---
title: "\"ОФС.1.7.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности пробиотиков\""
number: "ОФС.1.7.2.0009.15"
issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-7-2-0009-15"
---

## "ОФС.1.7.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности пробиотиков"

# "ОФС.1.7.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности пробиотиков"

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)

("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II")

> [!IMPORTANT]
> В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018.
> Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.05.2021 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.


<a id="p100001"></a>**МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100002"></a>**ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ**


| <a id="p100003"></a>Определение специфической активности пробиотиков | <a id="p100004"></a>ОФС.1.7.2.0009.15 |
| --- | --- |


<a id="p100005"></a>Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам.
<a id="p100006"></a>Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма:
- <a id="p100007"></a>количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе <1> иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) [(раздел 1)](#p100265);
- <a id="p100008"></a>активность кислотообразования [(раздел 2)](#p100339);
- <a id="p100009"></a>антагонистическая активность [(раздел 3)](#p100373).


## <a id="p100010"></a>ОБЩАЯ ЧАСТЬ


<a id="p100011"></a>Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата. Контроль испытуемого препарата по показателю "Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства" является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза - доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)).
<a id="p100012"></a>При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата.
<a id="p100013"></a>Показатель "Активность кислотообразования" является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности.
<a id="p100014"></a>Показатель "Антагонистическая активность" является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.
<a id="p100015"></a>Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.


### <a id="p100016"></a>Питательные среды, используемые в испытаниях


<a id="p100017"></a>Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации):
- <a id="p100018"></a>для лактобактерий - МРС-2, МРС-4, МРС-5, МРС-1; для ацидофильных лактобактерий - стерильное обезжиренное молоко;
- <a id="p100019"></a>для бифидобактерий - полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5;
- <a id="p100020"></a>для кишечной палочки - среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе N 2 агаризованную;
- <a id="p100021"></a>для энтерококков - МПА, среду N 1;
- <a id="p100022"></a>для бактерии рода Bacillus - среду Гаузе N 2 агаризованную, МПА, полу синтетическую среду с дрожжевым диализатом.
<a id="p100023"></a>Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение pH питательных сред устанавливают при температуре (25 +/- 2) °C.
<a id="p100024"></a>Среда МРС-1
<a id="p100025"></a>В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:


| <a id="p100026"></a>- марганец сернокислый | <a id="p100027"></a>0,05 г |
| --- | --- |
| <a id="p100028"></a>- цистеин солянокислый или L-цистин | <a id="p100029"></a>0,10 г |
| <a id="p100030"></a>- магний сернокислый | <a id="p100031"></a>0,200 г |
| <a id="p100032"></a>- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | <a id="p100033"></a>2,00 г |
| <a id="p100034"></a>- аммония цитрат | <a id="p100035"></a>2,00 г |
| <a id="p100036"></a>- натрия ацетат (натрий уксуснокислый) | <a id="p100037"></a>5,00 г |
| <a id="p100038"></a>- печеночный экстракт [<а>](#p100052) (1:1) | <a id="p100039"></a>100,0 мл |
| <a id="p100040"></a>- дрожжевой аутолизат [<б>](#p100059) с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)% | <a id="p100041"></a>50,0 мл |
| <a id="p100042"></a>- пептон сухой ферментативный | <a id="p100043"></a>10,00 г |
| <a id="p100044"></a>- гидролизат обезжиренного молока [<в>](#p100067) | <a id="p100045"></a>500,0 мл |
| <a id="p100046"></a>- полисорбат 80 | <a id="p100047"></a>1,00 мл |
| <a id="p100048"></a>- глюкоза | <a id="p100049"></a>20,00 г |


<a id="p100050"></a>Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; pH среды (6,4 +/- 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100051"></a>Примечание
<a id="p100052"></a><а> Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота (0,050 +/- 0,005)%.


| <a id="p100053"></a>- Печень говяжья | <a id="p100054"></a>1,0 кг |
| --- | --- |
| <a id="p100055"></a>- Вода очищенная | <a id="p100056"></a>1000 мл |


<a id="p100057"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
<a id="p100058"></a>Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 - 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 120 +/- 2 °C в течение 15 +/- 1 мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8 °C не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.
<a id="p100059"></a><б> Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)%.


