ОФС.1.2.1.0025.18. Общая фармакопейная статья. Аминокислотный анализ
Актуально на 02.11.2026.
Как цитировать: "ОФС.1.2.1.0025.18. Общая фармакопейная статья. Аминокислотный анализ". ОФС.1.2.1.0025.18. https://bukva.ai/docs/prikaz-ofs-1-2-1-0025-18
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I»)
Примечание
В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php по состоянию на 13.03.2019 и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи.
| Аминокислотный анализ | ОФС.1.2.1.0025.18 Вводится впервые |
|---|
Аминокислотный анализ используется для определения качественного и количественного состава аминокислот в белковых, пептидных и других фармацевтических препаратах. Белки и пептиды представляют собой макромолекулы, состоящие из ковалентно связанных аминокислотных остатков, организованных в виде линейного полимера. Последовательность аминокислот в белке или пептиде определяет их свойства. Крупные молекулы белков обычно существуют в виде конденсированных структур с определенной конформацией, тогда как молекулы пептидов меньше и могут состоять всего из нескольких аминокислот.
Аминокислотный анализ может быть использован для количественного определения белков и пептидов, установления их подлинности на основе аминокислотного состава, в качестве дополнительного инструмента при анализе структуры белка и пептида, а также для оценки стратегий фрагментации в пептидном картировании, и для обнаружения атипичных аминокислот, которые могут присутствовать в белке или пептиде. Перед аминокислотным анализом необходимо гидролизовать белок/пептид до отдельных аминокислот. После гидролиза процедура анализа аминокислот может быть такой же, как и для свободных аминокислот в других фармацевтических препаратах. Аминокислоты, входящие в состав исследуемого образца, обычно подвергаются дериватизации и определяются в виде соответствующих производных, однако существуют методики, основанные на определении нативных аминокислот.
Методы, используемые для аминокислотного анализа, обычно основаны на хроматографическом разделении аминокислот, присутствующих в исследуемом образце. Современные методики используют автоматизированное хроматографическое оборудование, разработанное специально для этих целей. Прибор для анализа аминокислот обычно представляет собой жидкостный хроматограф высокого или сверхвысокого давления, обеспечивающий разделение определяемых аминокислот на хроматографической колонке в режиме градиентного элюирования. Прибор должен иметь возможность проведения пост-колоночной дериватизации, за исключением тех случаев, когда анализ образца выполняется с использованием предколоночной дериватизации.
В качестве детектора обычно используется спектрофотометрический детектор ультрафиолетового/видимого диапазона или флуориметрический детектор (и их сочетания), в зависимости от используемой методики дериватизации. Более сложной и дорогой, но в то же время более информативной и чувствительной альтернативой оптическим детекторам при определении производных аминокислот может быть использование масс-спектрометрического детектирования. Для определения нативных аминокислот возможно использование спектрофотометрического детектора (\lambda \approx 210\text{нм}) , испарительного детектора светорассеяния, детектора заряженного аэрозоля и электрохимического (амперометрического) детектора, в зависимости от решаемой аналитической задачи, сложность которой обусловлена числом единовременно определяемых аминокислот, диапазоном определяемых концентраций и мешающим влиянием. Предпочтительно, чтобы используемая аппаратура была специально предназначена для аминокислотного анализа (аминокислотный анализатор).
Для управления прибором, сбора и обработки хроматографических данных обычно используется персональный компьютер со специализированным программным обеспечением.
Фоновое загрязнение всегда является проблемой для аналитика при проведении аминокислотного анализа. Необходимо использование реагентов высокой чистоты (например, хлористоводородная кислота с низкой степенью чистоты может способствовать загрязнению глицином). Аналитические реагенты должны обновляться регулярно каждые несколько недель при использовании только растворителей класса чистоты «для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)». Для устранения потенциального микробиологического загрязнения и инородных частиц, которые могут присутствовать в растворителях, растворители необходимо фильтровать перед использованием, емкости с растворителями следует хранить закрытыми, а оборудование для анализа аминокислот следует размещать вдали от прямых солнечных лучей и в зонах лаборатории, находящихся вдали от мест постоянного присутствия персонала. Необходимо свести к минимуму все потенциальные источники аминокислотного загрязнения и содержать лабораторию в чистоте, поскольку пыль может способствовать повышению содержания глицина, серина и аланина при попадании в испытуемый образец.
