---
title: "\"ОФС.1.2.4.0013.15. Общая фармакопейная статья. Определение активности ферментных лекарственных препаратов\""
number: "ОФС.1.2.4.0013.15"
issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-4-0013-15"
---

## "ОФС.1.2.4.0013.15. Общая фармакопейная статья. Определение активности ферментных лекарственных препаратов"

# "ОФС.1.2.4.0013.15. Общая фармакопейная статья. Определение активности ферментных лекарственных препаратов"

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)

("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

> [!IMPORTANT]
> В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018.
> Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 10.02.2021 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.


<a id="p100001"></a>**МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100002"></a>**ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ**


| <a id="p100003"></a>Определение активности ферментных лекарственных препаратов | <a id="p100004"></a>ОФС.1.2.4.0013.15 |
| --- | --- |


<a id="p100005"></a>Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на методы определения активности ферментов, которые основаны на определении скорости превращения субстратов для действия энзимов в соответствующие продукты ферментативной реакции, которые они катализируют.


## <a id="p100006"></a>Классификация ферментов


<a id="p100007"></a>Фермент (E) - белок, обладающий каталитическими свойствами в реакции преобразования субстрата (S) в продукт (P).
<a id="p100008"></a>Согласно международной номенклатуре (табл.), все ферменты подразделяются на 6 классов в зависимости от типа катализируемых ими реакций.

<a id="p100009"></a>Таблица

<a id="p100010"></a>Классификация ферментов


| <a id="p100011"></a>N п/п | <a id="p100012"></a>Название класса ферментов | <a id="p100013"></a>Типы катализируемых реакций |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100014"></a>1 | <a id="p100015"></a>Оксидоредуктазы | <a id="p100016"></a>Окислительно-восстановительные |
| <a id="p100017"></a>2 | <a id="p100018"></a>Трансферазы | <a id="p100019"></a>Перенос атомных групп и молекулярных остатков |
| <a id="p100020"></a>3 | <a id="p100021"></a>Гидролазы | <a id="p100022"></a>Гидролиз |
| <a id="p100023"></a>4 | <a id="p100024"></a>Лиазы | <a id="p100025"></a>Негидролитическое расщепление C-C, C-O, C-N, C-S, P-O связей, а также отщепление различных групп с замыканием двойной связи |
| <a id="p100026"></a>5 | <a id="p100027"></a>Изомеразы | <a id="p100028"></a>Изомеризация |
| <a id="p100029"></a>6 | <a id="p100030"></a>Лигазы | <a id="p100031"></a>Соединение 2 молекул с использованием высокоэнергетических соединений |


<a id="p100032"></a>Особенности измерения активности ферментов, описываемые в фармакопейных статьях, определяются их принадлежностью к тому или иному классу.
<a id="p100033"></a>Принцип, положенный в основу всех методов определения активности фермента (E), заключается в регистрации скорости убыли субстрата (S) (то есть вещества, на которое действует фермент) или скорости образования продукта реакции (P).
<a id="p100034"></a>Простейшей схемой для описания кинетики ферментативных реакций является так называемая двухстадийная схема:

<a id="p100035"></a> $E + S \rightleftarrows ES^{k_{\text{кат}}} \rightarrow E + \text{Р},$ (1)

<a id="p100036"></a>где E - фермент;
<a id="p100037"></a>S - субстрат;
<a id="p100038"></a>P - продукты реакции;
<a id="p100039"></a>kкат - каталитическая константа.
<a id="p100040"></a>Начальная скорость (v0) катализируемой ферментом реакции, при которой расходом субстрата можно пренебречь, описывается уравнением Михаэлиса-Ментен (2):

<a id="p100041"></a> $v_{0} = \frac{k_{\text{кат}} \cdot [E]_{0} \cdot [S]_{0}}{K_{\text{м}} + [S]_{0}} = \frac{V_{\text{макс}} \cdot [S]_{0}}{K_{\text{м}} + [S]_{0}} ,$ (2)

<a id="p100042"></a>где Vмакс = kкат x [E]0 - максимальная скорость реакции;
<a id="p100043"></a>[E]0 - начальная концентрация фермента;
<a id="p100044"></a>Kм - константа Михаэлиса.
<a id="p100045"></a>Для аллостерических ферментов начальная скорость ферментативной реакции не подчиняется [уравнению Михаэлиса-Ментен](#p100041).
<a id="p100046"></a>Для определения скорости ферментативной реакции через определенные промежутки времени отбирают пробы из реакционной смеси и проводят количественное определение методами, основанными чаще всего на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции.