| <a id="p100060"></a>- Дрожжи хлебопекарные | <a id="p100061"></a>1000 г |
| --- | --- |
| <a id="p100062"></a>- Вода питьевая | <a id="p100063"></a>4000 мл |
| <a id="p100064"></a>- Хлороформ | <a id="p100065"></a>40 мл |


<a id="p100066"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин.
<a id="p100067"></a><в> Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.


| <a id="p100068"></a>- Молоко коровье пастеризованное, нежирное (pH 6,7 +/- 0,1) | <a id="p100069"></a>1000 мл |
| --- | --- |
| <a id="p100070"></a>- Панкреатин | <a id="p100071"></a>1,0 г |
| <a id="p100072"></a>- Хлороформ | <a id="p100073"></a>5,0 мл |


<a id="p100074"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин.

<a id="p100075"></a>Среда МРС-2


| <a id="p100076"></a>- Марганец сернокислый | <a id="p100077"></a>0,05 г |
| --- | --- |
| <a id="p100078"></a>- Цистеин солянокислый или L-цистин | <a id="p100079"></a>0,10 г |
| <a id="p100080"></a>- Магний сернокислый | <a id="p100081"></a>0,20 г |
| <a id="p100082"></a>- Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | <a id="p100083"></a>2,00 г |
| <a id="p100084"></a>- Аммония цитрат | <a id="p100085"></a>2,00 г |
| <a id="p100086"></a>- Натрия ацетат | <a id="p100087"></a>5,00 г |
| <a id="p100088"></a>- Печеночный экстракт (1:1) | <a id="p100089"></a>100,0 мл |
| <a id="p100090"></a>- Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)% | <a id="p100091"></a>50,0 мл |
| <a id="p100092"></a>- Пептон сухой ферментативный | <a id="p100093"></a>10,00 г |
| <a id="p100094"></a>- Гидролизат обезжиренного молока | <a id="p100095"></a>500,0 мл |
| <a id="p100096"></a>- Полисорбат 80 | <a id="p100097"></a>1,00 мл |
| <a id="p100098"></a>- Глюкоза | <a id="p100099"></a>20,00 г |
| <a id="p100100"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100101"></a>1,00 г |
| <a id="p100102"></a>- Вода очищенная | <a id="p100103"></a>до 1000 мл |


<a id="p100104"></a>Значение pH готовой среды (6,4 +/- 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100105"></a>Среда МРС-4
<a id="p100106"></a>В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:


| <a id="p100107"></a>- Марганец сернокислый | <a id="p100108"></a>0,05 г |
| --- | --- |
| <a id="p100109"></a>- Цистеин солянокислый или L-цистин | <a id="p100110"></a>0,10 г |
| <a id="p100111"></a>- Магний сернокислый | <a id="p100112"></a>0,200 г |
| <a id="p100113"></a>- Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | <a id="p100114"></a>2,00 г |
| <a id="p100115"></a>- Аммония цитрат | <a id="p100116"></a>2,00 г |
| <a id="p100117"></a>- Натрия ацетат | <a id="p100118"></a>5,00 г |
| <a id="p100119"></a>- Печеночный экстракт (1:1) | <a id="p100120"></a>100,0 мл |
| <a id="p100121"></a>- Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)% | <a id="p100122"></a>50,0 мл |
| <a id="p100123"></a>- Пептон сухой ферментативный | <a id="p100124"></a>10,00 г |
| <a id="p100125"></a>- Гидролизат обезжиренного молока | <a id="p100126"></a>500,0 мл |
| <a id="p100127"></a>- Полисорбат 80 | <a id="p100128"></a>1,00 мл |
| <a id="p100129"></a>- Глюкоза | <a id="p100130"></a>20,00 г |
| <a id="p100131"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100132"></a>19,0 г |


