ОФС.1.7.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности пробиотиков
Актуально на 03.11.2026.
Как цитировать: "ОФС.1.7.2.0009.15. Общая фармакопейная статья. Определение специфической активности пробиотиков". ОФС.1.7.2.0009.15. https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-7-2-0009-15
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)
Примечание
В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.05.2021 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Определение специфической активности пробиотиков | ОФС.1.7.2.0009.15 |
|---|
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы испытания специфической активности пробиотических производственных штаммов и пробиотиков на их основе, которая определяется количеством жизнеспособных бактерий и активностью кислотообразования или их антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам.
Таким образом, описанные в настоящей статье микробиологические методы позволяют определить следующие показатели специфической активности испытуемого препарата или штамма:
- количество жизнеспособных бактерий в 1 дозе <1> иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП) (раздел 1);
- активность кислотообразования (раздел 2);
- антагонистическая активность (раздел 3).
ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Требования к специфической активности испытуемого препарата касаются определения количества живых бактерий в 1 дозе лекарственного средства, кислотообразующей активности штаммов-продуцентов, входящих в лакто- и бифидосодержащие пробиотики для медицинского применения, и определения уровня антагонистической активности испытуемого препарата. Контроль испытуемого препарата по показателю «Количество жизнеспособных бактерий в одной дозе лекарственного средства» является обязательным при отработке новых технологий производства лекарственного средства, предварительном и сертификационном контроле, оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности. Определение количества живых микроорганизмов в испытуемой дозе проводят методом серийных разведений, при необходимости, с последующим высевом на питательные среды (Человеческая доза — доза испытуемого препарата, указанная на этикетке или в инструкции по медицинскому применению (листке-вкладыше)).
При проведении контроля поликомпонентных или комбинированных пробиотиков необходимо учитывать количество и соотношение всех видов или штаммов, входящих в состав препарата.
Показатель «Активность кислотообразования» является обязательным при контроле штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков, при предварительном и сертификационном контроле, при оценке качества и проверке стабильности лекарственных форм в процессе установления срока годности.
Показатель «Антагонистическая активность» является обязательным при контроле колисодержащих и споровых пробиотиков для медицинского применения и производственных штаммов. Уровень антагонистической активности ИЛП в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов определяют методом отсроченного антагонизма на плотной среде по зонам задержки роста тест-штаммов.
Производственные штаммы контролируются не реже 1 раза в год.
Питательные среды, используемые в испытаниях
Для выращивания микроорганизмов, входящих в пробиотики для медицинского применения, используют адекватную для данного вида бактерий и для данной методики питательную среду (если нет других указаний в нормативной документации):
- для лактобактерий — МРС-2, МРС-4, МРС-5, МРС-1; для ацидофильных лактобактерий — стерильное обезжиренное молоко;
- для бифидобактерий — полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, среду Блаурокка с натрия азидом, МРС-5;
- для кишечной палочки — среду Эндо, мясопептонный агар (МПА), среду Гаузе № 2 агаризованную;
- для энтерококков — МПА, среду № 1;
- для бактерии рода Bacillus — среду Гаузе № 2 агаризованную, МПА, полу синтетическую среду с дрожжевым диализатом.
Питательные среды для проведения испытаний готовят в соответствии с приведенными ниже указаниями. Также могут использоваться эквивалентные коммерчески доступные среды при условии, что они выдерживают испытания на ростовые свойства. Необходимое значение pH питательных сред устанавливают при температуре (25 +/- 2) °C.
В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:
| - марганец сернокислый | 0,05 г |
|---|---|
| - цистеин солянокислый или L-цистин | 0,10 г |
| - магний сернокислый | 0,200 г |
| - калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный | 2,00 г |
| - аммония цитрат | 2,00 г |
| - натрия ацетат (натрий уксуснокислый) | 5,00 г |
| - печеночный экстракт <а> (1:1) | 100,0 мл |
| - дрожжевой аутолизат <б> с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)% | 50,0 мл |
| - пептон сухой ферментативный | 10,00 г |
| - гидролизат обезжиренного молока <в> | 500,0 мл |
| - полисорбат 80 | 1,00 мл |
| - глюкоза | 20,00 г |
Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл; pH среды (6,4 +/- 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения готовой стерильной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
<а> Приготовление печеночного экстракта с содержанием аминного азота (0,050 +/- 0,005)%.
| - Печень говяжья | 1,0 кг |
|---|---|
| - Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
Приготовление: 1,0 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 — 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре 120 +/- 2 °C в течение 15 +/- 1 мин. Срок хранения печеночного экстракта при температуре от 2 до 8 °C не более 6 мес или не более 3 мес при комнатной температуре.