## <a id="p100047"></a>Требования к условиям проведения ферментативной реакции


<a id="p100048"></a>Ферментативная реакция должна проводиться в строго определенных условиях с учетом следующих факторов.

1. <a id="p100049"></a>Начальная скорость реакции (v0). Скорость ферментативной реакции количественно можно измерить по убыли субстрата или по образованию продукта реакции.
<a id="p100050"></a>Типичные кинетические кривые ферментативной реакции приведены на [рис. 1](#p100052). Для каждой ферментативной реакции могут быть подобраны условия, при которых начальный участок кривой линеен, т.е. зависимость концентрации образовавшегося продукта или израсходованного субстрата от времени наблюдения имеет прямо пропорциональный характер.

<a id="p100051"></a> ![Требования к условиям проведения ферментативной реакции](https://i.bukva.ai/6m0sbX4V/img_0.png) 

<a id="p100052"></a>Рисунок 1 - Типичные кинетические кривые
ферментативной реакции:
А - регистрация по скорости исчезновения субстрата реакции;
Б - регистрация по скорости образования продукта реакции

<a id="p100053"></a>Начальная скорость реакции (v0) определяется как тангенс угла наклона линейного участка кривой.
<a id="p100054"></a>Поскольку длительность прямолинейного участка кинетической кривой от опыта к опыту несколько изменяется, время инкубации (при использовании метода отбора проб) должно составлять не более 70% и не менее 20% времени соответствующего прямолинейного участка.
2. <a id="p100055"></a>Концентрация субстрата ([S]0). В большинстве случаев зависимость начальной скорости ферментативной реакции (v0) от начальной концентрации субстрата ([S]0), согласно [уравнению Михаэлиса-Ментен (2)](#p100041) описывается гиперболической функцией (рис. 2).

<a id="p100056"></a> ![Требования к условиям проведения ферментативной реакции](https://i.bukva.ai/6m0sbX4V/img_1.png) 

<a id="p100057"></a>Рисунок 2 - Зависимость начальной скорости реакции v0
от начальной концентрации субстрата [S]0

<a id="p100058"></a>а - ферментативный процесс, подчиняющийся [уравнению Михаэлиса-Ментен](#p100041);
<a id="p100059"></a>б - процесс, для которого характерно ингибирование фермента субстратом;
<a id="p100060"></a>[S]0 - начальная концентрация субстрата;
<a id="p100061"></a>[S]нас - насыщающая концентрация субстрата;
<a id="p100062"></a>[S]опт - оптимальная концентрация субстрата;
<a id="p100063"></a>Vмакс - максимальная скорость реакции.