<a id="p100133"></a>Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (pH 6,4 +/- 0,2). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100134"></a>Среда МРС-5


| <a id="p100135"></a>- Марганец сернокислый | <a id="p100136"></a>0,05 г |
| --- | --- |
| <a id="p100137"></a>- Цистеин солянокислый или L-цистин | <a id="p100138"></a>0,10 г |
| <a id="p100139"></a>- Магний сернокислый | <a id="p100140"></a>0,200 г |
| <a id="p100141"></a>- Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | <a id="p100142"></a>2,00 г |
| <a id="p100143"></a>- Печеночный экстракт (1:1) | <a id="p100144"></a>100,0 мл |
| <a id="p100145"></a>- Дрожжевой аутолизат с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)% | <a id="p100146"></a>50,0 мл |
| <a id="p100147"></a>- Пептон сухой ферментативный | <a id="p100148"></a>10,00 г |
| <a id="p100149"></a>- Гидролизат обезжиренного молока | <a id="p100150"></a>500,0 мл |
| <a id="p100151"></a>- Полисорбат 80 | <a id="p100152"></a>1,00 мл |
| <a id="p100153"></a>- Глюкоза | <a id="p100154"></a>20,00 г |
| <a id="p100155"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100156"></a>15,0 г |
| <a id="p100157"></a>- Вода очищенная | <a id="p100158"></a>до 1000 мл. |


<a id="p100159"></a>Питательную среду (pH 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100160"></a>Примечание
<a id="p100161"></a>Приготовление обезжиренного стерильного молока pH (6,7 +/- 0,3);
<a id="p100162"></a>показатель кислотности не более 18 °Т:


| <a id="p100163"></a>- Молоко сухое обезжиренное | <a id="p100164"></a>80 г |
| --- | --- |
| <a id="p100165"></a>- Вода очищенная | <a id="p100166"></a>до 1000 мл |


<a id="p100167"></a>Разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.

<a id="p100168"></a>Модифицированная печеночная среда Блаурокка


| <a id="p100169"></a>- Печеночная вода (1:2) с содержанием аминного азота (100 +/- 20) мг% | <a id="p100170"></a>1000 мл |
| --- | --- |
| <a id="p100171"></a>- Пептон сухой | <a id="p100172"></a>10 г |
| <a id="p100173"></a>- Натрия хлорид | <a id="p100174"></a>5 г |
| <a id="p100175"></a>- Лактоза | <a id="p100176"></a>10 г |
| <a id="p100177"></a>- Цистеин | <a id="p100178"></a>0,1 г |
| <a id="p100179"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100180"></a>0,75 г |


<a id="p100181"></a>Устанавливают требуемое значение pH (7,2 +/- 0,2) с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (60 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C. После 14 сут хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70 - 80 °C в течение 10 - 15 мин.
<a id="p100182"></a>Примечание
<a id="p100183"></a>Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота (100 +/- 20) мг %.


| <a id="p100184"></a>- Печень говяжья | <a id="p100185"></a>0,5 кг |
| --- | --- |
| <a id="p100186"></a>- Вода очищенная | <a id="p100187"></a>1000 мл |


<a id="p100188"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
<a id="p100189"></a>0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 - 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань "миткаль"), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения - не более 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.

<a id="p100190"></a>Среда Блаурокка с азидом натрия


| <a id="p100191"></a>- Среда Блаурокка | <a id="p100192"></a>1000 мл |
| --- | --- |
| <a id="p100193"></a>- Натрия азид | <a id="p100194"></a>0,1 г |


<a id="p100195"></a>Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 1 мес при температуре от 2 до 8 °C.
<a id="p100196"></a>Среда Гаузе N 2 агаризованная


| <a id="p100197"></a>- Бульон Хоттингера <1> с содержанием аминного азота 700 мг% | <a id="p100198"></a>30 мл |
| --- | --- |
| <a id="p100199"></a>- Пептон сухой | <a id="p100200"></a>5 г |
| <a id="p100201"></a>- Натрия хлорид | <a id="p100202"></a>5 г |
| <a id="p100203"></a>- Глюкоза | <a id="p100204"></a>10 г |
| <a id="p100205"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100206"></a>30 г |
| <a id="p100207"></a>- Вода очищенная | <a id="p100208"></a>до 1000 мл |


<a id="p100209"></a>Примечание
<a id="p100210"></a>Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг%).


| <a id="p100211"></a>- Гидролизат Хоттингера | <a id="p100212"></a>24,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100213"></a>- Натрия хлорид | <a id="p100214"></a>5,0 г |
| <a id="p100215"></a>- Вода очищенная | <a id="p100216"></a>до 1000 мл |


<a id="p100217"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).

