--- title: "\"ОФС.1.7.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток\"" number: "ОФС.1.7.2.0002.15" issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-7-2-0002-15" --- ## "ОФС.1.7.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток" # "ОФС.1.7.2.0002.15. Общая фармакопейная статья. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток" (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749) ("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II") > [!IMPORTANT] > В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. > Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.05.2021 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. **МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ** **ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ** | Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток | ОФС.1.7.2.0002.15 | | --- | --- | Настоящая общая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения. **ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ** Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона: 1. Специфическая активность 2. Подлинность Методы определения специфической активности и подлинности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом интерферона (СО). Испытания проводят с использованием соответствующих линий клеток, чувствительных к определенному типу интерферона и к индикаторному вирусу. Наиболее часто используют следующие комбинации клетка/вирус: - линия клеток карциномы легкого человека A-549, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия клеток карциномы гортани человека Hep-2c, линия клеток фибробластов мыши L-929/вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV); - клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия лимфоидных клеток человека Л-41, линия клеток карциномы легкого человека A-549, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/вирус везикулярного стоматита (VSV); - клетки фибробластов человека/вирус леса Семлики (SFV), вирус Синдбис (virus Sindbis) или иные. Выбор комбинации "клеточная культура/вирус" основывается на том, какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для определяемого типа интерферона. В качестве СО может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту. Испытания проводят в асептических условиях. Подготовка к испытаниям Клетки. Требования к клеточным линиям (общие условия культивирования и пересева клеток, пассаж, на котором клетки проявляют оптимальную эффективность при проведении испытания, допустимый предел жизнеспособности клеток при пересевах и при взятии клеточной суспензии в испытание, процент сформированного монослоя) указывают в нормативной документации. Испытуемые образцы препарата. Пробоподготовку испытуемых образцов проводят в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Для некоторых лекарственных форм препаратов интерферона (суппозитории, мази, гели и т.д.) при пробоподготовке необходимо экстрагирование активного вещества (интерферона) в раствор, с соблюдением следующих условий: используемые реагенты не должны оказывать токсического действия на культуру клеток в разведениях, необходимых для исследования; использование реагентов для экстрагирования должно быть обоснованным. Индикаторный вирус. Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями в нормативной документации на лекарственное средство, содержащее интерферон. Титр вируса должен быть не менее 105 ТЦД/мл. Реагенты и питательные среды. К составу питательных сред, предназначенных для культур клеток животных и человека, предъявляют определенные требования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Возможно использование стандартных коммерческих сред для ведения культур клеток: Игла MEM, MEM, DMEM (двойная модификация среды Игла), среды 199, среды RPMI и др. Для стимуляции роста, прикрепления и деления клеток обычно добавляют 5 - 10% инактивированной сыворотки коров/крупного рогатого скота. В среду для разведений интерферона добавляют 2 - 5% сыворотки. Для обеспечения бактериологической стерильности в питательные среды вводят антибиотики: пенициллин (натриевая соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) из расчета 100 - 200 ЕД каждого на 1 мл среды, микостатин (нистатин) из расчета 20 - 25 ЕД на 1 мл или гентамицин (конечная концентрация 10 мкг/мл). Содержание L-глютамина в питательной среде должно быть около 292 мг/л. В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки с добавлением антибиотиков и L-глютамина. Постоянство pH среды является одним из главных условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Диапазоны pH и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток. Оценить количество жизнеспособных клеток возможно при помощи красителей: метиленового синего, кристаллического фиолетового, тиазолинового синего (МТТ), Аламара голубого и других. Раздел 1. Специфическая активность Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО). Проведение испытания Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2 в лунках 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов. Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24 - 48 ч. Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведений интерферона с содержанием 2 - 5% сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации. Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее 4-х лунок с культурой клеток. Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесенным интерфероном. Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток - 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду. 96-луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2. Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса - 100 ТЦД50. В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды. Определение дозы вируса-индикатора Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности. Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от 10-1 до 10-8). Из лунок 96-луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. 96-луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2. За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50% лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах - ТЦД50/мл. Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле: $lgED_{50} = D_{max} + \frac{d}{n} \cdot (p - \frac{n}{2})$ , где: Lg ED50 - десятичный логарифм титра вируса; Dmax - десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% гибель клеток (+); d - десятичный логарифм интервала между разведениями (= 1,0); n - число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (= 4); p - число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100% гибель клеток, и последующих разведениях. После установления активности вируса производят подсчет дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ТЦД50). Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса). Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД50, и до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД50 с коэффициентом разведения равным 10. Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными. После внесения индикаторного вируса в дозе 100 ТЦД50 96-луночный планшет инкубируют в течение 24 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2 до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД50. Монослой в лунках с 0,1 ТЦД50 индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках. Учет активности интерферона осуществляют через 24 - 48 ч при выполнении следующих условий: - доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50; - в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80 - 100%); - в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации. Учет активности интерферона осуществляют визуально или инструментально. Визуальный учет активности интерферона производится микроскопически при 100-кратном увеличении через 24 - 48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса. Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле: $log_{2}ED_{50} = D_{max} + \frac{d}{n} \cdot (p - \frac{n}{2})$ , где: Dmax - двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% защита (-); d - двоичный логарифм интервала между разведениями (= 1,0); n - число лунок на каждую дозу (= 4); p - число лунок, давших защиту (-) в разведении, ниже которого произошла 100% защита, и последующих разведениях. Противовирусную активность интерферона (AX) в исследуемом образце в МЕ вычисляют по формуле: $A_{X} = \frac{A_{CO}}{a_{CO}} \cdot a_{X}$ , где: Aсо - противовирусная активность СО интерферона в МЕ; ax - титр ИП; aсо - титр СО. Инструментальный учет активности интерферона предполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий. Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения. При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия: - Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться в одном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса; - Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза-ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации. Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле: $A_{X} = \frac{A_{CO}}{a_{CO}} \cdot a_{X}$ , где: Aсо - противовирусная активность СО интерферона в МЕ; ax - титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50%-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом; aсо - титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50%-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом. Описание инструментального метода приводят в нормативной документации. Раздел 2. Подлинность Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности ИП моно- или поликлональными антителами против соответствующего типа интерферона, предусмотренными в нормативной документации на препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса. Проведение испытания Определение подлинности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток. Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя в условиях культивирования при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2 в течение 24 - 48 ч. Готовят рабочие дозы ИП и СО. Для этого их разводят средой для разведения интерферона с содержанием 2 - 5% сыворотки до одной десятой титра противовирусной активности ([раздел](#p100026) "Специфическая активность"). Нейтрализующие антитела разводят средой для разведения до концентраций, указанных в нормативной документации. Для приготовления нейтрализованной смеси подготовленные разведения антител объединяют в равных объемах с рабочими дозами ИП и СО. Полученную смесь инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2 в течение 1 ч. Из лунок 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток удаляют ростовую среду, вносят в лунки планшета нейтрализованную смесь, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение антител. Нейтрализованную смесь допустимо вносить в лунки 96-луночного планшета как до внесения культуры клеток, так и после него. Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции нейтрализации (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую среду на поддерживающую. Для контроля защитного действия интерферона также оставляют по 4 лунки на рабочие разведения СО и ИП без нейтрализующих антител. Проверяют дозу вируса-индикатора как описано в [разделе 1](#p100026) "Специфическая активность". Индикаторный вирус в дозе 100 ТЦД50 вносят во все лунки 96-луночного планшета, кроме 4 лунок, предназначенных для контроля монослоя клеток. После внесения индикаторного вируса в лунки с культурой клеток планшеты инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в атмосфере с (5,0 +/- 0,5)% CO2 до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 ТЦД50 (обычно в течение 24 - 48 ч). Монослой в лунках с 0,1 ТЦД50 индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках. Учет и интерпретация результатов Учет результатов осуществляют при выполнении следующих условий: - доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50; - отсутствуют признаки дегенерации в контроле клеток и в лунках с рабочими разведениями СО и ИП без нейтрализующих антител. Нейтрализация активности испытуемого образца антиинтерфероновыми антителами в сравнении с СО в аналогичном разведении свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа. Подробное описание проведения реакции нейтрализации приводят в нормативной документации. ---