Стабильная работа аминокислотного анализатора — один из критериев получения приемлемых результатов аминокислотного анализа. Если прибор используется для рутинной работы, ежедневно должна проверяться стабильность работы детектора и используемой калибровки, а также стабильность и приемлемость характеристик хроматографического разделения (времен удерживания и факторов асимметрии пиков аминокислот, разрешения для близкоэлюирующихся пар пиков и эффективности хроматографической колонки).
Универсальные стандартные образцы аминокислот для аминокислотного анализа коммерчески доступны и обычно представляют собой аттестованные по содержанию растворы смесей аминокислот (различного состава) в 0,1 М водном растворе хлористоводородной кислоты или водном буферном растворе, подходящем для выбранной методики анализа. Концентрация всех аминокислот в составе таких стандартных растворов обычно одинакова. Для приготовления стандартных растворов, содержащих строго определенный набор аминокислот с требуемой концентрацией для каждой конкретной аминокислоты (под конкретную задачу), используют охарактеризованные надлежащим образом стандартные образцы отдельных аминокислот (или их солей).
При определении аминокислотного состава стандартные образцы белков или пептидов анализируют в качестве контрольных образцов наряду с испытуемым образцом, чтобы продемонстрировать достоверность всей процедуры. Для этой цели в качестве стандарта белка может быть использован высокоочищенный бычий сывороточный альбумин или другой белок известного состава.
Калибровка прибора для анализа аминокислот обычно включает в себя анализ серии из нескольких разведений исходного стандартного раствора смеси аминокислот для определения факторов отклика и линейных диапазонов определяемых концентраций аминокислот. Для этого анализируют 4 — 6 разведений исходного стандартного раствора аминокислот, соответствующих 4 — 6 уровням концентрации, и строят экспериментальные зависимости площадей пиков аминокислот от их концентраций в соответствующих стандартных растворах. Полученные калибровочные зависимости аппроксимируют линейной функцией (исключение составляют зависимости, полученные с использованием испарительного детектора светорассеяния или детектора заряженного аэрозоля) и используют для расчета концентраций аминокислот, присутствующих в исследуемом образце. Калибровочные зависимости, должны часто обновляться и проверяться путем анализа контрольных образцов для обеспечения достоверности получаемых результатов.
Для получения точных и повторяемых результатов важно, чтобы аналитик готовил образцы для аминокислотного анализа таким образом, чтобы они соответствовали области применимости методики (например, ожидаемые концентрации аминокислот в испытуемом образце находились бы в рамках линейных рабочих диапазонов методики для каждой аминокислоты). При проведении рутинного анализа может использоваться одноточечная калибровка, когда концентрация аминокислот в используемом стандартном растворе соответствует типичным ожидаемым концентрациям аминокислот в испытуемом растворе.
Получение точных результатов аминокислотного анализа требует дополнительной очистки испытуемых образцов белков и пептидов. Буферные компоненты (например, соли, мочевина, детергенты) могут оказывать мешающее влияние и удаляются из образца перед анализом. В методиках, использующих пост-колоночную дериватизацию аминокислот, мешающее влияние буферных компонентов обычно проявляется менее выражено, чем в методиках, основанных на предколоночной дериватизации. В ходе пробоподготовки желательно ограничить количество манипуляций с образцами, чтобы уменьшить потенциальное фоновое загрязнение, улучшить значение открываемости, рассчитанное для определяемых аналитов, и сократить трудозатраты. Общие методы, используемые для удаления буферных компонентов из испытуемых образцов, включают следующие: (1) полупрепаративное ОФ-ВЭЖХ разделение белка и компонентов пробы, элюирование белка с колонки легкоиспаряющимся элюентом, содержащим достаточную долю органического растворителя, и сушку полученного образца элюата вакуумным центрифугированием; (2) диализ с использованием буферного раствора на основе легколетучих компонентов, или воды; (3) центробежная ультрафильтрация для замены буфера легколетучим буферным раствором или водой; (4) осаждение белка из буфера с использованием органического растворителя (например, ацетона); (5) полупрепаративная гель-фильтрация.