<б> Приготовление дрожжевого аутолизата с содержанием аминного азота (0,15 +/- 0,03)%.
| - Дрожжи хлебопекарные | 1000 г |
|---|---|
| - Вода питьевая | 4000 мл |
| - Хлороформ | 40 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин.
<в> Приготовление гидролизата обезжиренного молока по Богданову.
| - Молоко коровье пастеризованное, нежирное (pH 6,7 +/- 0,1) | 1000 мл |
|---|---|
| - Панкреатин | 1,0 г |
| - Хлороформ | 5,0 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин.
Значение pH готовой среды (6,4 +/- 0,2). Питательную среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
В 200 мл воды очищенной последовательно растворяют:
Доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл (pH 6,4 +/- 0,2). Питательную среду стерилизуют в автоклаве при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных флаконах или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Питательную среду (pH 7,0) стерилизуют в автоклаве при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах) или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Приготовление обезжиренного стерильного молока pH (6,7 +/- 0,3);
показатель кислотности не более 18 °Т:
| - Молоко сухое обезжиренное | 80 г |
|---|---|
| - Вода очищенная | до 1000 мл |
Разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (120 +/- 2) °C в течение (15 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения обезжиренного стерильного молока 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Модифицированная печеночная среда Блаурокка
| - Печеночная вода (1:2) с содержанием аминного азота (100 +/- 20) мг% | 1000 мл |
|---|---|
| - Пептон сухой | 10 г |
| - Натрия хлорид | 5 г |
| - Лактоза | 10 г |
| - Цистеин | 0,1 г |
| - Агар микробиологический | 0,75 г |
Устанавливают требуемое значение pH (7,2 +/- 0,2) с помощью 20% раствора натрия гидроксида. Питательные среды разливают в пробирки по 10, 25 или 30 мл и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (60 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется). Срок хранения питательной среды 2 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C. После 14 сут хранения перед использованием для снижения содержания растворенного кислорода среду следует однократно регенерировать путем нагревания пробирок на водяной бане при температуре 70 — 80 °C в течение 10 — 15 мин.
Приготовление печеночной воды с содержанием аминного азота (100 +/- 20) мг %.
| - Печень говяжья | 0,5 кг |
|---|---|
| - Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин (процесс стерилизации валидируется).
0,5 кг свежей говяжьей печени очищают от жира, пленок и протоков, нарезают кубиками размером (3x3x3) см, заливают 1 л воды очищенной и кипятят в течение 1,5 — 2 ч. Остывший отвар фильтруют через марлевый фильтр (ткань «миткаль»), количество отвара доводят водой очищенной до 1 л, разливают в бутыли и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения — не более 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 3 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Среда Блаурокка с азидом натрия
| - Среда Блаурокка | 1000 мл |
|---|---|
| - Натрия азид | 0,1 г |
Среду перемешивают, разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 1 мес при температуре от 2 до 8 °C.
| - Бульон Хоттингера <1> с содержанием аминного азота 700 мг% | 30 мл |
|---|---|
| - Пептон сухой | 5 г |
| - Натрия хлорид | 5 г |
| - Глюкоза | 10 г |
| - Агар микробиологический | 30 г |
| - Вода очищенная | до 1000 мл |
Приготовление бульона Хоттингера (содержание аминного азота 700 мг%).
| - Гидролизат Хоттингера | 24,0 г |
|---|---|
| - Натрия хлорид | 5,0 г |
| - Вода очищенная | до 1000 мл |
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды в течение 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).
Полусинтетическая среда с дрожжевым диализатом агаризованная
Стерилизация в автоклаве при температуре (112 +/- 5) °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C в стерильных герметичных контейнерах (флаконах).
| - Пептон | 10,0 г |
|---|---|
| - Натрия хлорид | 5,0 г |
| - Мясная вода | 300 — 500 мл |
| - Агар микробиологический | 13 — 20 г |
В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2 — 7,4 и добавляют измельченный агар в количестве, зависящем от его качества и назначения среды. После добавления агара среду кипятят на слабом огне при постоянном перемешивании до полного растворения агара. Разливают в пробирки и флаконы, стерилизуют при температуре 120 °C в течение (20 +/- 1) мин. После стерилизации среда, остывая, уплотняется.
