ОФС.1.2.1.2.0011. Общая фармакопейная статья. Гидрофобная хроматография

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Гидрофобная хроматография	ОФС.1.2.1.2.0011
	Вводится впервые

Гидрофобная хроматография является разновидностью метода жидкостной колоночной обращенно-фазовой хроматографии по механизму разделения. В гидрофобной хроматографии удерживание разделяемых веществ обусловлено гидрофобным взаимодействием их молекул с относительно неполярной неподвижной фазой, а для изменения элюирующей силы подвижной фазы используют, в первую очередь, изменение ионной силы (концентрации соли в подвижной фазе).

Гидрофобная хроматография — жидкостная хроматография на неполярных сорбентах, в которой в качестве подвижной фазы используют водные или водно-органические буферные растворы и разделение смеси веществ происходит в результате различия в их взаимодействии с гидрофобными группами сорбента в условиях убывающего градиента солей в элюенте с высокой разрешающей способностью. Гидрофобная хроматография сохраняет биологическую активность белков благодаря более слабому взаимодействию, чем другие хроматографические методы.

Основное назначение гидрофобной хроматографии — разделение и очистка биополимеров (прежде всего, белков).

Область применения

Гидрофобная хроматография — один из эффективных методов разделения сложных смесей белков, основанный на различиях в гидрофобности их молекул и широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической технологии. Метод применяют как для качественного, так и для количественного анализа лекарственных средств в испытаниях «Подлинность», «Родственные примеси» и «Количественное определение».

Различные модификации метода широко используют для очистки и разделения пептидов (таких как окситоцин, липрессин, пептидный гормон роста — соматотропин), антибиотиков, лейкоцитарного интерферона, высокомолекулярных белков (химотрипсиногена, ферритина и др.), моноклональных антител и др.

Основы метода

Разделение белковых молекул основано на различиях в их поверхностной гидрофобности, обусловленной отличиями в первичной структуре молекул белков (наличие гидрофобных функциональных групп в молекулах исходных аминокислот) и третичной структурой этих молекул в водном растворе: гидрофобные участки белковых молекул (например, фенилаланин, тирозин и триптофан) обратимо взаимодействуют с гидрофобными функциональными группами неподвижной фазы (фенил, октил, бутил и др.). Эти взаимодействия, немаловажную роль в которых играет гидратация молекул белка и функциональных групп неподвижной фазы в водном растворе, усиливаются прямо пропорционально увеличению ионной силы подвижной фазы при постоянных температуре и pH среды. После связывания разделяемых белков с неподвижной фазой состав подвижной фазы изменяют таким образом, что ионная сила подвижной фазы уменьшается (плавно или ступенчато), а разделяемые белки поочередно элюируются с колонки в порядке увеличения их гидрофобности (рис. 1). Для детектирования белков, как правило, используют спектрофотометрический детектор ( \lambda = 214 или 280 нм).

Рисунок 1 — Типичная хроматограмма разделения смеси белков методом гидрофобной хроматографии

Свойства разделяемых белков и функциональных групп неподвижной фазы, а также состав подвижной фазы (выбор соли, обеспечивающей ионную силу подвижной фазы, и ее концентрации) являются основными параметрами, влияющими на конечные характеристики хроматографического разделения белков методом гидрофобной хроматографии (селективность и разрешающая способность, эффективность, экспрессность и др.).

Оборудование

Для проведения гидрофобной хроматографии используют оборудование, применяемое в методе высокоэффективной жидкостной хроматографии. Основные компоненты хроматографической системы совпадают с набором узлов для любой жидкостной колоночной хроматографии (узел подготовки подвижной фазы, насосная система, система ввода пробы, хроматографическая колонка, система детектирования, система сбора и обработки данных и др.).

Неподвижная фаза

Неподвижная фаза в гидрофобной хроматографии, как правило, представляет собой полимерную матрицу (полиметилакрилат или агароза с различной степенью сшивки, стирол-дивинилбензол и др.) в виде пористых или непористых сферических частиц со средним диаметром 101 — 102 мкм, поверхность которых модифицирована относительно гидрофобными функциональными группами (табл. 1).

Таблица 1

Функциональные группы, используемые в неподвижных фазах для гидрофобной хроматографии

Функциональная группа	Структурная формула
Фенил
Бутил-S	-S-(CH2)3-CH3
Бутил	-O-(CH2)3-CH3
Октил	-O-(CH2)7-CH3
Пропиленгликоль	-O-CH2-CHOH-CH2-OH
Изопропил	-O-CH-(CH3)2

Неподвижные фазы, обладающие сравнительно более высокой гидрофобностью, как правило, показывают большую емкость по отношению к белку при низких концентрациях соли в подвижной фазе.

Состав подвижной фазы и ее pH

При использовании гидрофобной хроматографии следует учитывать способность определенных ионов в растворе влиять на гидрофобные взаимодействия белков. Способность ионов элюировать или осаждать белки показана в ряду Гофмейстера (рис. 2).