Для контроля возможных физических и химических потерь, а также возможных отклонений во время аминокислотного анализа, рекомендуется использовать внутренний стандарт. Точно известное количество внутреннего стандарта может быть добавлено к раствору белка до гидролиза. Значение открываемости рассчитанное для внутреннего стандарта теоретически соответствует общему значению открываемости для аминокислот в гидролизате испытуемого образца белка. Свободные аминокислоты, однако, во время гидролиза ведут себя несколько иначе, по сравнению с аминокислотами в составе белка, скорости высвобождения или разрушения которых в ходе гидролиза непостоянны. По этой причине использование внутреннего стандарта для учета потерь при гидролизе может дать ненадежные результаты, что необходимо учитывать. Внутренний стандарт также может быть добавлен к смеси аминокислот после гидролиза для учета возможной нестабильности реагентов (протекания реакции дериватизации), производных аминокислот, а также нестабильности работы прибора в целом.
В идеале внутренний стандарт представляет собой первичную аминокислоту небелкового происхождения, которая является коммерчески доступной и недорогой. Внутренний стандарт должен быть стабильным во время гидролиза, его фактор отклика должен быть постоянным в диапазоне определяемых концентраций целевых аминокислот, кроме того пик внутреннего стандарта на хроматограмме должен обладать уникальным временем удерживания и разрешаться с пиками других аминокислот. На практике в качестве внутреннего стандарта обычно используют норлейцин, нитротирозин и \alpha - \text{аминомасляную} кислоту.
Во избежание ошибочных результатов, стеклянная посуда, используемая для гидролиза белков и пептидов, должна быть очень чистой. Пудра с перчаток и отпечатки пальцев на флаконах для гидролиза могут вызвать загрязнение пробы. Для очистки стеклянных флаконов для гидролиза необходимо прокипятить их в течение 1 ч в 1 М хлористоводородной кислоте или замочить в концентрированной азотной кислоте или в смеси равных объемов концентрированных хлористоводородной и азотной кислот. Очищенные вышеописанным способом флаконы для гидролиза промывают высокочистой водой, затем споласкивают метанолом класса чистоты «для ВЭЖХ», сушат в течение ночи в сушильном шкафу и хранят закрытыми вплоть до использования. Альтернативно для устранения загрязнений может быть использован пиролиз чистой стеклянной посуды при температуре 500 °C в течение 4 ч. Также возможно использование адекватной одноразовый лабораторный посуды.
Кислотный гидролиз является наиболее распространенным способом гидролиза образца белка перед аминокислотным анализом. Метод кислотного гидролиза может способствовать ухудшению воспроизводимости результатов анализа из-за полного или частичного разрушения некоторых аминокислот: триптофан разрушается; серин и треонин частично разрушаются; метионин может подвергаться окислению; цистеин обычно выделяется в виде цистина (однако значение открываемости, рассчитанное для цистина, обычно неудовлетворительное из-за частичного разрушения или восстановления обратно до цистеина). Применение достаточного вакуума (менее 0,2 мм рт. ст. или 26,7 Па) или введение инертного газа (аргона) в свободное пространство реакционного сосуда позволяет снизить уровень окислительной деструкции. Среди пептидных связей, образуемых изолейцином (Иле) и валином (Вал), связи в парах Иле-Иле, Вал-Вал, Иле-Вал и Вал-Иле гидролизуются частично. Аспарагин и глутамин в ходе гидролиза дезамидируются, в результате чего получаются аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Потеря триптофана, аспарагина и глутамина во время кислотного гидролиза делает возможным количественное определение только 17 аминокислот. Некоторые из описанных ниже вариантов проведения гидролиза были разработаны для решения этих проблем. Некоторые из этих вариантов (например, методики 4 - 11) сами могут приводить к модификации других аминокислот. Таким образом, прежде чем использовать способ гидролиза, отличный от обычного кислотного гидролиза, необходимо тщательно проанализировать преимущества и недостатки использования конкретной методики и надлежащим образом апробировать ее.
