---
title: "\"ОФС.1.2.4.0012.15. Общая фармакопейная статья. Определение содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах микробиологическим методом\""
number: "ОФС.1.2.4.0012.15"
issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-4-0012-15"
---

## "ОФС.1.2.4.0012.15. Общая фармакопейная статья. Определение содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах микробиологическим методом"

# "ОФС.1.2.4.0012.15. Общая фармакопейная статья. Определение содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах микробиологическим методом"

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)

("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I")

> [!IMPORTANT]
> В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018.
> Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.03.2019 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.


<a id="p100001"></a>**МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100002"></a>**ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ**


<table>
<colgroup><col width="56%"><col width="44%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100003"></a>Определение содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах микробиологическим методом</td><td><a id="p100004"></a>ОФС.1.2.4.0012.15</td></tr>
<tr><td><a id="p100005"></a>Вводится впервые</td></tr>
</table>


<a id="p100006"></a>Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод микробиологического определения количественного содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах. Его осуществляют чашечным или пробирочным методами с использованием указанных ниже тест-штаммов микроорганизмов.


## <a id="p100007"></a>Определение количественного содержания витаминов чашечным методом


<a id="p100008"></a>Тест-штаммы микроорганизмов. Для определения содержания цианокобаламина (C<sub>63</sub>H<sub>88</sub>CoN<sub>14</sub>O<sub>14</sub>P) используют штамм Escherichia coli 113-3 (АТСС 11105).
<a id="p100009"></a>Выполнение испытания
<a id="p100010"></a>Точную навеску порошка растертых драже или таблеток испытуемого препарата, указанную в соответствующих фармакопейных статьях, количественно переносят в мерную колбу определенной вместимости, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют. Из полученного раствора готовят разведение 1% раствором натрия цитрата [<а>](#p100277) так, чтобы концентрация раствора для испытания была близкой к контрольной концентрации раствора стандартного образца (СО) цианокобаламина - 0,05 мкг/мл.
<a id="p100011"></a>В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3 чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на строго горизонтальной поверхности (регулируют по ватерпасу), разливают по 10 - 12 мл расплавленной и охлажденной до температуры 48 - 50 °C основной среды, засеянной суспензией Escherichia coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды в каждой чашке стерильным бором по трафарету делают лунки в агаре: 6 лунок диаметром 8 мм под углом 60° друг к другу.
<a id="p100012"></a>В 3 лунки (через одну) каждой из 6 чашек, используемых для построения стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора СО контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В 3 лунки (через одну) каждой из 3 чашек препарата вносят по 0,1 мл одной из концентраций остальных растворов СО, а также раствора испытуемого препарата. Чашки инкубируют при температуре 37 °C в течение 16 - 18 ч.
<a id="p100013"></a>По окончании инкубации измеряют диаметры зон стимуляции роста тест-микроорганизма для каждой концентрации растворов СО. После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т.е. 9 зон. Затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной концентрации, учитывая все чашки (27 зон).
<a id="p100014"></a>По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл), рассчитанной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации раствора СО, полученной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.
<a id="p100015"></a>Содержание цианокобаламина в 1 драже или 1 таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

<a id="p100016"></a> $\text{Х } = \frac{\text{С } \cdot \text{б} \cdot \text{К}}{\text{а} \cdot 10^{6}}$ 