Срок хранения готовой среды (pH 7,3 +/- 0,2) 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
| - Пептон | 10,0 г |
|---|---|
| - Натрия хлорид | 5,0 г |
| - Мясная вода | 1000 мл. |
В мясную воду вносят 10 г пептона и 5 г натрия хлорида, кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения добавленных ингредиентов. Приготовленный бульон фильтруют, устанавливают pH 7,2 — 7,4 и разливают в пробирки и флаконы. Стерилизуют при температуре 120 °C в течение (20 +/- 1) мин. Срок хранения питательной среды 6 мес при температуре от 2 до 8 °C или не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Приготовление мясной воды (1:2).
| - Мясо-говядина (фарш) | 500 г |
|---|---|
| - Вода очищенная | 1000 мл |
Стерилизация при температуре 121 °C в течение 20 мин. Срок хранения 2 мес при температуре от 2 до 8 °C и не более 1 мес при температуре от 18 до 25 °C.
Перед испытанием, в случае использования плотной питательной среды, по 10 — 15 или 20 — 25 мл расплавленной агаризованной питательной среды (при температуре около 45 °C) разливают в стерильные чашки Петри диаметром 9 или 12 см (соответственно), оставляют на горизонтальной поверхности и дают среде застыть. Поверхность агаризованных сред перед посевом подсушивают для удаления конденсационной воды и проверки стерильности. Чашки Петри с питательными средами помещают закрытыми и перевернутыми вверх дном в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 48 ч. Агар Эндо подсушивают 40 мин в ламинарном шкафу с открытыми крышками.
Раздел 1. Определение количества жизнеспособных бактерий в 1 дозе ИЛП
В настоящем разделе изложены общие принципы определения количества живых бактерий в пробиотиках для медицинского применения методом десятикратных разведений с высевом на плотные питательные среды (метод Коха) и глубинного чашечного метода или в жидкие и полужидкие среды (метод предельных разведений). Результаты количественного определения микроорганизмов выражаются в колониеобразующих единицах (КОЕ).
Отбор и подготовка образцов для анализа
От каждой испытуемой серии препарата пробиотика методом случайной выборки отбирают по 3 испытуемых образца.
Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
Каждый образец в отдельности разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз.
Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. Лиофилизаты (флаконы) — каждый образец в отдельности ресуспензируют стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (из расчета 1 мл на 1 дозу) и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз, получая исходное разведение.
2. Порошки — содержимое пакета (саше) асептически пересыпают в стерильную колбу вместимостью 250 мл, добавляют 100 мл 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин, получая разведение 1:100 (10-2).
3. Таблетки — каждый образец в отдельности предварительно растирают в стерильной ступке стерильным пестиком до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз, получая исходное разведение.
4. Капсулы — каждый образец в отдельности вносят в стерильные пробирки, добавляют 10 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки с капсулами помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 — 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1).
5. Суппозитории — каждый образец в отдельности помещают в стерильные пробирки и добавляют предварительно нагретый до температуры (37 +/- 1) °C стерильный 0,9% раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл в зависимости от величины средней массы суппозитория испытуемой серии (например, при массе 1,1 г добавляют 8,9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, а при массе 2 г — 8 мл физиологического раствора). Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 — 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния, получая разведение 1:10 (10-1).
Испытание проводят методом последовательных десятикратных разведений, соблюдая правила асептики. Для этого 1 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение, разведения 10-1 или 10-2) вносят пипеткой в пробирку, содержащую 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10 — 15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-2 или 10-3), и затем 1 мл суспензии переносят в следующее разведение. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
В случае, если образец содержит 1 дозу, 0,5 мл микробной суспензии испытуемого образца (исходное разведение) пипеткой вносят в пробирку, содержащую 4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Затем новой пипеткой 10 — 15 раз перемешивают, получая следующее разведение (10-1) и 1 мл суспензии переносят в пробирку с 9 мл 0,9% раствора натрия хлорида, получая разведение 10-2. Титрование проводят до разведений, из которых будет произведен высев на питательные среды. Для каждого разведения используют отдельную пипетку.
