ОФС.1.7.2.0005.15. Общая фармакопейная статья. Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин	ОФС.1.7.2.0005.15

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella pertussis 18323 по методу Kendrick.

Материалы

Животные. Здоровые мыши с массой тела (11 +/- 1) г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10% мышей данную партию не используют.

Референс-препараты:

• стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в МЕ по соответствующему международному стандартному образцу;
• стандартный образец мутности 10 МЕ, калиброванный в международных оптических единицах (МЕ).

Тест-штамм. B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Среды. Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.

Среда Борде-Жангу

В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:

• калий фосфорнокислый двузамещенный — 2,25 г,
• калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,75 г,
• калий хлористый — 1,5 г,
• магний сернокислый — 0,075 г,
• натрий хлористый — 7,5 г.

Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь pH 7,4 — 7,5.

Затем в солевой раствор вносят:

• фильтрат картофельного отвара — 500 мл,
• агар зарубежных фирм «Дифко» (США) или «Мерк» (Германия) — 60 г.

Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают pH 7,1 — 7,2, разливают по (200 +/- 5) мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110 °C в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 3 мес.

Фильтрат картофельного отвара

В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля в течение 1,0 — 1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.

Для получения среды Борде-Жангу с 30% крови содержимое флакона нагревают до температуры 50 — 55 °C, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью — 10 сут при температуре от 2 до 8 °C.

Примечание

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ «Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови» и «Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза». Срок хранения крови не более 2 сут.

Среда КУА (казеиново-угольный агар)

На 1 л среды добавляют:

• гидролизат казеина — (170 +/- 5) мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до 160 мг%),
• дрожжевой диализат — (90 +/- 10) мл,
• калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,5 г,
• магний хлористый 6-водный — 0,4 г,
• крахмал растворимый — 1,5 г,
• кальций хлористый — 0,01 г или 1% раствор — 1 мл,
• железо сернокислое 7-водное — 0,01 г или 0,5% раствор — 2 мл,
• медь сернокислая 5-водная — 0,005 г или 0,2% раствор — 2 мл,
• цистеин — 0,03 г или 1,5% раствор — 2 мл,
• агар микробиологический — 30,0 г,
• уголь активированный — 2 г.

Содержание хлоридов в среде должно составлять (0,75 +/- 0,15)%, аминного азота (155 +/- 10 мг%); pH среды доводят до 7,0 — 7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по (250 +/- 10) мл, пробирки по (11 +/- 1) мл и флаконы вместимостью 500 мл по (200 +/- 5) мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110 °C и хранят при температуре от 2 до 8 °C не более 1 мес. Для получения среды с 10% крови содержимое флакона растапливают, охлаждают до температуры 50 — 55 °C, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8 °C.

Гидролизат казеина:

• казеин (сухой) — 2000 г,
• хлористоводородная кислота концентрированная — 1000 мл,
• вода очищенная — 500 мл.

Степень расщепления белка — не менее 93%. Аминный азот 850 — 1000 мг%, общий азот 910 — 1080 мг%, натрия хлорид 4 — 6%. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110 °C. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5% хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8 °C).

Дрожжевой диализат:

• дрожжи хлебопекарные — 1000 г,
• вода очищенная — 1000 мл,
• хлороформ — 4 мл.
• Аминный азот — не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8 °C.

1% раствор гидролизата казеина

Гидролизат казеина — 10 мл (аминный азот 8,5 — 10,0 мг/мл), натрий хлористый — 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6%), вода очищенная — до 1000 мл. С помощью 20% раствора натрия гидроксида pH доводят до (7,1 +/- 0,2), Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121 °C. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины

Мышей распределяют в группы по 18 — 20 животных в каждой: по 3 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение LD50 культуры) из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

Иммунизация мышей

Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида, pH (7,1 +/- 0,2). В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза ED50.

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

Таблица 1

Пример разведения референс-препарата

Разведение	Объем вносимого разведения I референс-препарата, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Разведения референс-препарата (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза — 0,5 мл
				Количество исходного референс-препарата, мл	Количество МЕ
I	15	0	1:60	0,0167	0,5
II	2,5	10,0	1:300	0,0033	0,1
III	0,5	12,0	1:1500	0,00066	0,02

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение ED50 испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.

Таблица 2

Пример разведения испытуемой вакцины

Разведение	Объем вносимого I разведения вакцины, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Кратность разведений исходной вакцины (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
				Количество исходной вакцины, мл	Количество МЕ (предполагаемое содержание)
I	14	0	1:28	0,0357	0,5
II	2,5	10,0	1:140	0,0071	0,1
III	0,5	12,0	1:700	0,00142	0,02

Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8 °C и используют в течение не более 4 ч.