<a id="p100017"></a>где: C - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора, найденное по стандартной кривой, мкг;
<a id="p100018"></a>К - коэффициент разведения;
<a id="p100019"></a>а - навеска препарата в граммах или количество таблеток;
<a id="p100020"></a>б - средняя масса одной таблетки, г;
<a id="p100021"></a>106 - коэффициент для пересчета в граммы.
<a id="p100022"></a>Построение стандартной (калибровочной) кривой. По исправленным значениям величин зон стимуляции роста при добавлении приготовленных концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации на всех чашках строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а на оси ординат соответствующие им величины диаметров зон роста. По полученным точкам строят стандартную кривую, находят концентрацию цианокобаламина в мкг/мл и вычисляют его содержание в образце.
<a id="p100023"></a>Примечания.
1. <a id="p100024"></a>Приготовление основного раствора СО цианокобаламина 100 мкг/мл. В мерной колбе вместимостью 250 мл в 25% спирте растворяют 0,0250 г СО цианокобаламина (в пересчете на сухое вещество), доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор годен к использованию в течение 2 мес при температуре 2 - 8 °C во флаконе темного стекла с притертой пробкой.
2. <a id="p100025"></a>Приготовление рабочего раствора СО цианокобаламина 1 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл основного раствора СО цианокобаламина и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Раствор годен в течение 5 сут при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100026"></a>Растворы, содержащие цианокобаламин, не должны подвергаться воздействию прямых солнечных лучей.
<a id="p100027"></a>Из рабочего раствора СО цианокобаламина в день исследования готовят растворы, содержащие 0,025; 0,050 и 0,075 мкг цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5,0 и 7,5 мл рабочего раствора СО помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.
<a id="p100028"></a>Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают за раствор СО контрольной концентрации.
3. <a id="p100029"></a>Хранение и подготовка тест-культуры для анализа. Культуру тест-микроорганизма выращивают на скошенной агаризованной среде при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 16 - 18 ч. Тест-культуру хранят при температуре 2 - 8 °C, пересевая не реже одного раза в месяц.
<a id="p100030"></a>Состав среды для хранения тест-микроорганизма:


| <a id="p100031"></a>- казеиновый кислотный гидролизат 10% | <a id="p100032"></a>6 мл [<б>](#p100278) |
| --- | --- |
| <a id="p100033"></a>- калия фосфат двузамещенный | <a id="p100034"></a>0,02 г |
| <a id="p100035"></a>- железа сульфат | <a id="p100036"></a>0,0005 г |
| <a id="p100037"></a>- магния сульфат | <a id="p100038"></a>0,02 г |
| <a id="p100039"></a>- L-аспарагин | <a id="p100040"></a>0,02 г |
| <a id="p100041"></a>- глицерин | <a id="p100042"></a>0,2 г |
| <a id="p100043"></a>- агар микробиологический | <a id="p100044"></a>1,5 г |
| <a id="p100045"></a>- цианокобаламин | <a id="p100046"></a>10 мкг |
| <a id="p100047"></a>- вода очищенная | <a id="p100048"></a>до 100 мл |


<a id="p100049"></a>pH среды до стерилизации (7,0 +/- 0,2)
<a id="p100050"></a>Приготовление среды. Ингредиенты (гидролизат казеина и соли) последовательно растворяют в воде. Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с добавлением 2 капель 1 М раствора хлористоводородной кислоты при слабом нагревании и добавляют к раствору солей. Устанавливают pH 7,0 полученной смеси 15% раствором натрия гидроксида, после чего доводят объем среды водой очищенной до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара микробиологического. Смесь нагревают на водяной бане до полного растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина.
<a id="p100051"></a>За 1 сут до проведения испытания тест-микроорганизм пересевают на пептонно-солевую среду следующего состава:
<a id="p100052"></a>А) Пептонно-солевая среда агаризованная:


| <a id="p100053"></a>- пептон ферментативный сухой | <a id="p100054"></a>2,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100055"></a>- натрия хлорид | <a id="p100056"></a>0,5 г |
| <a id="p100057"></a>- агар микробиологический | <a id="p100058"></a>1,8 г |
| <a id="p100059"></a>- вода очищенная | <a id="p100060"></a>до 100 мл |


<a id="p100061"></a>Б) Пептонно-солевая среда жидкая:


| <a id="p100062"></a>- пептон ферментативный сухой | <a id="p100063"></a>2,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100064"></a>- натрия хлорид | <a id="p100065"></a>0,5 г |
| <a id="p100066"></a>- вода очищенная | <a id="p100067"></a>до 100 мл |