В зависимости от биологических свойств бактерий, входящих в состав испытуемого образца, используют соответствующую методику испытания.
1. Высев на плотные питательные среды
1.1 Метод Коха
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в 1 дозе исследуемого препарата) по 0,1 мл микробной суспензии высевают на чашки Петри с питательной средой (по 2 чашки на каждое разведение). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды шпателем Дригальского или с помощью стеклянных бус до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации.
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 24 — 96 ч в адекватных, в зависимости от вида микроорганизма, условиях (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных). При инкубировании в анаэробных или микроаэрофильных условиях чашки Петри с посевами помещают в анаэростат и создают необходимую газовую атмосферу.
Данный метод может быть использован при определении количества живых бактерий каждого вида в поликомпонентных пробиотиках при условии, что бактерии, входящие в состав препарата, образуют визуально различимые по форме и другим признакам колонии.
1.2. Глубинный чашечный метод
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца из 2 последних разведений (степень разведения зависит от количества КОЕ в исследуемом препарате) по 1,0 мл микробной суспензии стерильной пипеткой вместимостью 1,0 мл вносят в чашки Петри диаметром 90 мм (по 2 чашки на каждое разведение). Добавляют 20 — 25 мл расплавленной и охлажденной до температуры 42,5 +/- 2,5 °C агаризованной питательной среды, закрывают и быстро осторожно перемешивают вращательно-поступательными движениями, не отрывая дна чашки от поверхности стола и не допуская попадания среды на крышку чашки. После застывания агара чашки Петри переворачивают вверх дном и инкубируют в адекватных условиях при температуре (37 +/- 1) °C в течение необходимого для данного микроорганизма времени.
По окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе испытуемого образца. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний.
Пример расчета содержания живых микробных клеток в 1 дозе испытуемого образца:
- из разведения 10-7 выросло 42 и 45 колоний; среднее арифметическое равно (42 + 45) : 2 = 43,5;
- из разведения 10-6 выросло 410 и 450 колоний; среднее арифметическое равно (410 + 450) : 2 = 430;
- количество живых бактерий в 1 дозе равно:
(43,5·107 + 430·106) : 2 10 = 4325000000 = 4,3·109.
Умножают среднюю арифметическую числа колоний на степень разведения и в том случае, если высев на чашку Петри сделан в объеме 0,1 мл, умножают на коэффициент 10 для пересчета на 1,0 мл.
2. Метод предельных разведений с последующим высевом на жидкие и полужидкие питательные среды
2.1. Пробирочный метод наиболее вероятных чисел (определение количества живых ацидофильных лактобактерий)
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии от каждого разведения в 2 пробирки с 9 мл стерильного обезжиренного молока. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в молоке. Для контроля среды добавляют 4 незасеянные пробирки с молоком. Засеянные и контрольные пробирки инкубируют при температуре (38 +/- 1) °C в течение 3 — 4 сут.
По окончании инкубации определяют количество пробирок со свернувшимся молоком. Из сгустка с культурой готовят мазки и окрашивают по Граму. Если в мазках видны характерные бактерии и отсутствует посторонняя микрофлора, то данное разведение учитывают, как содержащее микроорганизмы данного вида. В случае сквашивания молока в контрольных пробирках и при обнаружении посторонней микрофлоры в мазках, контроль проводят на новой партии среды.
При подсчете количества живых особей используют таблицу Мак-Креди (табл. 1). Сначала составляют числовую характеристику. Она состоит из 3 цифр: на первое место (слева) ставят цифру, равную числу пробирок со свернувшимся молоком, взятых в том последнем разведении, где молоко свернулось во всех пробирках (например, 2 пробирки разведения 10-6).
Следующие две цифры обозначают число пробирок со свернувшимся молоком в 2 последующих разведениях (например, в 1 пробирке разведения 10-7 и в 1 пробирке разведения 10-8).
Числовая характеристика результата будет 211.
По таблице Мак-Креди находят вероятное число, соответствующее полученной цифровой характеристике (в нашем случае 13), умножают его на разведение, которому соответствует первая цифра числовой характеристики (в данном примере — 10-6). Тогда количество живых особей микроорганизмов в 1 дозе составляет 13·106 = 1,3·107.
