---
title: "\"ОФС.1.8.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Иммуноэлектрофорез в агаровом геле\""
number: "ОФС.1.8.2.0002.15"
issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-8-2-0002-15"
---
## "ОФС.1.8.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Иммуноэлектрофорез в агаровом геле"
# "ОФС.1.8.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Иммуноэлектрофорез в агаровом геле"
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)
("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")
> [!IMPORTANT]
> В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018.
> Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.ph по состоянию на 01.06.2021.
**МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**
**ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ**
| Иммуноэлектрофорез в агаровом геле | ОФС.1.8.2.0002.15 |
| --- | --- |
Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для исследования антигенного состава биологических материалов, а также для определения чистоты, качественного и количественного состава биологических лекарственных препаратов (БЛП) методом иммуноэлектрофореза (ИЭФ) в агаровом геле, сочетающим методы зонального электрофореза и иммунодиффузию.
В процессе иммуноэлектрофореза в гелях или на пленках из ацетата целлюлозы с помощью методов простой или двойной иммунодиффузии происходит реакция между растворимыми белками и специфическими по отношению к ним преципитирующими антителами. Количественное определение белков можно осуществлять с помощью электрофореза в среде, содержащей антитела (электроиммуноанализ, электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Антигенную природу белковых компонентов можно исследовать путем их сравнения с известными маркерами.
Эффективность иммунохимических тестов зависит от специфичности используемых антисывороток, а также от их титра и сродства к антигенам.
Обычно иммуноэлектрофорез представляет собой сочетание электрофореза в агаровом (или агарозном) геле с последующей двойной иммунодиффузией в той же среде. При двухмерной двойной иммунодиффузии антиген и антитела, помещенные в круглые или прямоугольные углубления в геле, мигрируют навстречу друг другу, в результате, при встрече образуются линии (дуги) преципитации. Положение полос преципитации зависит от коэффициента диффузии антигена, его концентрации относительно антител (скорость диффузии антитела можно рассматривать как постоянную). Определенное соотношение концентраций антигена и антител, которое является оптимальным для образования преципитата, называется зоной эквивалентности. В результате, при этих условиях образуются четкие линии преципитации.
Концентрация (титр) антител в иммунной сыворотке также может значительно варьировать. Возможна ситуация, при которой зоны эквивалентности для разных компонентов смеси не будут перекрываться. Для подбора эквивалентного соотношения антиген-антитело иммуноэлектрофорез многокомпонентных смесей рекомендуется проводить при нескольких относительных концентрациях антиген-антитело, так как при использовании только одной такой концентрации можно не обнаружить те или иные компоненты.
Метод иммуноэлектрофореза в агаровом геле
Обработанную спиртом стеклянную пластину размером 90 x 120 мм помещают строго горизонтально на предметный столик. Охлажденный до температуры (45 +/- 5) °C агаровый гель наносят на стеклянную пластину в количестве 18,0 - 20,0 мл. После застывания при комнатной температуре через 20 - 30 мин на пластине образуется агаровый слой толщиной 2,0 - 2,5 мм.
После застывания геля в нем по специальному трафарету вырезают 6 - 7 лунок диаметром 1 - 2 мм. Лунки заполняют испытуемым образцом в объеме, не превышающем объем лунки (по 2 лунки на каждый испытуемый образец). При этом в верхнюю и нижнюю лунки стеклянной пластинки с гелем вносят контрольный образец - нормальную сыворотку крови человека ("Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза" или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), окрашенный пиронином Б или иным красителем, указанным в фармакопейной статье или в нормативной документации.
В мерный цилиндр вместимостью 1000 мл вносят 500 мл веронал-мединалового или боратного буферного раствора, доводят объем раствора до метки водой очищенной и перемешивают. Полученный раствор (или иной буферный раствор, указанный в фармакопейной статье или нормативной документации) наливают в электродные секции камеры прибора для электрофореза.
Пластину с подготовленным гелем помещают в прибор для электрофореза и соединяют с буферным раствором в электродных камерах прибора с помощью нескольких слоев фильтровальной бумаги. В случае конструкции прибора для электрофореза, предусматривающей соединение агара на пластине с электродным буфером с помощью агаровых столбиков, пластину устанавливают в уравновешенный прибор и заливают расплавленным агаром до его соединения с агаровыми столбиками и образования слоя геля толщиной 1 - 2 мм.
Прибор для электрофореза накрывают крышкой и включают источник питания (напряжение 70 - 200 В, сила тока 10 - 40 мА). Электрофорез проводят в течение 1,5 - 3 ч до момента, когда пятно пиронина Б, соответствующее миграции альбумина, будет находиться на расстоянии 20 - 25 мм от лунки.
После проведения электрофореза с помощью специального трафарета между лунками в агаровом геле вырезают продольные "канавки" (параллельные направлению миграции). В "канавки" вносят по 0,25 мл преципитирующей антисыворотки: против белков сыворотки крови человека (при проведении испытаний фракционного состава) или поливалентную сыворотку против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи (для подтверждения подлинности).
Пластину с агаровым гелем помещают во влажную камеру и выдерживают при температуре (5 +/- 3) °C в течение 24 - 48 ч.