<a id="p100068"></a>pH среды до стерилизации (7,0 +/- 0,2).
<a id="p100069"></a>Приготовление сред. Жидкую и агаризованную среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 15 мин. Для получения скошенного агара среду охлаждают в наклонном положении. На обе среды делают посев тест-культуры E. coli из рабочего музея и инкубируют в течение 16 - 18 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) °C и используют для приготовления посевного материала.
4. <a id="p100070"></a>Состав и приготовление основной среды.
<a id="p100071"></a>Состав основной среды:


| <a id="p100072"></a>- аммония хлорид | <a id="p100073"></a>2,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100074"></a>- натрия хлорид | <a id="p100075"></a>3,0 г |
| <a id="p100076"></a>- калия фосфат двузамещенный | <a id="p100077"></a>0,4 г |
| <a id="p100078"></a>- натрия цитрат трехзамещенный | <a id="p100079"></a>3,0 г |
| <a id="p100080"></a>- лактоза | <a id="p100081"></a>3,0 г |
| <a id="p100082"></a>- агар микробиологический | <a id="p100083"></a>15,0 г |
| <a id="p100084"></a>- вода очищенная | <a id="p100085"></a>до 1000 мл |


<a id="p100086"></a>pH среды до стерилизации (7,0 +/- 0,2)
<a id="p100087"></a>Приготовление среды. Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным водяным паром при температуре 120 - 121 °C в течение 15 мин. Хранят при температуре 2 - 8 °C не более 2 мес.
<a id="p100088"></a>Перед розливом в чашки Петри на каждые 200 мл расплавленной среды добавляют по 5 мл стерильного 40% раствора глюкозы. Раствор глюкозы стерилизуют при температуре 120 - 121 °C в течение 10 мин.
5. <a id="p100089"></a>Приготовление посевного материала. Со скошенного пептонно-солевого агара [(А)](#p100052) делают смыв суточной тест-культуры 0,9% раствором натрия хлорида или используют бульонную культуру с жидкой питательной среды [(Б)](#p100061). Плотность микробной взвеси должна быть (1 - 2)109 КОЕ/мл.

<a id="p100090"></a>Вся работа должна выполняться в асептических условиях. В работе используют только химически чистую лабораторную посуду.


## <a id="p100091"></a>Определение содержания витаминов пробирочным методом


<a id="p100092"></a>Пробирочный метод используют для определения количественного содержания D-биотина (C<sub>10</sub>H<sub>16</sub>N<sub>2</sub>S), кальция пантотената (C<sub>18</sub>H<sub>32</sub>CaN<sub>2</sub>O<sub>10</sub>), фолиевой кислоты (C19H19N7O6), никотиновой кислоты (или никотинамида) в многокомпонентных препаратах.
<a id="p100093"></a>Тест-штаммы микроорганизмов
- <a id="p100094"></a>Lactobacillus plantarum ВКМ В-578 (АТСС 8014) используют для определения D-биотина, кальция пантотената и кислоты никотиновой (или никотинамида);
- <a id="p100095"></a>Enteroccocus faecalis (E. faecium) ВКМ В-602 применяют для определения фолиевой кислоты.
<a id="p100096"></a>Выполнение испытания
<a id="p100097"></a>Точную навеску порошка растертых драже или таблеток, указанную в соответствующих фармакопейных статьях или в нормативной документации, количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют (основной раствор).
<a id="p100098"></a>Готовят растворы рабочих стандартных и испытуемых образцов. Для этого в 2 - 3 ряда пробирок одинакового размера разливают по 1 мл свежеприготовленной воды очищенной. Образцы в количестве 1 мл с концентрацией D-биотина около 0,002 мкг/мл, кальция пантотената - 0,2 мкг/мл, фолиевой кислоты - 0,004 мкг/мл, никотиновой кислоты (или никотинамида) - 0,32 мкг/мл вносят в первые пробирки соответствующих рядов и делают 6 последовательных разведений в каждом ряду, перемешивая и перенося 1 мл раствора в следующие пробирки ряда; из последней отбирают 1 мл и удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл основной среды. При этом общий объем полученных растворов в каждой пробирке должен быть равен 2 мл.
<a id="p100099"></a>В каждом ряду ставят отрицательный контроль, содержащий 1 мл воды очищенной и 1 мл основной среды.
<a id="p100100"></a>Все пробирки стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 10 - 15 мин. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,1 мл разведенной взвеси тест-культуры [(п. 5)](#p100253).
<a id="p100101"></a>Засеянные пробирки инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 16 - 24 ч. Интенсивность роста тест-культуры в пробирках стандартного и испытуемого образцов измеряют на фотометре-нефелометре при длине волны около 540 нм.
<a id="p100102"></a>Содержание определяемого витамина в одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