Таблица Мак-Креди, используемая при подсчете количества живых ацидофильных лактобактерий
| Числовая характеристика | Наиболее вероятное число микроорганизмов при посеве в 2 параллельные пробирки |
|---|---|
| 200 | 2,5 |
| 201 | 5,0 |
| 202 | - |
| 210 | 6,0 |
| 211 | 13,0 |
| 212 | 20,0 |
| 220 | 25,0 |
| 221 | 70,0 |
2.2. Пробирочный метод учета колоний в полужидкой среде
Из разведений препарата 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 (степень разведения зависит от количества КОЕ в испытуемом образце) высевают по 1 мл микробной суспензии в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды. Отмечают, из какого именно разведения сделан посев. Разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в питательной полужидкой среде.
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в зависимости от вида микроорганизма в течение 1 — 6 сут. По окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост типичных колоний для данного вида микроорганизмов.
В ряду последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в полужидкой питательной среде должно наблюдаться 10-кратное уменьшение количества колоний микроорганизмов.
Количество живых бактерий в дозе испытуемого препарата вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке (объем вносимого материала в 1,0 мл дает коэффициент умножения 1, который не влияет на конечный результат при вычислении).
3. Определение количества живых бактерий в поликомпонентных пробиотиках
3.1 Комбинированный метод (определение количества бифидо- и колибактерий)
Для определения количества живых бактерий в составе препарата пробиотика из соответствующих последовательных десятикратных разведений испытуемого образца в 0,9% растворе натрия хлорида (с 10-1 по 10-9) проводят высевы на среду Блаурокка с натрия азидом (учет бифидобактерий) и на среду Эндо (учет колибактерий).
Для определения количества бифидобактерий по 1 мл микробной суспензии из разведений 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 высевают в пробирки, содержащие 9 мл полужидкой питательной среды Блаурокка с азидом натрия (отмечая разведение, из которого сделан посев). При этом учитывают, что разведение 10-6 препарата в 0,9% растворе натрия хлорида соответствует разведению 10-6 в среде Блаурокка с азидом натрия. Посевы в среде Блаурокка с азидом натрия инкубируют при температуре (38 +/- 1) °C в течение 4 — 5 сут.
Для определения количества кишечных палочек делают посев по 0,1 мл микробной суспензии из разведений испытуемого образца 10-5, 10-6 на чашки Петри со средой Эндо (по 2 чашки от каждого разведения). Суспензию равномерно распределяют по поверхности среды Эндо шпателем Дригальского до полного впитывания (высыхания) суспензии. Чашки закрывают и помещают перевернутыми вверх дном в термостат для инкубации. Посевы на среде Эндо инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 — 24 ч.
В среде Блаурокка с натрия азидом по окончании инкубации отмечают разведения, в которых имеется рост колоний в виде «гвоздиков». Количество живых бактерий в дозе вычисляют путем умножения количества колоний в пробирке на величину разведения микробной суспензии в данной пробирке.
На среде Эндо по окончании инкубации производят подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляют содержание живых бактерий в 1 дозе препарата. При подсчете учитывают чашки, на которых выросло не менее 15 колоний. Пример для расчета аналогичен описанному в подразделе 1.
Раздел 2. Активность кислотообразования
Кислотообразующую активность штаммов-продуцентов, входящих в состав лакто- и бифидосодержащих пробиотиков для медицинского применения определяют по титруемой кислотности при культивировании бактерий в адекватной питательной среде. Испытание количественного определения кислотообразующей активности проводят методом кислотно-основного титрования.
Для выращивания бифидобактерий используют полужидкую модифицированную печеночную среду Блаурокка, для лактобактерий — МРС-1 или стерильное обезжиренное молоко, если нет других указаний в нормативной документации.
Реактивы, используемые в испытании:
Особенности отбора и подготовки образцов для анализа
От каждой испытуемой серии лекарственного средства, независимо от ее объема, методом случайной выборки отбирают по 2 образца. В случае, если испытуемый образец (т.е. таблетка/капсула/суппозиторий) содержит 1 дозу, то в 1 образец объединяют 3 таблетки/капсулы/суппозитория.
Испытания проводят, соблюдая правила асептики.
Особенности подготовки испытуемого образца в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. Лиофилизаты — испытуемый образец (каждый образец в отдельности) разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз.
По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 — 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
2. Таблетки — каждый образец в отдельности предварительно растирают (асептически) в ступке до гомогенного состояния и дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз.