<a id="p100064"></a>Начальная скорость реакции (v0) зависит от начальной концентрации субстрата ([S]0) вплоть до его насыщающей концентрации. Под насыщающей концентрацией ([S]нас) понимают такую концентрацию субстрата, при которой начальная скорость реакции практически перестает повышаться при дальнейшем увеличении концентрации субстрата, стремясь к своему предельному значению, называемому максимальной скоростью реакции Vмакс [(рис. 2)](#p100057). Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой Kм. При проведении ферментативной реакции реакционная смесь должна содержать такое количество субстрата, которое обеспечит насыщение фермента в течение всего хода определения (количество субстрата, взятого для проведения ферментативной реакции, должно быть примерно на 30% выше насыщающей концентрации).
<a id="p100065"></a>Если форма кривой зависимости начальной скорости реакции (v0) от начальной концентрации субстрата ([S]0) отличается от гиперболической, определение параметров по [уравнению Михаэлиса-Ментен](#p100041) невозможно. Такие отклонения наблюдаются в случае ингибирования или активации фермента субстратом, а также при работе с аллостерическими ферментами. В этом случае оптимальной является та концентрация субстрата, при которой начальная скорость реакции максимальна ([S]опт) - точка перегиба на экспериментальной кривой зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата [(рис. 2)](#p100057).
<a id="p100066"></a>После выбора насыщающей концентрации субстрата необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.
<a id="p100067"></a>В качестве субстратов используются как природные вещества, такие как альбумин, казеин, крахмал, так и синтетические. Природные субстраты ферментов используют большей частью для подтверждения подлинности. Синтетические субстраты обеспечивают более высокую точность и лучшую воспроизводимость при количественном определении ферментативной активности.
3. <a id="p100068"></a>Концентрация фермента ([E]0). В соответствии с [уравнением Михаэлиса-Ментен](#p100041) начальная скорость ферментативной реакции (v0) в подавляющем большинстве случаев линейно зависит от концентрации фермента ([E]0). Выбор оптимальной для каждого метода концентрации фермента осуществляется экспериментально при помощи построения кривой зависимости начальной скорости реакции от концентрации фермента (рис. 3).

<a id="p100069"></a> ![Требования к условиям проведения ферментативной реакции](https://i.bukva.ai/6m0sbX4V/img_2.png) 

<a id="p100070"></a>Рисунок 3 - Зависимость начальной скорости реакции v0
от начальной концентрации фермента [E]0

<a id="p100071"></a>После выбора начальной концентрации фермента необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t при выбранном значении насыщающей концентрации субстрата.
4. <a id="p100072"></a>Температура. Особенностью ферментативных реакций является наличие колоколообразной зависимости скорости реакции от температуры в достаточно широком интервале температур, которая характеризуется "температурным оптимумом" реакции. Эта особенность объясняется наложением 2 эффектов: возрастанием скорости реакции при увеличении температуры и ускорением тепловой денатурации белковой молекулы, приводящей к инактивации фермента при достаточно высоких температурах. Обычно ферментативную реакцию рекомендуется проводить в термостате при температуре (37 +/- 0,1) °C, если нет иных указаний в фармакопейной статье. Предварительно каждый из реагентов нагревают до температуры 37 °C.
5. <a id="p100073"></a>Значение pH. Типичная кривая, описывающая для большинства ферментов pH-зависимость начальной скорости ферментативной реакции при наличии 2 ионогенных групп в активном центре фермента, приведена на рис. 4.

<a id="p100074"></a> ![Требования к условиям проведения ферментативной реакции](https://i.bukva.ai/6m0sbX4V/img_3.png) 

<a id="p100075"></a>Рисунок 4 - Зависимость начальной скорости реакции v0
от значения pH

<a id="p100076"></a>Определение активности следует проводить при оптимальном значении pH, определенном при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата; использовании буферного раствора того состава, который не ингибирует фермент и температуре (37 +/- 0,1) °C, если нет других указаний в фармакопейной статье.
<a id="p100077"></a>После выбора оптимального значения pH необходимо проверить, сохраняется ли при этом pH линейная зависимость [P] от t при выбранных значениях концентрации фермента и насыщающей концентрации субстрата.
6. <a id="p100078"></a>Кофакторы. Существуют ферменты, для проявления каталитических свойств которых необходимо присутствие кофакторов - веществ, с помощью которых происходит активация ферментов. Кофакторами могут выступать один или несколько неорганических ионов, таких как Fe2+, Mn2+, Mg2+, Zn2+ или комплексная органическая или металлорганическая молекула, называемая коферментом.
<a id="p100079"></a>Для определения оптимальной концентрации кофактора следует построить кривую зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации кофактора, аналогичную зависимости начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата, и по этой кривой выбрать насыщающую концентрацию кофактора.
<a id="p100080"></a>После выбора насыщающей концентрации кофактора необходимо проверить, сохраняется ли при ней линейная зависимость [P] от t.
<a id="p100081"></a>Конкретные параметры ферментативной реакции указываются в фармакопейных статьях.