<a id="p100103"></a> $\text{Х } = \frac{\text{С } \cdot \text{б} \cdot V \cdot V_{1}}{\text{а} \cdot V_{2} \cdot 10^{6}}$ 

<a id="p100104"></a>где C - среднеарифметическое содержание D-биотина в 1 мл, найденное по стандартной кривой для шести концентраций растворов испытуемого образца с учетом всех разведений (4; 8; 16; 32; 64 и 128), в мкг;
<a id="p100105"></a>V, V<sub>1</sub>, V<sub>2</sub> - разведения, мл;
<a id="p100106"></a>а - навеска испытуемого образца в граммах или количество таблеток;
<a id="p100107"></a>б - средняя масса одной таблетки, г;
<a id="p100108"></a>106 - коэффициент для пересчета, г.
<a id="p100109"></a>Примечания.
<a id="p100110"></a>Приготовление рабочих растворов СО витаминов
1. <a id="p100111"></a>СО D-биотина. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 200 мл 25% спирта, в котором растворяют 0,0010 г D-биотина на кипящей водяной бане. После охлаждения объем раствора доводят тем же растворителем до метки (основной раствор) и перемешивают. В 1 мл основного раствора содержится 2 мкг D-биотина.
<a id="p100112"></a>В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,002 мкг D-биотина в 1 мл. Содержание D-биотина в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,0005; 0,00025; 0,000125; 0,0000625; 0,000031; 0,0000156 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.
2. <a id="p100113"></a>СО кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 50 мл в 25% спирте растворяют 0,050 г кальция пантотената (в пересчете на сухое вещество по содержанию азота) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 1 мг кальция пантотената.
<a id="p100114"></a>В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,2 мкг кальция пантотената в 1 мл. Содержание кальция пантотената в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,0031; 0,00156 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.
3. <a id="p100115"></a>СО фолиевой кислоты. В мерной колбе вместимостью 100 мл в 5 мл 1% раствора натрия двууглекислого [<в>](#p100280) растворяют 0,0100 г фолиевой кислоты, доводят объем водой очищенной до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг фолиевой кислоты.
<a id="p100116"></a>В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл полученного раствора, доводят объем раствора водой очищенной до метки.
<a id="p100117"></a>10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,004 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.
<a id="p100118"></a>Содержание фолиевой кислоты в стандартном ряду при приготовлении разведений должно соответствовать 0,001; 0,0005; 0,00025, 0,000125; 0,0000625; 0,00003125 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.
4. <a id="p100119"></a>СО никотиновой кислоты (или никотинамида). В мерной колбе вместимостью 100 мл в 25% спирте растворяют 0,0100 г никотиновой кислоты (или никотинамида) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг никотиновой кислоты или никотинамида. Раствор хранят при температуре 2 - 8 °C не более 1 мес.
<a id="p100120"></a>В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. 4 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. Рабочий раствор содержит 32 мкг/мл никотиновой кислоты или никотинамида.
<a id="p100121"></a>Содержание кислоты никотиновой или никотинамида в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,08; 0,04; 0,02; 0,01; 0,005 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.
<a id="p100122"></a>Растворы годны к использованию в течение 2 - 3 мес при хранении в емкости с притертой пробкой при температуре 2 - 8 °C.
2. <a id="p100123"></a>Построение стандартной кривой. На оси абсцисс откладывают содержание определяемого витамина (в мкг/мл) в пробирках стандартного ряда, а на оси ординат - соответствующие им значения процента светопропускания. По полученным точкам вычерчивают стандартную кривую, находят концентрацию соответствующих витаминов в мкг/мл и вычисляют их содержание в образце.
3. <a id="p100124"></a>Хранение и подготовка тест-культуры для анализа

#### <a id="p100125"></a>3.1 L. plantarum ВКМ В-578 (АТСС 8014) поддерживают на питательной среде следующего состава:



| <a id="p100126"></a>- дрожжевой экстракт | <a id="p100127"></a>2,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100128"></a>- пептон | <a id="p100129"></a>0,5 г |
| <a id="p100130"></a>- глюкоза | <a id="p100131"></a>0,5 г |
| <a id="p100132"></a>- натрия ацетат | <a id="p100133"></a>0,5 г |
| <a id="p100134"></a>- твин-80 | <a id="p100135"></a>0,01 г |
| <a id="p100136"></a>- агар микробиологический | <a id="p100137"></a>1,6 г |
| <a id="p100138"></a>- вода очищенная | <a id="p100139"></a>до 100 мл |


