляют по формуле площади прямоугольника (h·d, где h - максимальная высота пика, d - ширина пика). Сумма площадей всех пиков фракций иммуноглобулина принимается за 100% и вычисляется процентное содержание каждой фракции в испытуемом препарате иммуноглобулина. Примечания 1. Подготовка пленки из ацетата целлюлозы. Пленку смачивают в барбиталовом буферном растворе и гладкой стороной помещают в кювету на поверхность буферного раствора на 2 мин, а затем пинцетом погружают на дно кюветы и выдерживают 5 мин. После этого пленку вынимают пинцетом, избыток влаги удаляют между листами фильтровальной бумаги и заправляют в рамку, избегая неравномерного натяжения и провисания. 2. Подготовка испытуемых образцов. Испытуемые образцы предварительно обрабатывают 0,05% раствором красителя - бромфенолового синего, используемого для отслеживания продвижения и распределения белковых фракций препарата иммуноглобулина в процессе электрофореза. В пробирку типа Эппендорф помещают 100 мкл испытуемого образца и 10 мкл 0,05% раствора бромфенолового синего и перемешивают. Окрашенные испытуемые образцы в объеме 2 - 4 мкл помещают в каждую лунку лотка.
3. Приготовление барбиталового буферного раствора (pH 8,4) <*>. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 8,5 г натрия барбитала, растворяют в 600 - 700 мл воды очищенной, прибавляют 11 мл 1 М раствора хлористоводородной кислоты, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
---
<*> Вместо барбиталового буферного раствора можно использовать любой другой коммерческий буферный раствор с известным значением pH. 4. Приготовление 1 М раствора хлористоводородной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 85 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, доводят объем раствора до метки и перемешивают.
5. Приготовление красителя. К 0,5 г амидочерного 10 Б прибавляют 10 мл уксусной кислоты ледяной, 3 г трихлоруксусной кислоты и 90 мл этилового спирта и перемешивают. Для полного растворения краситель оставляют на 24 ч. Перед использованием раствор красителя перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр.
6. Приготовление раствора для отмывки электрофореграмм. В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл помещают 40 мл уксусной кислоты ледяной, прибавляют 700 мл воды очищенной и перемешивают. Затем объем раствора доводят водой очищенной до метки и вновь перемешивают.
7. Приготовление элюирующего раствора. Смешивают 10 мл 1 М раствора натрия гидроксида с 1 мл 1 М раствора натрия эдетата (трилон Б). Если условия проведения анализа и реагенты отличаются от приведенных в этой статье, они должны быть указаны в соответствующей фармакопейной статье или нормативной документации с изложением иной валидированной методики анализа.
---