По 2,5 мл полученной суспензии каждого образца вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 25 мл питательной среды. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 — 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
3. Порошки — содержимое саше асептично пересыпают в пробирку, вместимостью 50 мл, содержащую 25 мл питательной среды, и перемешивают. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 — 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
4. Капсулы — каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 20 — 30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 — 72 ч (сроки инкубации зависят от вида микроорганизма).
5. Суппозитории — каждый образец в отдельности вносят в пробирки вместимостью 50 мл, содержащие по 30 мл питательной среды, адекватной для вида микроорганизма, входящего в состав препарата. Пробирки помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 20 — 30 мин полученную суспензию перемешивают до гомогенного состояния. Пробирки с посевами испытуемых образцов помещают в термостат при температуре (38 +/- 1) °C и инкубируют в течение 48 — 72 ч (сроки инкубации определяются видом микроорганизма).
После окончания инкубации суспензию в пробирках освобождают от липофильной суппозиторной основы одним из следующих способов:
- сразу после окончания инкубирования при температуре посевов (38 +/- 1) °C стерильной пипеткой удаляют растопленный верхний слой жира;
- пробирки охлаждают при температуре от 2 до 8 °C в течение (20 +/- 5) мин, затем застывшую суппозиторную основу снимают асептически пастеркой с загнутым концом или бактериологической петлей.
Уровень кислотообразования определяют в каждом из 2 образцов. После окончания инкубации содержимое пробирки перемешивают отдельной пипеткой 8 — 10 раз. Каждую пробу в объеме 10 мл вносят в отдельную коническую колбу или стакан вместимостью 100 мл.
Штаммы-продуценты, выращенные в стерильном обезжиренном молоке, образуют сгусток. Образовавшийся сгусток разбивают путем тщательного перемешивания (10 — 12 раз) пипеткой вместимостью 10 мл. После этого 10 мл микробной суспензии переносят из пробирки с культуральной средой в коническую колбу вместимостью 100 мл, содержащую 20 мл воды очищенной. Колбу интенсивно встряхивают для равномерного перемешивания содержимого, затем прибавляют 2 — 3 капли 1% раствора фенолфталеина.
Полученную суспензию титруют 0,1 М раствором натрия гидроксида до появления стойкого слабо-розового окрашивания и достижения pH (8,5 +/- 0,1) (контролируют потенциометрически), при этом учитывают количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование.
Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:
где: А — количество миллилитров 0,1М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл исследуемой микробной суспензии;
К — поправка к титру 0,1 М раствора натрия гидроксида;
10 — объем микробной суспензии, мл.
Пример расчета: на титрование 10 мл микробной суспензии пошло 10,6 мл 0,1 М раствора натрия гидроксида, где К = 1,03, тогда:
Вычисляют средний показатель из 2 параллельных проб от каждого образца (пробирки) и средний показатель из 2 образцов (пробирок) при условии, если показатель активности кислотообразования каждого из них был не ниже регламентированного.
Раздел 3. Антагонистическая активность
Антагонистическую активность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов оценивают как у штаммов-продуцентов, так и у препаратов пробиотиков, полученных на их основе. Определение антагонистической активности штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, проводят с помощью метода отсроченного антагонизма.
При проведении испытания применяют питательную среду, адекватную для данного вида бактерий (если нет других указаний в нормативной документации):
- для лактобактерий и бифидобактерий — среду МРС-5;
- для кишечной палочки и споровых пробиотиков — среду Гаузе № 2.
Тест-штаммы микроорганизмов, используемые в испытании, приведены в табл. 2. Их получают в лиофилизированном виде (в ампулах) из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» (если нет других указаний в нормативной документации) с сертификатом соответствия (паспортом на штамм).
Тест-штаммы микроорганизмов, используемых в испытаниях по отсроченному антагонизму
Восстановление лиофилизированных тест-штаммов микроорганизмов
Ампулы с тест-культурами микроорганизмов вскрывают в асептических условиях в соответствии с инструкцией производителя.
Для восстановления жизнеспособности культуры необходимо не менее двух пересевов на адекватной питательной среде (соответствующей потребностям используемого микроорганизма) с инкубацией в стандартных условиях. Для получения изолированных колоний второй пересев культуры тест-штамма проводят на адекватной плотной питательной среде при инкубации в стандартных условиях.