<a id="p100140"></a>pH (6,8 +/- 0,2)

#### <a id="p100141"></a>3.2 E. faecalis ВКМ В-602 поддерживают на питательной среде следующего состава:



| <a id="p100142"></a>- дрожжевой экстракт | <a id="p100143"></a>1,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100144"></a>- глюкоза | <a id="p100145"></a>0,5 г |
| <a id="p100146"></a>- натрия ацетат | <a id="p100147"></a>0,5 г |
| <a id="p100148"></a>- агар микробиологический | <a id="p100149"></a>1,8 г |
| <a id="p100150"></a>- вода очищенная | <a id="p100151"></a>до 100 мл |


<a id="p100152"></a>pH (6,8 +/- 0,2).
<a id="p100153"></a>Ингредиенты последовательно растворяют в воде, устанавливают требуемое значение pH 6,8 и доводят объем водой очищенной до 100 мл. Смесь нагревают при перемешивании на кипящей водяной бане до полного растворения агара, разливают по 5 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 10 - 15 мин, охлаждают в наклонном положении для получения скошенной поверхности агара.
<a id="p100154"></a>Посевы инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 16 - 24 ч. Тест-культуру хранят при температуре 2 - 8 °C, пересевая не реже одного раза в мес.
<a id="p100155"></a>Примечания.
<a id="p100156"></a>Состав и приготовление основной среды
1. <a id="p100157"></a>Состав среды для определения содержания D-биотина:


| <a id="p100158"></a>- глюкоза | <a id="p100159"></a>40 г |
| --- | --- |
| <a id="p100160"></a>- натрия ацетат | <a id="p100161"></a>20 г |
| <a id="p100162"></a>- раствор гидролизата казеина 10% | <a id="p100163"></a>100 мл [<б>](#p100278) |
| <a id="p100164"></a>- раствор L-цистина и D, L-триптофана | <a id="p100165"></a>100 мл [<г>](#p100281) |
| <a id="p100166"></a>- раствор твина-80 | <a id="p100167"></a>1 мл [<д>](#p100282) |
| <a id="p100168"></a>- раствор аденина, гуанина и урацила | <a id="p100169"></a>10 мл [<е>](#p100283) |
| <a id="p100170"></a>- раствор кальция пантотената и тиамина | <a id="p100171"></a>20 мл [<ж>](#p100284) |
| <a id="p100172"></a>- раствор рибофлавина | <a id="p100173"></a>40 мл [<з>](#p100285) |
| <a id="p100174"></a>- раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты | <a id="p100175"></a>20 мл [<и>](#p100286) |
| <a id="p100176"></a>- растворы солей А [<к>](#p100287) и солей Б [<л>](#p100288) | <a id="p100177"></a>по 10 мл |
| <a id="p100178"></a>- вода очищенная | <a id="p100179"></a>до 1000 мл |


<a id="p100180"></a>pH (6,8 +/- 0,2)
2. <a id="p100181"></a>Состав среды для определения содержания кальция пантотената:


| <a id="p100182"></a>- глюкоза | <a id="p100183"></a>40 г |
| --- | --- |
| <a id="p100184"></a>- натрия ацетат | <a id="p100185"></a>20 г |
| <a id="p100186"></a>- раствор гидролизата казеина [<б>](#p100278) | <a id="p100187"></a>100 мл |
| <a id="p100188"></a>- раствор L-цистина и D, L-триптофана [<г>](#p100281) | <a id="p100189"></a>100 мл |
| <a id="p100190"></a>- раствор твина-80 [<д>](#p100282) | <a id="p100191"></a>1 мл |
| <a id="p100192"></a>- раствор аденина, гуанина, урацила [<е>](#p100283) | <a id="p100193"></a>20 мл |
| <a id="p100194"></a>- раствор рибофлавина, тиамина, D-биотина [<м>](#p100290) | <a id="p100195"></a>20 мл |
| <a id="p100196"></a>- раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты [<и>](#p100286) | <a id="p100197"></a>20 мл |
| <a id="p100198"></a>- растворы солей А [<к>](#p100287) и солей Б [<л>](#p100288) | <a id="p100199"></a>по 20 мл |
| <a id="p100200"></a>- вода очищенная | <a id="p100201"></a>до 1000 мл |


