---
title: "\"ОФС.1.2.1.2.0009.18. Общая фармакопейная статья. Аффинная хроматография\""
number: "ОФС.1.2.1.2.0009.18"
issuer: "Министерство здравоохранения Российской Федерации"
status: утратил силу
canonical: "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-2-0009-18"
---

## "ОФС.1.2.1.2.0009.18. Общая фармакопейная статья. Аффинная хроматография"

# "ОФС.1.2.1.2.0009.18. Общая фармакопейная статья. Аффинная хроматография"

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)

("Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание")

> [!WARNING]
> Документ утратил силу с 01.09.2023 в связи с введением в действие [ОФС.1.2.1.2.0009](https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-2-0009), утв. Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377.
> В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018.
> Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.03.2019.

> [!NOTE]
> ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

```mermaid
flowchart LR
  n0["ОФС.1.2.1.2.0009.18"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-2-0009-18" "ОФС.1.2.1.2.0009.18. Общая фармакопейная статья. Аффинная хроматография (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 N 749)"
  n1["ОФС.1.2.1.2.0009"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-2-0009" "ОФС.1.2.1.2.0009. Общая фармакопейная статья. Аффинная хроматография (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 N 377)"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
```


<a id="p100001"></a>МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

<div align="center">

<a id="p100002"></a>**ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ**

</div>



| <a id="p100003"></a>Аффинная<br>хроматография | <a id="p100004"></a>ОФС.1.2.1.2.0009.18<br>Вводится впервые |
| --- | --- |


<a id="p100005"></a>Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод аффинной хроматографии.
<a id="p100006"></a>Аффинная хроматография является разновидностью метода хроматографии по механизму разделения, основанному на высокоспецифичном взаимодействии между веществом.

<div align="center">

<a id="p100007"></a>Область применения

</div>


<a id="p100008"></a>Данный метод в основном предназначен для разделения и определения и очистки белков, пептидов, антител, полисахаридов и др. в зависимости от лиганда, используемого в анализе.

<div align="center">

<a id="p100009"></a>Основы метода

</div>


<a id="p100010"></a>В основе аффинной хроматографии лежит взаимодействие определяемого вещества из смеси с лигандом, связанным с инертным носителем, образующими неподвижную фазу. Главной особенностью аффинной хроматографии является высокая специфичность лиганда, иммобилизованного на носителе, к определяемому веществу, или так называемая аффинность. Специфичность реакции обычно обусловлена взаимодействием фермент-субстрат, антиген-антитело или гормон-рецептор. Однако, возможно использование аффинной хроматографии и для других типов высокоспецифического взаимодействия, например, фермент-кофактор, фермент-ингибитор, пептиды - специфические антитела и др.
<a id="p100011"></a>Существует несколько разновидностей метода аффинной хроматографии таких, например, как колоночная аффинная хроматография, мембранная аффинная хроматография и др.
<a id="p100012"></a>Колоночная аффинная хроматография обычно идет в 2 этапа: 1) сорбция определяемого вещества или группы веществ на колонке путем их реакции с иммобилизованным на носителе лигандом; 2) промежуточная промывка колонки для удаления не специфически связанных компонентов; 3) десорбция исследуемого компонента смеси с колонки. Для первого этапа подбирают такие условия (состав буферного раствора, pH, ионная сила буферного раствора, температура и т.д.), которые являются наиболее благоприятными для взаимодействия аффинной пары. После этого колонку хорошо промывают и проводят десорбцию определяемого вещества. Это обычно достигается с помощью повышения ионной силы буферного раствора, повышением или понижением его pH или добавлением различных органических растворителей или введением в буферный раствор различных хаотропных агентов. Также можно проводить десорбцию раствором конкурирующего лиганда. Иногда для лучшей десорбции и получения более качественной хроматограммы используют линейный градиент (pH, ионной силы или содержания органического растворителя).
<a id="p100013"></a>В мембранной аффинной хроматографии вместо колонки с сорбентом используется фильтрационный элемент, с иммобилизованным на нем специфическом лиганде. Мембранная аффинная хроматография в целом состоит из тех же этапов, однако специфика мембранного метода позволяет уменьшить объем сорбента, благодаря эффективности сорбента в виде мембраны. Кроме того, в мембранном варианте резко возрастает скорость очистки при близкой к колоночной эффективности. Благодаря меньшим объемам использования буферного раствора и непосредственно самого сорбента, процесс легче масштабировать.
<a id="p100014"></a>Тонкослойная аффинная хроматография представляет собой классический вариант тонкослойной хроматографии, где на пластинку иммобилизован специфический лиганд.
<a id="p100015"></a>Однако чаще всего в фармакопейном анализе используется колоночный вариант аффинной хроматографии.

<div align="center">

<a id="p100016"></a>Оборудование

</div>


<a id="p100017"></a>Для колоночной аффинной хроматографии используется стандартное оборудование для колоночной хроматографии. Набор необходимых узлов системы обычно включает в себя хроматографическую колонку, насос, систему ввода пробы, систему детектирования, систему сбора и обработки данных. Возможно использование коллектора фракций и градиентного смесителя.