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94% иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

Приготовление заражающей суспензии тест-штамма B. pertussis 18323

Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20 — 24-часовой культуры второго — третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.

Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. pertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.

Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 МЕ по стандартному образцу мутности (разведение 1А). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, pH (7,1 +/- 0,2).

Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100 — 1000 LD50). Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения LD50 тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

Таблица 3

Пример разведения тест-штамма B. pertussis 18323

Номер пробирки	Кратность разведения	Объем переносимой суспензии из предыдущей пробирки в последующую, мл	Объем внесенного растворителя, мл	Полученная суспензия содержит в 0,03 мл (эквивалентно)	Назначение
1	1А:3	1	2	100 млн
2	11:10	0,5	4,5	10 млн
3	12:10	0,5	4,5	1 млн
4	13:10	2	18	100000	Разливают в 3 пробирки для заражения — рабочая суспензия
5	14:10	0,5	4,5	10000	Для определения LD50 штамма
6	15:5	1,0	4,0	2000
7	16:5	1,0	4,0	400
8	17:5	1,0	4,0	80

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой (36 +/- 0,5) °C на 3 — 4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчет выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.

При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.

Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100 — 1000 LD50 в объеме 0,03 мл.

Заражение иммунизированных животных

Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14 — 17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. pertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу № 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины LD50 разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.

Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины LD50 (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

lgLD_{50} = lgD_{N} - \delta(\sum Li - 0,5) ,

где: DN — максимальная из испытуемых доз;

\delta — логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li — отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

\sum Li — сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

Таблица 4

Пример расчета величины LD50 культуры тест-штамма B. pertussis 18323

Доза культуры (число микробных клеток) 0,03 мл	Число зараженных животных	Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных	Значения Li	LD50	Кол-во колоний в заражающей дозе 80 клеток
104	10	9/10	0,9	648	23
2·103	10	7/10	0,7
4·102	10	4/10	0,4
80	10	2/10	0,2
			\sum Li = 2,2

lg LD50 = lg 104 — lg 5·(2,2 — 0,5) = 4,0 — 0,699·1,7 = 2,8117

LD50 = 648 микробных клеток.

В заражающей дозе (105 микробных клеток) содержится 648 = 154 LD50

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n = 16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (A), по горизонтальной оси — разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (B). В месте пересечения прямых, проведенных от соответствующих величин A и B, находят ED50 (верхняя цифра) и ее стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует ED50 для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины ED50 в опыте, найденную в таблице величину ED50 делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы не ниже 64% и не выше 157% от найденного значения ED50.