<a id="p100202"></a>pH (6,8 +/- 0,2)
3. <a id="p100203"></a>Состав среды для определения содержания фолиевой кислоты:


| <a id="p100204"></a>- глюкоза | <a id="p100205"></a>40 г |
| --- | --- |
| <a id="p100206"></a>- натрия цитрат [<а>](#p100277) | <a id="p100207"></a>20 г |
| <a id="p100208"></a>- раствор гидролизата казеина [<б>](#p100278) | <a id="p100209"></a>120 мл |
| <a id="p100210"></a>- раствор L-цистина, D,L-триптофана, L-аспарагина [<н>](#p100291) | <a id="p100211"></a>100 мл |
| <a id="p100212"></a>- раствор аденина, гуанина, урацила и ксантина [<о>](#p100292) | <a id="p100213"></a>10 мл |
| <a id="p100214"></a>- раствор тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты [<п>](#p100293) | <a id="p100215"></a>10 мл |
| <a id="p100216"></a>- раствор кальция пантотената [<р>](#p100294) | <a id="p100217"></a>8 мл |
| <a id="p100218"></a>- раствор пиридоксина [<с>](#p100295) | <a id="p100219"></a>24 мл |
| <a id="p100220"></a>- раствор ПАБК [<т>](#p100296) | <a id="p100221"></a>10 мл |
| <a id="p100222"></a>- раствор биотина [<у>](#p100297) | <a id="p100223"></a>0,5 мл |
| <a id="p100224"></a>- раствор солей Б [<л>](#p100288) | <a id="p100225"></a>10 мл |
| <a id="p100226"></a>- вода очищенная | <a id="p100227"></a>до 1000 мл |


<a id="p100228"></a>pH (6,8 +/- 0,2).
4. <a id="p100229"></a>Состав среды для определения содержания никотиновой кислоты (никотинамида):


| <a id="p100230"></a>- глюкоза | <a id="p100231"></a>40 г |
| --- | --- |
| <a id="p100232"></a>- натрия ацетат | <a id="p100233"></a>20 г |
| <a id="p100234"></a>- раствор гидролизата казеина [<б>](#p100278) | <a id="p100235"></a>100 мл |
| <a id="p100236"></a>- раствор аденина, гуанина, урацила [<е>](#p100283) | <a id="p100237"></a>10 мл |
| <a id="p100238"></a>- раствор L-цистина и D, L-триптофана [<г>](#p100281) | <a id="p100239"></a>100 мл |
| <a id="p100240"></a>- раствор тиамина и кальция пантотената [<ж>](#p100284) | <a id="p100241"></a>2 мл |
| <a id="p100242"></a>- раствор рибофлавина [<з>](#p100285) | <a id="p100243"></a>8 мл |
| <a id="p100244"></a>- раствор пиридоксина и ПАБК [<ф>](#p100298) | <a id="p100245"></a>2 мл |
| <a id="p100246"></a>- раствор биотина [<у>](#p100297) | <a id="p100247"></a>4 мл |
| <a id="p100248"></a>- растворы солей А [<к>](#p100287) и солей Б [<л>](#p100288) | <a id="p100249"></a>по 10 мл |
| <a id="p100250"></a>- вода очищенная | <a id="p100251"></a>до 1000 мл |


<a id="p100252"></a>pH (6,8 +/- 0,2)
5. <a id="p100253"></a>Приготовление питательных сред для определения содержания витаминов. Глюкозу предварительно обрабатывают углем активированным осветляющим. Для этого к 200 мл 20% раствора глюкозы добавляют 10 г угля, встряхивают в течение 40 мин и фильтруют через плотный бумажный фильтр. К раствору глюкозы добавляют остальные растворы, устанавливают pH 6,8 и доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл. Среду нагревают на кипящей водяной бане 5 мин, охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр. Готовую среду разливают по 70 мл в колбы вместимостью 100 мл, закрывают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 - 25 °C в течение 3 мес. Перед использованием среду размораживают при комнатной температуре.