Для отмывания белков, не вступивших в реакцию преципитации, пластину с агаром помещают в кюветы, заливают 0,9% раствором натрия хлорида и выдерживают в течение 16 - 18 ч при комнатной температуре. За указанный период времени раствор меняют 3 - 4 раза. Затем пластину извлекают из 0,9% раствора натрия хлорида, накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в 0,9% растворе натрия хлорида, не оставляя пузырьков воздуха и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °C. После высушивания пластины фильтровальную бумагу смачивают водой и аккуратно удаляют.
Для окрашивания белков используют краситель амидочерный 10Б или другой пригодный краситель (в соответствии с указаниями в фармакопейной статье или нормативной документации), помещая пластину в кювету с красящим раствором на 30 - 40 мин. Затем пластину промывают несколько раз в растворе для отмывания агара (2% раствор уксусной кислоты или иной раствор, в соответствии с указаниями в нормативной документации) в течение 15 - 40 мин до полного отсутствия окрашенного фона и снова высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу при температуре не выше 40 °C.
Липопротеиды окрашивают суданом черным В. Для окрашивания полностью высушенные пластины помещают на 3 ч в красящий раствор, затем обесцвечивают 50% этанолом до полного просветления фона. Липопротеиды окрашиваются в темно-синий цвет. Следует проводить окрашивание полностью высушенного препарата, так как судан черный В нерастворим в воде и окрашивает влажный гель.
Учет результатов при исследовании фракционного состава препаратов иммуноглобулинов человека проводят визуально путем сравнения электрофореграммы испытуемого образца с электрофореграммой контрольного образца - нормальной сыворотки крови человека ("Стандартный образец тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза" или иной контрольный образец в соответствии с указаниями в нормативной документации), которая должна проявлять регламентированное количество линий преципитации с сывороткой против белков сыворотки крови человека (не менее 15 линий преципитации при использовании "Стандартного образца тест-системы для определения фракционного (антигенного) состава препаратов из сыворотки крови человека методом иммуноэлектрофореза"). Основной компонент препарата иммуноглобулинов человека должен соответствовать иммуноглобулину G (Ig G) нормальной сыворотки крови человека.
Учет результатов при проведении исследований по подтверждению подлинности препаратов крови человека проводят визуально путем выявления линий преципитации с сывороткой против белков сыворотки крови человека, крупного рогатого скота, лошади и свиньи. Должны выявляться линии преципитации только с сывороткой против белков сыворотки крови человека.
Примечания
1. Приготовление 0,05М веронал-мединалового буферного раствора (pH 8,6 +/- 0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,38 г веронала, 8,76 г мединала, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают до полного растворения.
2. Приготовление 0,05М боратного буферного раствора (pH 8,6 +/- 0,1). В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 6,7 г борной кислоты, 13,4 г натрия тетраборнокислого 10-водного, добавляют воды очищенной до метки и перемешивают.
3. Приготовление 1,25% агарового геля. Приготовление агарового геля осуществляют одним из следующих способов:
a) Для приготовления 1,25% агарового геля используют 0,05М веронал-мединаловый буфер (pH 8,6 +/- 0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно, 2,76 г веронала и 17,52 г мединала на 1000 мл воды очищенной).
b) Для приготовления 1,25% агарового геля используют боратный буферный раствор (pH 8,6 +/- 0,1) с удвоенной концентрацией солей (соответственно: 13,4 г борной кислоты и 26,8 г натрия тетраборнокислого 10-водного на 1000 мл воды очищенной).
В химический стакан вместимостью 1000 мл вносят 12,5 г агара, добавляют 500 мл воды очищенной и оставляют для набухания геля в течение часа при температуре (20 +/- 1) °C. Стакан с содержимым помещают в кипящую водяную баню и выдерживают до полного расплавления агара. Объем раствора геля доводят водой до 500 мл, затем добавляют равный объем веронал-мединалового или боратного буферного раствора (или иного буферного раствора, указанного в фармакопейной статье или в нормативной документации). Раствор агара фильтруют через 2 - 3 слоя марли, прибавляют тиомерсал до концентрации 100 мкг/мл и разливают во флаконы по 40 - 50 мл (количество, необходимое на две пластинки). Расплавленный агар должен быть прозрачным.
4. Приготовление красящего раствора амидочерного 10Б. Приготовление раствора красителя осуществляют одним из следующих способов:
a) В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 450 мл 0,1М раствора уксусной кислоты, 550 мл 0,1М раствора натрия ацетата и перемешивают.
b) В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,0 г амидочерного 10Б, 100 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем до метки водой очищенной и перемешивают. Через 12 ч фильтруют через бумажный фильтр.
5. Приготовление красящего раствора судан черный В. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 1,2 г судана черного В, 20 мл 1М раствора натрия гидроксида, 380 мл воды очищенной и доводят объем раствора этанолом абсолютным до метки и перемешивают. Смесь непродолжительное время кипятят, охлаждают до комнатной температуры и после остывания краситель переливают в темную склянку с притертой пробкой. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.
6. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты для отмывки агара. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 20,0 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Реактив хранят при комнатной температуре в течение 3 мес.
---