Для получения информации об исходной концентрации аминокислот, которые подверглись частичному разрушению, или, аминокислот высвобождение которых протекает медленно, часто проводится кинетическое исследование (то есть, аминокислотный анализ после кислотного гидролиза в течение различных по продолжительности временных интервалов, например, в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч). По графикам зависимостей концентраций лабильных аминокислот (например, серина и треонина) от времени гидролиза, путем экстраполяции полученных кривых в момент времени t = 0 ч, можно определить теоретические максимальные концентрации этих аминокислот в растворе без учета разрушения. Кинетические исследования гидролиза также используются в случае аминокислот, которые медленно высвобождаются (например, изолейцин и валин). При проведении продолжительного гидролиза, аналитик будет наблюдать на кинетических кривых появление плато, соответствующего максимально возможному высвобождению данных аминокислот. Если время гидролиза слишком велико, максимальная достигнутая концентрация аминокислот в растворе начнет уменьшаться, указывая на их разрушение в условиях гидролиза.
Приемлемой альтернативой проведению кинетических исследований является проведение гидролиза стандарта аминокислот с известными концентрациями в тех же условиях, что и для испытуемого образца. Скорость разрушения аминокислот в свободной форме может не полностью соответствовать скорости разрушения лабильных аминокислот в составе пептида или белка во время гидролиза. Это особенно справедливо для пептидных связей, которые медленно гидролизуются (например, связи Иле-Вал). Тем не менее, этот метод позволяет аналитику учесть часть потерь аминокислот в процессе гидролиза.
Кислотный гидролиз под воздействием микроволнового излучения также используется и характеризуется быстротой, однако требует специального оборудования, а также специальных мер предосторожности. Оптимальные условия для микроволнового кислотного гидролиза должны подбираться для каждого отдельного образца белковой/пептидной природы. Продолжительность микроволнового гидролиза обычно составляет лишь несколько минут, однако даже небольшие отклонения во времени гидролиза могут привести к неудовлетворительным результатам (например, неполному гидролизу или разрушению лабильных аминокислот). Полный протеолиз с применением смеси протеаз также может использоваться для аминокислотного анализа, однако является слишком сложным, требует надлежащего контроля и обычно больше подходит для пептидов, чем для белков.
Для выбора оптимальных условий гидролиза в ходе первоначального анализа белка неизвестного состава, варьируют продолжительность гидролиза и температуру его проведения.
Кислотный гидролиз с использованием хлористоводородной кислоты, содержащей фенол, является наиболее общей процедурой, используемой для гидролиза белка/пептида при аминокислотном анализе. Добавление фенола предотвращает реакцию галогенирования тирозина.
Гидролизующий раствор. 6 М кислота хлороводородная, содержащая от 0,1% до 1,0% фенола.
Гидролиз в жидкой фазе. Образец белка или пептида помещают в ампулу для гидролиза и высушивают (образец сушат для того, чтобы вода, содержащаяся в образце, не разбавляла гидролизующий раствор). Прибавляют гидролизующий раствор из расчета 200 мкл на 500 мкг лиофилизированного белка. Образец в ампуле замораживают в бане с сухим льдом и ацетоном (-78 °C) и запаивают ампулу под вакуумом при помощи пламени. Образцы обычно гидролизуют при температуре 110 °C в течение 24 ч в вакууме или в атмосфере инертного газа для предотвращения окисления. Если есть подозрение, что испытуемый белок полностью не гидролизуется, рассматривают возможность проведения гидролиза в течение более продолжительного времени (например, 48 ч и 72 ч).