## <a id="p100254"></a>Приготовление посевного материала


<a id="p100255"></a>Для приготовления посевного материала используют один из нижеприведенных способов:
1) <a id="p100256"></a>За 1 сут до испытания тест-микроорганизм пересевают на питательную среду соответствующего состава [(п. 3)](#p100029) и инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 16 - 24 ч. Клетки отделяют центрифугированием в асептических условиях, надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в 10 мл стерильного раствора натрия хлорида [<х>](#p100299). Вносят 0,05 мл полученной суспензии в 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Мутность используемой суспензии должна быть (90 +/- 1)% по шкале светопропускания фотометра-нефелометра при длине волны около 540 нм.
2) <a id="p100257"></a>При определении D-биотина, кальция пантотената и никотиновой кислоты (или никотинамида) за 1 сут до испытания небольшое количество исходной тест-культуры L. plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014) пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду для лактобактерий [(п. 3.1)](#p100125). Инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 16 - 24 ч. После этого культуру смывают стерильным раствором натрия хлорида и доводят содержание микробных клеток до 109 КОЕ/мл по оптическому стандарту мутности. Затем переносят 0,2 мл взвеси в пробирку с 9,0 мл раствора натрия хлорида, перемешивают и используют в качестве посевного материала для внесения в основную питательную среду (пп. 4.1, 4.2 и 4.4).
<a id="p100258"></a>Enteroccocus faecalis (faecium) ВКМ В-602 пересевают в жидкую питательную среду следующего состава:


| <a id="p100259"></a>- дрожжевой экстракт | <a id="p100260"></a>2,0 г |
| --- | --- |
| <a id="p100261"></a>- пептон | <a id="p100262"></a>0,5 г |
| <a id="p100263"></a>- глюкоза | <a id="p100264"></a>0,5 г |
| <a id="p100265"></a>- натрия ацетат | <a id="p100266"></a>0,5 г |
| <a id="p100267"></a>- твин-80 | <a id="p100268"></a>0,01 г |
| <a id="p100269"></a>- вода очищенная | <a id="p100270"></a>до 100 мл |