<a id="p100218"></a>Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная


| <a id="p100219"></a>- Марганец хлористый 4-водный или марганец сернокислый | <a id="p100220"></a>0,01 г |
| --- | --- |
| <a id="p100221"></a>- Железо(III) сернокислое 7-водное | <a id="p100222"></a>0,01 г |
| <a id="p100223"></a>- Магний сернокислый 7-водный или магния хлорид 6-водный | <a id="p100224"></a>0,1 г |
| <a id="p100225"></a>- Кальция хлорид | <a id="p100226"></a>0,08 г |
| <a id="p100227"></a>- Пептон сухой | <a id="p100228"></a>0,5 г |
| <a id="p100229"></a>- Дрожжевой диализат с содержанием азота аминного 150 мг % | <a id="p100230"></a>5,0 мл |
| <a id="p100231"></a>- Глюкоза | <a id="p100232"></a>10,0 г |
| <a id="p100233"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100234"></a>20 - 30 г |
| <a id="p100235"></a>- Вода очищенная | <a id="p100236"></a>до 1000 мл. |


<a id="p100237"></a>Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).
<a id="p100238"></a>Мясопептонный агар (МПА)


| <a id="p100239"></a>- Пептон | <a id="p100240"></a>10,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100241"></a>- Натрия хлорид | <a id="p100242"></a>5,0 г |
| <a id="p100243"></a>- Мясная вода | <a id="p100244"></a>300 - 500 мл |
| <a id="p100245"></a>- Агар микробиологический | <a id="p100246"></a>13 - 20 г |


<a id="p100247"></a>В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2 - 7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при температуре 120 °C в течение (20 +/- 1) мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.
<a id="p100248"></a>Срок хранения готовой среды (pH 7,3 +/- 0,2) 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100249"></a>Мясопептонный бульон (МПБ)


| <a id="p100250"></a>- Пептон | <a id="p100251"></a>10,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100252"></a>- Натрия хлорид | <a id="p100253"></a>5,0 г |
| <a id="p100254"></a>- Мясная вода | <a id="p100255"></a>1000 мл. |


<a id="p100256"></a>В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2 - 7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120 °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<a id="p100257"></a>Примечание
<a id="p100258"></a>Приготовление мясной воды (1:2).


| <a id="p100259"></a>- Мясо-говядина (фарш) | <a id="p100260"></a>500 г |
| --- | --- |
| <a id="p100261"></a>- Вода очищенная | <a id="p100262"></a>1000 мл |


<a id="p100263"></a>Стерилизация при температуре 121 °C в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес при температуре от 2 до 8 °C и не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.

<a id="p100264"></a>Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10 - 15 или 20 - 25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45 °C) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.


## <a id="p100265"></a>Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе ИЛП


<a id="p100266"></a>В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).

### <a id="p100267"></a>Отбор и подготовка образцов для анализа

<a id="p100268"></a>От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца.
<a id="p100269"></a>Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
<a id="p100270"></a>Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз.
<a id="p100271"></a>Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. <a id="p100272"></a>Лиофилизаты (флаконы) - каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз, получая исходное разведение.
2. <a id="p100273"></a>Порошки - содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение 1:100 (10-2).
3. <a id="p100274"></a>Таблетки - каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз, получая исходное разведение.
4. <a id="p100275"></a>Капсулы - каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 - 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1).
5. <a id="p100276"></a>Суппозитории - каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры (37 +/- 1) °C стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 2 г - 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 - 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1).
<a id="p100277"></a>Методика испытания
<a id="p100278"></a>Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 10-1 или 10-2) вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10 - 15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-2 или 10-3), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
<a id="p100279"></a>В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10 - 15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-1) и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 10-2. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
<a id="p100280"></a>В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.

### 1. <a id="p100281"></a>Высев на плотные питательные среды


#### <a id="p100282"></a>1.1 Метод Коха

<a id="p100283"></a>В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.
<a id="p100284"></a>Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 - 96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.
<a id="p100285"></a>Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.