Парофазный гидролиз. Является одним из наиболее общих методов кислотного гидролиза. Предпочтителен для микроанализа, когда доступны лишь небольшие количества образца. При использовании парофазного гидролиза загрязнение образца кислотными реактивами минимизировано. Флаконы с высушенными образцами помещают в сосуд, содержащий подходящее количество гидролизующего раствора так, чтобы гидролизующий раствор не контактировал с испытуемым образцом. В свободном пространстве сосуда создают инертную атмосферу или вакуум (менее 0,2 мм рт. ст., или 26,7 Па), гидролиз проводят в течение 24 ч при температуре около 110 °C. Пары кислоты гидролизуют сухой образец. Возможность конденсации кислоты во флаконе с образцом должна быть сведена к минимуму. После гидролиза испытуемый образец сушат в вакууме для удаления остатков кислоты.
Использование меркаптоэтансульфоновой кислоты в качестве восстанавливающей кислоты уменьшает окисление триптофана в процессе гидролиза.
Гидролизующий раствор. 2,5 М раствор меркаптоэтансульфоновой кислоты.
Парофазный гидролиз. От 1 мкг до 100 мкг испытуемого белка/пептида сушат в ампуле для гидролиза. Ампулу помещают в ампулу большего размера, содержащую около 200 мкл гидролизующего раствора. Вакуумированную (около 0,05 мм рт. ст. или 6,7 Па) ампулу большего размера запаивают. Гидролиз проводят при температуре от 170 °C до 185 °C в течение 12,5 мин. После гидролиза ампулу с образцом сушат в вакууме в течение 15 мин для удаления остатков кислоты.
Использование тиогликолевой кислоты в качестве восстанавливающей кислоты предотвращает окисление триптофана при гидролизе.
Гидролизующий раствор. 7 М хлороводородная кислота, содержащая 1% фенола, 10% трифторуксусной кислоты и 20% тиогликолевой кислоты.
Парофазный гидролиз. От 10 мкг до 50 мкг испытуемого белка/пептида высушивают в ампуле для гидролиза. Ампулу для гидролиза помещают в ампулу большего размера, содержащую около 200 мкл гидролизующего раствора. Ампулу большего размера герметично запаивают в вакууме (около 0,05 мм рт. ст. или 6,7 Па). Гидролиз проводят при температуре 166 °C в течение 15 — 30 мин. После гидролиза для удаления остатков кислоты ампулу с образцом сушат в вакууме в течение 5 мин. Значение открываемости, рассчитанное для триптофана после количественного определения, может зависеть от количества испытуемого образца взятого для гидролиза.
Перед гидролизом белка выполняют окисление цистеина/цистина и метионина при помощи надмуравьиной кислоты.
Окисляющий раствор. Используют свежеприготовленный раствор надмуравьиной кислоты, полученный в результате смешения 1 объема 30% раствора водорода пероксида и 9 объемов муравьиной кислоты безводной и выдерживания при комнатной температуре в течение 1 ч.
Методика. Образец белка/пептида растворяют в 20 мкл муравьиной кислоты безводной, нагревают при температуре 50 °C в течение 5 мин и прибавляют 100 мкл окисляющего раствора. Процесс окисления проводят в течение 10 — 30 мин. В данной реакции цистеин превращается в цистеиновую кислоту, а метионин — в метионинсульфон. Избыток реактива удаляют из образца при помощи вакуумного центрифугирования. Окисленный белок может быть затем гидролизован по Методу 1 или Методу 2. При наличии галогенидов эта методика может приводить к модификации тирозина.
Окисление цистеина/цистина происходит во время жидкофазного гидролиза в присутствии азида натрия.
Гидролизующий раствор. К 6 М хлороводородной кислоте, содержащей 0,2% фенола, прибавляют натрия азид до получения конечной концентрации 2 г/л. Прибавление фенола предотвращает галогенирование тирозина.