<a id="p100271"></a>pH (6,8 +/- 0,2).
<a id="p100272"></a>Готовую среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 10 - 15 мин.
<a id="p100273"></a>Последующие этапы работы проводят по той же схеме, что и для L. plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014).
<a id="p100274"></a>При испытании допускается использование коммерческих сухих стандартных питательных сред известных производителей.
<a id="p100275"></a>В работе используют только химически чистую лабораторную посуду.
<a id="p100276"></a>Примечания.
<a id="p100277"></a>а) Приготовление 1% раствора натрия цитрата. В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 10 г натрия цитрата и доводят объем раствора водой до метки. Раствор годен к использованию в течение 7 сут в условиях хранения при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100278"></a>б) Приготовление 10% раствора кислотного гидролизата казеина (свободного от витаминов). При приготовлении среды для хранения культуры можно использовать коммерческий сухой солянокислый гидролизат казеина в соответствующем количестве или 10% казеиновый кислотный гидролизат, для которого используют казеин размолотый.
<a id="p100279"></a>В круглодонной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 100 г казеина размолотого с 500 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты [<ц>](#p100300). Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5 - 8 ч растворения казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому остатку прибавляют 300 мл воды очищенной, перемешивают и снова отгоняют до получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды. Далее растворяют оставшуюся массу в 100 мл воды, доводят pH раствора до 3,5 с помощью 30% раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой очищенной до 1000 мл. К готовому раствору прибавляют 20 г угля активированного, встряхивают в течение 1 ч, фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем повторяют, получают бесцветный или светло-желтый раствор, который разливают во флаконы по 100 мл, и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 15 мин. Хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100280"></a>в) Приготовление 1% раствора натрия двууглекислого. Растворяют в 100 мл воды очищенной 1 г натрия двууглекислого и хранят при температуре 2 - 8 °C не более 1 нед.
<a id="p100281"></a>г) Приготовление раствора L-цистина и D,L-триптофана. В мерной колбе вместимостью 500 мл в 20 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты [<ц>](#p100300) растворяют 1 г L-цистина и 1 г D,L-триптофана (или 0,5 г L-триптофана), нагревают до 70 - 80 °C, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем доводят водой очищенной до метки и хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100282"></a>д) Приготовление раствора твина-80. Растворяют 2,5 г твина-80 в 25 мл спирта. Хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100283"></a>е) Приготовление раствора аденина, гуанина и урацила. По 0,2 г аденина сульфата, гуанина и урацила растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл с добавлением 10 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты [<ц>](#p100300) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят объем водой очищенной до метки и хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 1 мес.
<a id="p100284"></a>ж) Приготовление раствора кальция пантотената и тиамина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг кальция пантотената и 5 мг тиамина хлорида в 25 мл 25% спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 2 нед.
<a id="p100285"></a>з) Приготовление раствора рибофлавина. В мерной колбе вместимостью 200 мл растворяют 10 мг рибофлавина в небольшом количестве воды с добавлением 1 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2 - 8 °C в течение 2 нед.
<a id="p100286"></a>и) Приготовление раствора пара-аминобензойной кислоты (ПАБК), никотиновой кислоты и пиридоксина. Раствор готовят в 25% спирте из расчета, чтобы в 1 мл содержалось 10 мкг ПАБК, 40 мкг никотиновой кислоты и 20 мкг пиридоксина гидрохлорида. Раствор хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 2 нед.
<a id="p100287"></a>к) Приготовление раствора солей А. Растворяют 5 г калия фосфата однозамещенного и 5 г калия фосфата двузамещенного в 50 мл воды очищенной.
<a id="p100288"></a>л) Приготовление раствора солей Б. Растворяют 1 г магния сульфата, 0,05 г натрия хлорида, 0,01 г железа сульфата и 0,05 г марганца сульфата в 50 мл воды очищенной.
<a id="p100289"></a>Растворы солей А и Б хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100290"></a>м) Приготовление раствора рибофлавина, тиамина и D-биотина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 20 мг рибофлавина, 10 мг тиамина хлорида и 4 мг D-биотина в 50 мл раствора 0,02 М уксусной кислоты, объем доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100291"></a>н) Приготовление раствора L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина. По 1 г L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина растворяют в 200 мл воде очищенной с добавлением 20 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты [<ц>](#p100300) в мерной колбе вместимостью 500 мл, нагревают до 70 - 80 °C, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем раствора доводят водой до метки и хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100292"></a>о) Приготовление раствора аденина, гуанина, урацила и ксантина. По 0,1 г аденина сульфата, гуанина хлорида, урацила и ксантина растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл с добавлением 10 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты [<ц>](#p100300) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят объем водой очищенной до метки и хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100293"></a>п) Приготовление раствора тиамина, рибофлавина и никотиновой кислоты (никотинамида). По 10 мг тиамина хлорида, рибофлавина и 30 мг никотиновой кислоты растворяют приблизительно в 150 мл воды очищенной с добавлением 1 мл уксусной кислоты ледяной в мерной колбе вместимостью 250 мл, объем доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2 - 8 °C в течение 2 нед.
<a id="p100294"></a>р) Приготовление раствора кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг кальция пантотената в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 1 мес.
<a id="p100295"></a>с) Приготовление раствора пиридоксина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг пиридоксина гидрохлорида в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 1 мес.
<a id="p100296"></a>т) Приготовление раствора ПАБК. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 2 мг ПАБК в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки и перемешивают. Хранят при температуре 2 - 8 °C в течение 1 мес.
<a id="p100297"></a>у) Приготовление раствора D-биотина. В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 1 мг D-биотина при нагревании на кипящей водяной бане в 200 мл воды очищенной с добавлением 2 мл уксусной кислоты ледяной, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2 - 8 °C.
<a id="p100298"></a>ф) Приготовление раствора пиридоксина и ПАБК. По 10 мг пиридоксина и ПАБК растворяют в 25 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл этилового спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Хранят при температуре 2 - 8 °C не более 1 мес.
<a id="p100299"></a>х) Приготовление раствора натрия хлорида (0,9%) изотонического. Растворяют 2,25 г натрия хлорида в 250 мл воды очищенной, разливают по 10 - 15 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120 - 121 °C в течение 15 мин.
<a id="p100300"></a>ц) Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты. Разбавляют 425 мл хлористоводородной кислоты концентрированной (d = 1,19) водой очищенной до 1000 мл и перемешивают.



<a id="p100301"></a>

---