## <a id="p100082"></a>Способы детекции


<a id="p100083"></a>Для количественной регистрации скорости ферментативной реакции используют спектрофотометрические, флюоресцентные, хеми- и биолюминесцентные методы детекции, основанные на спектральных свойствах субстрата или продукта реакции, а также детекцию с помощью микрокалориметрических датчиков и биодатчиков (биосенсоров) на основе хеми- и биолюминесценции; электрохимические методы, такие как потенциометрия, амперометрия и др. Для одних видов анализа детекция может проводиться непрерывно в ходе реакции, для других - после ее остановки.
<a id="p100084"></a>Способ остановки ферментативной реакции должен быть указан в фармакопейной статье.


## <a id="p100085"></a>Единицы измерения ферментативной активности


<a id="p100086"></a>Активность фермента измеряется количеством субстрата, преобразованного в продукт в единицу времени, и выражается в Международных единицах (МЕ) или единицах действия (ЕД).
<a id="p100087"></a>МЕ - это такое количество фермента, которое при заданных условиях катализирует превращение одного микромоля субстрата за 1 мин (или одного микроэквивалента затронутых реакцией групп в тех случаях, когда атакуется более одной группы в каждой молекуле субстрата).
<a id="p100088"></a>ЕД - это условная единица активности фермента, величина которой указывается в фармакопейной статье.
<a id="p100089"></a>Нормируются:
<a id="p100090"></a> $\cdot$ удельная активность препарата, которая выражается в единицах энзимной активности фермента (МЕ или ЕД) на 1 мг препарата или на 1 мг ферментного белка (в последнем случае удельная активность характеризует чистоту препарата). Определение содержания белка в препарате проводят одним из методов, приведенных в ОФС "Определение белка";
<a id="p100091"></a> $\cdot$ доза, которая выражается в единицах ферментативной активности (МЕ или ЕД) на единицу лекарственной формы.
<a id="p100092"></a>Перевод единиц активности ЕД в МЕ и обратно осуществляется опытным путем на основании статистически достаточного материала, обработанного в соответствии с [ОФС](https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-1-0014-15) "Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами".


## <a id="p100093"></a>Определение активности ферментных препаратов в сравнении со стандартным образцом (СО)


<a id="p100094"></a>С целью снижения погрешности методов определения ферментативной активности необходимо проводить определение ферментативной активности препарата в сравнении со стандартным образцом (СО) данного фермента.
<a id="p100095"></a>Определение ферментативной активности испытуемого препарата и СО проводят в одинаковых условиях опыта.
<a id="p100096"></a>Активность препарата (А) в соответствующих единицах (МЕ или ЕД) вычисляют по формуле:

<a id="p100097"></a> $\text{А } = \frac{\text{А}_{0}}{\text{П}_{0}} \cdot \text{П } \cdot K,$ 

<a id="p100098"></a>где: А0 - ферментативная активность СО в единицах (МЕ или ЕД) на 1 мг белка или препарата;
<a id="p100099"></a>П0 - величина измеряемого параметра для СО;
<a id="p100100"></a>П - величина измеряемого параметра для испытуемого препарата;
<a id="p100101"></a>K - коэффициент, выравнивающий концентрации растворов испытуемого препарата и СО.


## <a id="p100102"></a>Определение активности иммобилизованных ферментов


<a id="p100103"></a>Иммобилизованными называются ферменты, молекулы которых физически или химически связаны с каким-либо носителем. В качестве носителей могут быть использованы природные и синтетические полимеры, органические низкомолекулярные носители, неорганические материалы. В зависимости от природы носителя иммобилизованные ферменты могут существовать в форме гелей, пленок, гранул, макропористых порошков и в других формах.
<a id="p100104"></a>Активность иммобилизованных ферментов может нормироваться на массу носителя или его площадь.
<a id="p100105"></a>Кинетические характеристики иммобилизованных ферментов, численно определяемые константой Михаэлиса Kм и каталитической константой kкат, могут существенно изменяться в зависимости от природы носителя и способа иммобилизации. Поэтому для корректного определения активности иммобилизованных ферментов необходим повторный подбор условий.



<a id="p100106"></a>

---