Увеличение осаждающего (salting-out) эффекта
Анионы:	PO43-, SO42-, CH3COO-, Cl-, Br-, NO3-, ClO4-, I-, SCN-
Катионы:	NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Mg2+, Ca2+, Ba2+
Увеличение хаотропного (salting-in) эффекта

Рисунок 2 — Ряд Гофмейстера

Небольшие ионы (например, хлориды, сульфаты), несущие большой заряд, являются сильными «соосадителями» (антихаотропными агентами), тогда как органические кислоты и основания, некоторые другие соединения повышают растворимость и стабилизируют белки в растворе (хаотропные агенты). В качестве хаотропных агентов обычно используют бутанол, 2-пропанол, этанол, гуанидина гидрохлорид, лития перхлорат и ацетат, магния хлорид, натрия тиоцианат, натрия лаурилсульфат, мочевину и тиомочевину. Хаотропные агенты способствуют разрушению структурированной системы водородных связей между молекулами воды, изменению гидратации макромолекул белков в растворе и ослаблению гидрофобных взаимодействий. Антихаотропные агенты, напротив, способствуют образованию упорядоченной системы водородных связей и усиливают гидрофобные взаимодействия.

Необходимо отметить, что соли кальция и магния являются менее выраженными «соосадителями», чем это следует из ряда Гофмейстера, за счет специфического связывания с сайтами на поверхности белка.

Сульфаты натрия, калия и аммония являются сильными осаждающими агентами и оказывают стабилизирующее действие на белки. Именно поэтому эти соли, а также натрия хлорид, калия хлорид и аммония ацетат, наиболее часто используются в гидрофобной хроматографии (рис. 3). С целью достижения требуемых характеристик разделения для приготовления подвижной фазы могут также использоваться бинарные смеси солей.

Na2SO4 > K2SO4 > (NH4)2SO4 > Na2HPO4 > NaCl > LiCl ..... >

KSCN

Рисунок 3 — Сравнительная выраженность антихаотропного эффекта различных солей

Увеличение концентрации соли в подвижной фазе приводит к увеличению ионной силы и гидрофобных взаимодействий. Исходная концентрация соли в подвижной фазе обычно составляет от 0,5 до 3 М (в зависимости от используемой неподвижной фазы, свойств разделяемых белков и антихаотропного эффекта соли). При выборе исходной концентрации соли в подвижной фазе (при которой происходит введение образца в колонку) для разделения конкретного набора белков в образце следует учитывать, что при превышении определенной концентрации соли (специфичной для каждой конкретной пары соль-белок) в подвижной фазе происходит выпадение белка в осадок из раствора, чего следует избегать при введении образца в хроматографическую колонку.

Удерживание белков неподвижными фазами для гидрофобной хроматографии происходит не только в присутствии «классических» солей. Некоторые цвиттер-ионные органические соединения (например, аминокислоты — глицин и аргинин) могут использоваться для этих же целей. Добавка этих соединений в подвижную фазу также способствует улучшению воспроизводимости получаемых результатов.

Обычно pH подвижной фазы сохраняют неизменным в ходе разделения и, как правило, выбирают максимально близким к изоэлектрическим точкам разделяемых белков. Чаще всего разделение проводят в нейтральной среде (pH 7,0). В то же время изменение характеристик разделения при варьировании pH подвижной фазы в области 5 — 8,5 в общем случае выражено незначительно, при этом увеличение pH ослабляет гидрофобные взаимодействия.

В качестве отправной точки при выборе условий разделения белков методом гидрофобной хроматографии можно использовать элюенты следующего состава:

Начальный буфер (A):	50 мМ раствор натрия фосфата, pH 7,0 + 0,5 — 1,5 М аммония сульфата.
Элюирующий буфер (B):	50 мМ раствор натрия фосфата, pH 7,0.

Термостатирование колонки и образцов

Влияние температуры на разделение в гидрофобной хроматографии до конца не изучено и имеет сложный характер. По этой причине разделение рекомендуют проводить при постоянной температуре (обычно в диапазоне 20 — 25 °C). В общем случае увеличение температуры колонки усиливает гидрофобные взаимодействия. Температуру термостатирования образцов, как правило, устанавливают такую же, как и для разделяющей колонки. Низкая температура образца перед введением, по сравнению с температурой разделяющей колонки, может послужить причиной снижения времени удерживания белка и ухудшения его воспроизводимости.

Подготовка и введение образцов

Образцы должны быть свободны от твердых частиц. В качестве растворителя для образцов, как правило, используют подвижную фазу, состав и pH которой соответствуют начальным условиям элюирования. Общее количество белка, вводимое в колонку, не должно превышать общую связывающую способность (емкость) колонки по отношению к белку. При градиентном элюировании белок в колонку, как правило, вводят в количестве, не превышающем 30% от максимальной емкости колонки, что обеспечивает оптимальное разрешение. Нагрузка белка на колонку может быть увеличена при условии сохранения приемлемого разрешения или в случае ступенчатого изменения концентрации соли в ходе элюирования. Для оптимального разделения при градиентном элюировании используют примерно одну пятую общей связывающей способности колонки. При подборе условий разделения смеси белков при обращенно-фазовой хроматографии обязательно учитывают pH раствора, вязкость и температуру.

Максимальная динамическая емкость колонки по отношению к белку зависит от скорости потока подвижной фазы (обратно пропорционально) и/или размеров разделяемых белков и пор частиц неподвижной фазы. Крупные и несимметричные молекулы с трудом проникают вглубь частиц неподвижной фазы, и их удерживание обеспечивается в основном гидрофобными взаимодействиями на поверхности частиц, что снижает динамическую емкость неподвижной фазы по отношению к таким молекулам.

---