#### <a id="p100286"></a>1.2. Глубинный чашечный метод

<a id="p100287"></a>В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20 - 25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 +/- 2,5 °C агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37 +/- 1) °C в течение необходимого для данного микроорганизма времени.
<a id="p100288"></a>Учет результатов
<a id="p100289"></a>По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.
<a id="p100290"></a>*Пример* расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:
- <a id="p100291"></a>из разведения 10-7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42 + 45) : 2 = 43,5;
- <a id="p100292"></a>из разведения 10-6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410 + 450) : 2 = 430;
- <a id="p100293"></a>количество живых бактерий в 1 дозе равно:
<a id="p100294"></a>(43,5·107 + 430·106) : 2 10 = 4325000000 = 4,3·109.
<a id="p100295"></a>Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.

### 2. <a id="p100296"></a>Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды


#### <a id="p100297"></a>2.1. Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)

<a id="p100298"></a>В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38 +/- 1) °C в течение 3 - 4 сут.
<a id="p100299"></a>По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.
<a id="p100300"></a>Учет результатов
<a id="p100301"></a>При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди [(табл. 1)](#p100306). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10-6).
<a id="p100302"></a>Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10-7 и в 1 пробирке разведения 10-8).
<a id="p100303"></a>Числовая характеристика результата будет 211.
<a id="p100304"></a>По [таблице](#p100306) Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере - 10-6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13·106 = 1,3·107.

<a id="p100305"></a>Таблица 1

<a id="p100306"></a>Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества
живых ацидофильных лактобактерий


| <a id="p100307"></a>Числовая характеристика | <a id="p100308"></a>Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки |
| --- | --- |
| <a id="p100309"></a>200 | <a id="p100310"></a>2,5 |
| <a id="p100311"></a>201 | <a id="p100312"></a>5,0 |
| <a id="p100313"></a>202 | <a id="p100314"></a>- |
| <a id="p100315"></a>210 | <a id="p100316"></a>6,0 |
| <a id="p100317"></a>211 | <a id="p100318"></a>13,0 |
| <a id="p100319"></a>212 | <a id="p100320"></a>20,0 |
| <a id="p100321"></a>220 | <a id="p100322"></a>25,0 |
| <a id="p100323"></a>221 | <a id="p100324"></a>70,0 |



#### <a id="p100325"></a>2.2. Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде

<a id="p100326"></a>Из разведений препарата 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в питательной полужидкой среде.
<a id="p100327"></a>Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в зависимости от вида микроорганизма в течение 1 - 6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.
<a id="p100328"></a>Учет результатов
<a id="p100329"></a>В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.
<a id="p100330"></a>Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).

### 3. <a id="p100331"></a>Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках


#### <a id="p100332"></a>3.1 Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий)

<a id="p100333"></a>Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9% растворе натрия хлорида (с 10-1 по 10-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).
<a id="p100334"></a>Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре (38 +/- 1) °C в течение 4 - 5 сут.
<a id="p100335"></a>Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10-5, 10-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 24 ч.
<a id="p100336"></a>Учет результатов
<a id="p100337"></a>В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде "гвоздиков". Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.
<a id="p100338"></a>На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в [подразделе 1](#p100281).


## <a id="p100339"></a>Раздел 2. Активность кислотообразования


<a id="p100340"></a>Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.
<a id="p100341"></a>Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий - МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.
<a id="p100342"></a>Реактивы, используемые в испытании:
- <a id="p100343"></a>титрованный 0,1 М раствор натрия гидроксида;
- <a id="p100344"></a>индикатор - 1% раствор фенолфталеин.
<a id="p100345"></a>Особенности отбора и подготовки образцов для анализа
<a id="p100346"></a>От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория.
<a id="p100347"></a>Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
<a id="p100348"></a>Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. <a id="p100349"></a>Лиофилизаты - испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз.
<a id="p100350"></a>По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
2. <a id="p100351"></a>Таблетки - каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз.
<a id="p100352"></a>По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
3. <a id="p100353"></a>Порошки - содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
4. <a id="p100354"></a>Капсулы - каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 20 - 30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
5. <a id="p100355"></a>Суппозитории - каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 20 - 30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 - 72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма).
<a id="p100356"></a>Примечание
<a id="p100357"></a>После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов:
- <a id="p100358"></a>сразу после окончания инкубирования при температуре посевов (38 +/- 1) °C стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;
- <a id="p100359"></a>пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8 °C в течение (20 +/- 5) мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.