Таблица 5

Таблица Вильсона-Вустера

Приложение

Таблица Вильсона-Вустера

Общее число мышей, выживших на все 3 дозы	41	10,1 48 — 208	14,5 66 — 154
	40	9,4 42 — 236	13,6 58 — 172	17,2 71 — 140
	39	9,4 38 — 260	13,4 53 — 187	17,0 66 — 153	20,3 76 — 133
	38	9,5 36 — 276	13,75 50 — 199	17,6 62 — 163	20,75 71 — 142	23,1 78 — 128
	37	10,2 35 — 288	14,5 48 — 208	18,5 59 — 170	21,7 67 — 148	24,3 74 — 134	25,9 80 — 125
	36	11,3 34 — 295	15,5 47 — 213	19,7 57 — 175	23,1 65 — 154	25,9 71 — 140	28,0 76 — 131	29,0 81 — 124
	35	12,3 34 — 296	17,0 46 — 217	21,3 56 — 178	25,1 64 — 157	28,0 70 — 144	29,9 74 — 135	31,4 78 — 128	32,9 81 — 124
	34	14,0 34 — 294	19,0 46 — 218	23,5 55 — 181	27,25 63 — 160	30,4 68 — 147	32,9 73 — 137	34,6 76 — 131	35,7 49 — 126	39,9 81 — 124
	33	16,5 35 — 288	21,7 46 — 217	26,3 55 — 181	29,9 62 — 161	33,5 67 — 149	35,7 72 — 140	38,1 75 — 133	39,3 78 — 129	40,6 80 — 125
	32	19,4 36 — 279	25,1 47 — 214	29,4 55 — 181	33,5 62 — 162	36,8 67 — 150	39,3 71, 141	41,9 74 — 134	43,25 77 — 131	44,0 79 — 127	47,7 81 — 124
	31	23,1 37 — 268	29,0 48 — 210	34,0 56 — 180	38,1 62, 162	41,3 67 — 150	44,0 70 — 143	46,2 73 — 136	47,75 76 — 132	48,5 78 — 128	50,0 80 — 125
	30	28,0 39 — 258	34,0 49 — 205	38,7 56 — 178	43,3 62 — 162	46,2 66 — 151	49,25 70 — 143	50,9 73 — 136	52,5 75 — 134	53,5 77 — 130	55,1 79 — 126	59,7 81 — 123	61,7 82 — 121
	29	34,0 41 — 244	39,9 50 — 201	44,7 57 — 176	49,25 62, 161	52,5 66 — 151	55,1 70 — 144	56,9 72 — 139	57,8 75 — 134	59,7 77 — 130	60,7 79 — 126	62,75 81 — 123	64,8 82 — 121
	28	41,9 43 — 233	47,7 50 — 196	52,5 57 — 174	56,0 62 — 161	58,8 66 — 151	61,7 70 — 144	63,7 72 — 139	64,8 75 — 134	65,8 77 — 131	66,9 79 — 137	69,1 81 — 123	71,3 82 — 121
	27	51,7 43 — 224	56,9 52 — 192	61,7 58 — 173	64,6 63 — 160	66,9 66 — 151	69,1 70 — 144	71,3 72 — 139	72,5 74 — 135	72,5 76 — 131	73,6 79 — 128	74,8 81 — 123	76,41 82 — 121
	26	64,8 44 — 217	69,1 53 — 188	72,5 58 — 171	74,8 63 — 160	76,1 67 — 150	78,6 70 — 144	79,8 72 — 139	79,8 74 — 134	84,4 76 — 131	84,4 78 — 128	82,4 81 — 123	82,4 82 — 121
	25	79,8 47 — 211	82,4 54 — 187	85,1 59 — 170	86,5 63 — 159	87,9 67 — 150	87,9 70 — 144	89,25 72 — 139	89,25 74 — 134	89,25 76 — 131	90,8 78 — 128	90,8 81 — 123	90,8 82 — 121
	24	100 48 — 211	100 54 — 186	100 59 — 170	100 63 — 159	100 67 — 150	100 70 — 144	100 72 — 139	100 74 — 134	100 77 — 131	100 79 — 127	100 81 — 123	100 83 — 120
	23	125,3 47 — 211	121,3 54 — 187	117,5 59 — 170	115,6 63 — 159	113,7 67 — 150	113,7 70 — 144	111,75 72 — 139	111,75 74 — 134	111,75 76 — 131	110,25 78 — 128	110,25 81 — 123	110,25 82 — 121
	22	154,4 46 — 217	144,8 53 — 188	138,0 58 — 172	133,6 63 — 160	131,5 67 — 150	127,3 70 — 144	125,3 72 — 139	125,3 74 — 134	123,3 76 — 131	123,3 78 — 128	121,3 81 — 123	121,3 82 — 121
	21	193,3 45, 224	175,7 52 — 192	162,2 58 — 173	154,4 63 — 160	149,5 66 — 151	144,75 70 — 144	140,2 72 — 139	138,0 74 — 135	138,0 76 — 131	135,3 79 — 128	133,6 81 — 123	131,5 82 — 121
	20	238,5 43 — 233	209,7 50 — 196	190,3 57 — 174	178,5 62 — 161	170,1 66 — 151	162,2 70 — 144	157,0 72 — 139	154,4 75 — 134	152,0 77 — 131	149,5 79 — 127	144,3 81 — 123	140,2 82 — 121
	19	294,0 41 — 244	250,3 50 — 201	223,6 57 — 176	203,0 62 — 161	190,3 66 — 151	181,4 70 — 144	175,7 72 — 139	172,9 75 — 134	167,4 77 — 130	164,7 79 — 126	159,5 81 — 123	154,4 82, 121
	18	356,6 39 — 258	294,0 49 — 205	258,5 56 — 178	231,0 62 — 162	216,5 66 — 151	203,0 70 — 143	196,5 73 — 137	190,3 75 — 134	187,3 77 — 130	181,4 79 — 126	167,4 81 — 123	162,2 82 — 121
	17	432,5 38 — 268	345,3 48 — 210	294,0 56 — 180	262,7 62 — 162	242,4 67 — 150	227,5 70 — 143	216,5 73 — 136	209,7 76 — 132	206,3 78 — 128	199,8 80 — 125
	16	516,5 36 — 279	399,1 47 — 214	339,8 55 — 181	298,7 62 — 162	271,2 67 — 150	254,6 71 — 141	238,5 74 — 134	231,0 77 — 131	227,5 79 — 127	209,7 81 — 124
	15	606,5 35 — 288	461,1 46 — 217	380,3 55 — 181	334,5 62 — 162	298,7 67 — 149	280,4 72 — 140	262,0 75 — 133	254,6 78 — 130	246,3 80 — 125
	14	712,3 34 — 294	524,8 46 — 218	425,7 55 — 181	368,2 63 — 160	329,1 68 — 147	303,6 73 — 137	289,3 76 — 131	280,1 79 — 126	250,3 81 — 124
	13	810,4 34 — 296	587,4 46 — 217	468,8 56 — 178	399,25 64 — 157	356,6 70 — 144	334,5 74 — 135	313,75 78 — 128	303,6 81 — 124
	12	908 34 — 295	647,6 47 — 213	508,6 57 — 175	432,6 65 — 154	386,5 71 — 140	356,6 76 — 131	345,3 81 — 124
	11	983 35 — 285	690,6 48 — 208	542 59 — 170	464,4 67 — 148	413,3 74 — 134	386,5 80 — 125
	10	1048 36 — 276	727,3 50 — 199	568,75 62 — 163	484,2 71 — 142	432,6 78 — 128
	9	1065 38 — 260	747,9 53 — 187	567,4 66 — 153	492 76 — 133
	8	1065 42 — 236	736,6 58 — 172	578 71 — 140
	7	999,25 48 — 208	691,25 68 — 153
	6	678,5 57 — 176
		5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
		Разница выживших от наибольшей и от наименьшей дозы