Температура инкубации посевов бактерий (32,5 +/- 2,5) °C, грибов — (22,5 +/- 2,5) °C, если нет других указаний в нормативной документации.
По окончании инкубации изучают морфологию выросших колоний, микроскопируют мазки, окрашенные по Граму, изучают биохимические свойства с использованием тест-систем, разрешенных к использованию. Тест-штамм микроорганизма должен обладать типичными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами в соответствии с представленным сертификатом коллекции.
Тест-штаммы микроорганизмов в лиофилизированном виде хранятся при температуре (6 +/- 2) °C в течение 24 мес.
Допускается не более 5 пассажей от исходной культуры.
Приготовление тест-штаммов микроорганизмов для испытания. Для испытания используют культуры, выращенные в течение (22 +/- 2) ч, второго или третьего пассажа, которые инкубируют на адекватной плотной питательной среде в адекватных условиях. Выросшую чистую культуру смывают 0,9% раствором натрия хлорида с поверхности плотной питательной среды. Полученную суспензию собирают в стерильную посуду (флакон, пробирку и т.д.). Доводят концентрацию микробных клеток в полученной суспензии в соответствии со стандартным образцом мутности 5 OE в соответствии с ОФС «Определение концентрации микробных клеток».
Отбор и подготовка образцов для анализа
Методом случайной выборки отбирают образцы от каждой серии препарата. Посевы проводятся в стерильных условиях.
Пробиотические производственные штаммы-продуценты (лиофилизаты) восстанавливают до первоначально высушенного объема (но не менее 107 микробных клеток/мл), добавляя в лиофилизат стерильный 0,9% раствор натрия хлорида.
Особенности подготовки испытуемого образца препарата пробиотиков в зависимости от лекарственной формы (если нет других указаний в нормативной документации):
1. Лиофилизаты — разводят стерильным 0,9% раствором натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз.
2. Таблетки — предварительно растирают в ступке (асептически) до гомогенного состояния дробно добавляют 0,9% раствор натрия хлорида из расчета 1 мл на 1 дозу и перемешивают пипеткой 8 — 10 раз.
3. Порошки — содержимое пакета (саше) высыпают в пробирку, содержащую 25 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида, и перемешивают путем энергичного встряхивания в течение 10 мин.
4. Капсулы — содержимое капсулы вносят в пробирку, добавляют 1 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и перемешивают до гомогенного состояния.
5. Суппозитории — вносят в пробирку, добавляют до общего объема 10 мл стерильный 0,9% раствор натрия хлорида, предварительно нагретый до температуры (37 +/- 1) °C. Пробирки с суппозиториями помещают на водяную баню при температуре (39 +/- 1) °C. Через 10 — 30 мин содержимое пробирок перемешивают до гомогенного состояния и освобождают от жировой основы (как описано выше в разделе 2).
Полученную суспензию испытуемого образца перемешивают и высевают бактериологической петлей диаметром (3,5 +/- 0,5) мм на 6 чашек Петри с питательной средой, проводя по 2 параллельных штриха длиной, равной диаметру чашки.
После инкубирования в течение 48 — 96 ч при температуре (37 +/- 1) °C в адекватных (аэробных, микроаэрофильных или анаэробных) условиях в зависимости от вида микроорганизма к выросшей культуре испытуемого образца подсевают культуры тест-штаммов (в соответствии с требованиями нормативной документации). Подсев тест-штаммов производят петлей диаметром (1,75 +/- 0,25) мм в направлении, перпендикулярном зоне роста изучаемого микроорганизма, и не касаясь его. Чашки Петри перевернутые вверх дном инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение 18 — 20 ч (если нет других указаний в нормативной документации).
Контролем роста тест-штаммов служит их параллельный посев на чашки с той же питательной средой без испытуемой культуры.
Учитывают величину зоны отсутствия роста тест-штамма, выраженную в мм. Чем больше величина угнетения роста тест-культур, тем выше антагонистическая активность испытуемого штамма.
Если нет других указаний в нормативной документации, антагонистическую активность штаммов-продуцентов, входящих в пробиотики для медицинского применения, считают высокой, если:
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 20 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в лактосодержащие пробиотики;
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 15 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в коли-, бифидосодержащие пробиотики.
- зоны угнетения роста тест-штаммов не менее 10 мм — для штаммов-продуцентов, входящих в споросодержащие пробиотики