<a id="p100360"></a>Методика испытания
<a id="p100361"></a>Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов. После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8 - 10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.
<a id="p100362"></a>Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10 - 12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2 - 3 капли 1% раствора фенолфталеина.
<a id="p100363"></a>Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения pH (8,5 +/- 0,1) (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.
<a id="p100364"></a>Учет результатов
<a id="p100365"></a>Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:

<a id="p100366"></a>**°Т = А·К·10,**

<a id="p100367"></a>где: А - количество миллилитров 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии;
<a id="p100368"></a>К - поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида;
<a id="p100369"></a>10 - объем микробной суспензии, мл.
<a id="p100370"></a>*Пример* расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда:
<a id="p100371"></a>Т = 10,6·1,03·10= 109,18 °Т
<a id="p100372"></a>Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.


## <a id="p100373"></a>Раздел 3. Антагонистическая активность


<a id="p100374"></a>Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.
<a id="p100375"></a>При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):
- <a id="p100376"></a>для лактобактерий и бифидобактерий - среду МРС-5;
- <a id="p100377"></a>для кишечной палочки и споровых пробиотиков - среду Гаузе N 2.
<a id="p100378"></a>Тест-штаммы микроорганизмов
<a id="p100379"></a>Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в [табл. 2](#p100381). Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ "НЦЭСМП" (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).

<a id="p100380"></a>Таблица 2

<a id="p100381"></a>Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях
по отсроченному антагонизму


| <a id="p100382"></a>Тест-штамм микроорганизма | <a id="p100383"></a>Номер штамма |
| --- | --- |
| <a id="p100384"></a>Staphylococcus aureus | <a id="p100385"></a>ATCC 6538 (FDA 209P) |
| <a id="p100386"></a>Escherichia coli | <a id="p100387"></a>O157 |
| <a id="p100388"></a>Shigella flexneri | <a id="p100389"></a>170, 337 |
| <a id="p100390"></a>Shigella sonnei | <a id="p100391"></a>5063 |
| <a id="p100392"></a>Proteus mirabilis | <a id="p100393"></a>H-237 или 56/10 |
| <a id="p100394"></a>Proteus vulgaris | <a id="p100395"></a>177 или 401 |
| <a id="p100396"></a>Candida albicans | <a id="p100397"></a>ATCC10231 |


<a id="p100398"></a>Восстановление лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов
<a id="p100399"></a>Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя.
<a id="p100400"></a>Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях.
<a id="p100401"></a>Температура инкубации посевов бактерий (32,5 +/- 2,5) °C, грибов - (22,5 +/- 2,5) °C, если нет других указаний в нормативной документации.
<a id="p100402"></a>По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции.
<a id="p100403"></a>Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре (6 +/- 2) °C в течение 24 мес.
<a id="p100404"></a>Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.
<a id="p100405"></a>Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания. Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 +/- 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 OE в соответствии с [ОФС](https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-7-2-0008-15) "Определение концентрации микробных клеток".
<a id="p100406"></a>Отбор и подготовка образцов для анализа
<a id="p100407"></a>Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.
<a id="p100408"></a>Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 107 микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9% раствор натрия хлорида.
<a id="p100409"></a>Особенности подготовки испытуемого образца препарата пробиотиков в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. <a id="p100410"></a>Лиофилизаты - разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз.
2. <a id="p100411"></a>Таблетки - предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 - 10 раз.
3. <a id="p100412"></a>Порошки - содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.
4. <a id="p100413"></a>Капсулы - содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.
5. <a id="p100414"></a>Суппозитории - вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры (37 +/- 1) °C. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 - 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в [разделе 2](#p100339)).
<a id="p100415"></a>Методика испытания
<a id="p100416"></a>Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5 +/- 0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки.
<a id="p100417"></a>После инкубирования в течение 48 - 96 ч при температуре (37 +/- 1) °C в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 +/- 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 - 20 ч (если нет других указаний в нормативной документации).
<a id="p100418"></a>Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.
<a id="p100419"></a>Учет результатов
<a id="p100420"></a>Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.
<a id="p100421"></a>Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:
- <a id="p100422"></a>зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;
- <a id="p100423"></a>зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики.
- <a id="p100424"></a>зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм - для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики



<a id="p100425"></a>

---