Примеры расчета количества МЕ в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

Таблица 6

Пример расчета иммуногенной активности вакцины

Препарат	Доза препарата в 0,5 мл			Количество выживших мышей/общее число зараженных в группе	Величины A/B и ED50 по таблице	ED50 (стандартные отклонения в опыте)
	Разведение	Количество исходного препарата, мл	Количество МЕ в иммунизирующей дозе
Референс-препарат	1:60	0,0167	0,5	14/16	27/11 71,3 72 — 139	0,0023 (0,00327 — 0,00169)
	1:300	0,0033	0,1	10/16
	1:1500	0,00066	0,02	3/16
Вакцина	1:28	0,0357		13/16	23/11 111,75 72 — 139	0,0079 (0,011 — 0,0057)
	1:140	0,0071		8/16
	1:700	0,00142		2/16

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении ED50 референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.

ED_{50}\text{референс} = \frac{71,3 \cdot 0,1}{100} = 0,0713\text{МЕ} ,

ED_{50}\text{макс}. = \frac{0,0713 \cdot 139}{100} = 0,0991\text{МЕ} ,

ED_{50}\text{мин} = \frac{0,0713 \cdot 72}{100} = 0,0513\text{МЕ} ,

ED_{50}\text{вакцины } = \frac{111,75 \cdot 0,0071}{100} = 0,0079\text{мл} ,

ED_{50}\text{макс}. = \frac{0,0079 \cdot 139}{100} = 0,011\text{мл} ,

ED_{50}\text{мин} = \frac{0,0079 \cdot 72}{100} = 0,0057\text{мл} .

Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:

X = \frac{ED_{50}\text{референс}}{ED_{50}\text{вакцины}} ,

X = \frac{0,0713}{0,0079} = 9,0\text{МЕ}/\text{мл} .

Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

R_{\text{мин}} = \frac{R}{K} ;

Rмакс = R·K,

где R — количество МЕ в 1 мл препарата;

Rмин — нижний предел доверительного интервала;

Rмакс — верхний предел доверительного интервала;

K — доверительный коэффициент.

K = \text{анти}lg \sqrt{(S_{1}^{2} + S_{2}^{2})} ,

где S1 = (lg ED50)макс. — lg ED50 для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия — 95 или 99%;

S2 = lg ED50 — (lg ED50)мин. для менее иммуногенного препарата.

Для примера:

K = 1,6

Отсюда:

R_{\text{мин}} = \frac{R}{K} ;\text{т}.\text{е}. \frac{9,0\text{МЕ}}{1,6} = 5,6\text{МЕ}

Rмакс = R·K; т.е. 9,0 МЕ·1,6 = 14,4 МЕ

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 МЕ.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Xгеом.) величины значения по формуле:

\text{Хгеом}. = \sqrt[n]{\text{П}_{\text{х}}} ,

где Пx — произведение усредняемых величин;

n — число определений.

Критерии достоверности теста:

• ED50 референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами;
• LD50 не превышает 1000 микробных клеток;
• заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 LD50;
• в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.

---