<a id="p100018"></a>Неподвижная фаза

<a id="p100019"></a>Неподвижная фаза аффинной хроматографии представляет собой специально синтезированный сорбент, состоящий из инертного носителя, соединенного со специфическим лигандом (возможно использование "спейсера" для сшивки). В качестве инертного носителя часто используют сефарозу (агарозу, имеющую дополнительные поперечные сшивки), например сефароза 4B или сефароза CL, однако при необходимости возможно использование и других носителей, в том числе неорганических. Содержание лиганда обычно не превышает 5 - 15 мкмоль на 1 г носителя. Однако его должно быть достаточно, чтобы хроматография имела приемлемый выход. Лиганд и его связь с матрицей должны быть достаточно стабильны в установленных хроматографических условиях (температура, pH, ионная сила и т.д.). В качестве лиганда может выступать практически любое соединение, имеющее специфичность к определяемому веществу. Это может быть субстрат или ингибитор фермента, рецептор, специфичный к определяемому гормону, антитела или др. Кроме того, лиганды могут быть также группоспецифические, то есть обладающие специфичностью сразу к целой группе родственных веществ, например, к какой-либо группе ферментов.

<a id="p100020"></a>Подвижная фаза

<a id="p100021"></a>Подвижная фаза аффинной хроматографии представляет собой жидкий элюент, инертный по отношению к другим компонентам хроматографии (неподвижная фаза, определяемое вещество). Подвижная фаза должна обладать низкой вязкостью и быть совместимой с используемыми методами детектирования. В качестве подвижной фазы обычно буферные водные растворы с различными pH, состав элюента подбирается в зависимости от условий хроматографирования. Чаще всего, из-за сильного удерживания компонентов смеси сорбентом, необходимо использование ступенчатого или линейного градиентного элюирования.

<a id="p100022"></a>Методика

<a id="p100023"></a>Методика проведения колоночной аффинной хроматографии аналогична методике любой стандартной колоночной хроматографии. Прежде всего, подготавливается хроматографическая колонка. Для этого осуществляется правильная "набивка" колонки сорбентом. Для плотного и равномерного заполнения колонки возможно использование суспензионного метода. После этого колонка обязательного уравновешивается. Затем в колонку под давлением подается элюент. Проба может вводиться как фронтальным методом, так и через специальный дозирующий кран с известным объемом петли. На выходе из колонки раствор элюента с разделенными определяемыми компонентами проходит через детектор. В качестве детектора возможно использование любой детектирующей системы для колоночной жидкостной хроматографии (см. ОФС "Хроматография", [ОФС](https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-2-0005-15) "Высокоэффективная жидкостная хроматография"). Возможно проведение постколоночной дериватизации для увеличения чувствительности детектирования. Для регистрации результатов хроматографии и получения хроматограммы возможно использование самописца, однако предпочтительнее использование компьютерного сбора и обработки данных. Это повышает точность анализа и позволяет сразу провести анализ хроматограммы с помощью специальных программ, подсчитывающих в автоматическом режиме параметры хроматограммы (например, площадь пиков). Для сбора проб возможно использование коллектора фракций, подключенного к системе сбора данных.

<div align="center">

<a id="p100024"></a>Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

</div>


<a id="p100025"></a>В фармакопейной статье должны быть приведены: параметры колонки (длина и внутренний диаметр) и температура колонки (если необходимо термостатирование) для колоночной аффинной хроматографии, параметры мембраны (площадь, количество слоев) для мембранной аффинной хроматографии или параметры пластинки для аффинной ТСХ (в соответствии с ОФС "Тонкослойная хроматография"); тип сорбента с указанием иммобилизованного лиганда; объем вводимой пробы (объем петли); состав подвижной фазы и способ ее приготовления; скорость подачи подвижной фазы; тип детектора и условия детектирования (при необходимости параметры используемой ячейки детектора); описание градиентного режима (если используется), включающее в себя стадию переуравновешивания к исходным условиям, время хроматографирования, описания приготовления стандартных и испытуемых растворов.

<div align="center">

<a id="p100026"></a>Испытание на чистоту и допустимые пределы примесей

</div>


<a id="p100027"></a>Определение примесей в лекарственных средствах и оценку их содержания проводят с помощью:
- <a id="p100028"></a>визуального сравнения с эталонными растворами, устанавливающими предел содержания данной примеси, после проведения реакции с испытуемым и эталонным растворами. Окраска или опалесценция/помутнение испытуемого раствора должна быть не интенсивнее окраски или опалесценции/помутнения эталонного раствора;
- <a id="p100029"></a>физико-химических методов (спектроскопические, хроматографические и другие методы).

<div align="center">

<a id="p100030"></a>Общие замечания

</div>


1. <a id="p100031"></a>Вода и все реактивы должны быть свободны от ионов, на содержание которых проводят испытания.
2. <a id="p100032"></a>Пробирки, в которых проводят наблюдения, должны быть бесцветными, прозрачными, из нейтрального стекла с плоским дном, одинакового диаметра (около 1,5 см, если не указано иначе).
3. <a id="p100033"></a>Если не указано иначе, навески для приготовления эталонных растворов отвешивают с точностью до 0,001 г.
4. <a id="p100034"></a>Наблюдения помутнения и опалесценции растворов проводят в проходящем свете на темном фоне, а окраски - по оси пробирок при дневном отраженном свете на матово-белом фоне.
5. <a id="p100035"></a>Прибавление реактивов к испытуемому и эталонному растворам проводят одновременно и в одинаковых количествах.
6. <a id="p100036"></a>В случае, когда в соответствующей фармакопейной статье или нормативной документации указано, что в данной концентрации раствора не должно обнаруживаться той или иной примеси, поступают следующим образом. К 10 мл испытуемого раствора прибавляют применяемые для каждой реакции реактивы, указанные в методике, кроме основного реактива, открывающего данную примесь. Затем раствор делят на две равные части: к одной из них прибавляют основной реактив и оба раствора сравнивают между собой. Между ними не должно быть заметной разницы.



<a id="p100037"></a>

---