Жидкофазный гидролиз. Гидролиз белка/пептида проводят при температуре около 110 °C в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин/цистин превращается в цистеиновую кислоту под воздействием натрия азида, содержащегося в гидролизном растворе. Эта методика приводит к получению лучших значений открываемости, рассчитанных для тирозина, чем Метод 4, но не подходит для количественного определения метионина. Метионин превращается в смесь из исходного метионина и двух продуктов его окисления — метионинсульфоксида и метионинсульфона.
Окисление цистеина/цистина происходит под воздействием диметилсульфоксида.
Гидролизующий раствор. К 6 М хлористоводородной кислоте, содержащей от 0,1% до 1,0% фенола, прибавляют диметилсульфоксид до получения раствора с конечной концентрацией 2% (об/об).
Парофазный гидролиз. Гидролиз белка/пептида проводят при температуре около 110 °C в течение 24 ч. Во время гидролиза присутствующий в образце цистеин/цистин превращается в цистеиновую кислоту под воздействием диметилсульфоксида, содержащегося в гидролизном растворе. С целью ограничения разброса получаемых результатов и учета частичного разрушения рекомендуется оценивать значение открываемости, рассчитанное для цистеиновой кислоты после окислительного гидролиза стандартного образца белка, содержащего 1 — 8 остатков цистеина. Фактор отклика для цистеиновой кислоты в гидролизате белка/пептида обычно на 30% ниже, чем для негидролизованного стандартного образца цистеиновой кислоты. Так как гистидин, метионин, тирозин и триптофан также модифицируются в ходе пробоподготовки, полный анализ состава белка при использовании этой методики невозможен.
Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в паровой фазе.
Восстанавливающий раствор. 83,3 мкл пиридина, 16,7 мкл 4-винилпиридина, 16,7 мкл трибутилфосфина и 83,3 мкл воды помещают в подходящий сосуд и перемешивают.
Методика. Ампулу для гидролиза с образцом белка/пептида (от 1 мкг до 100 мкг) помещают в ампулу большего размера. Переносят весь восстанавливающий раствор в ампулу большего размера, которую затем вакуумируют и герметично запаивают (около 0,05 мм рт. ст. или 6,7 Па). Реакцию проводят при температуре около 100 °C в течение 5 мин. Затем внутреннюю ампулу помещают в вакуумный эксикатор и сушат в течение 15 мин для удаления остатков реактивов. Пиридилэтилированный образец затем гидролизуют согласно описанным выше методикам. Для оценки значения открываемости, рассчитанного для пиридилэтилцистеина, параллельно проводят реакцию пиридилэтилирования стандартного образца белка, содержащего 1 — 8 остатков цистеина. Длительное время инкубации при реакции пиридилэтилирования может привести к модификации концевых \alpha - и \epsilon - \text{аминогрупп} лизина в белке.
Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при пиридилэтилировании в жидкой фазе.
Исходные растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 1 М раствор ТРИС-гидрохлорида с pH 8,5, содержащий 4 мМ динатрия эдетата (исходный раствор A); 8 М раствор гуанидина гидрохлорида (исходный раствор B); 10% раствор 2-меркаптоэтанола (исходный раствор C).
Восстанавливающий раствор. Готовят смесь, состоящую из 1 объема исходного раствора A и 3 объемов исходного раствора B (буферный раствор, содержащий 6 М гуанидина гидрохлорида и 0,25 М ТРИС-гидрохлорида).
Методика. Около 10 мкг испытуемого образца растворяют в 50 мкл восстанавливающего раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона. Для проведения реакции пиридинэтилирования к раствору белка прибавляют около 2 мкл 4-винилпиридина и выдерживают дополнительно 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте. Обессоливают белок/пептид методом ОФ-ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования.
Восстановление и алкилирование цистеина/цистина происходит при карбоксиметилировании в жидкой фазе.
Исходные растворы. Готовят, как указано в Методе 8.
Раствор для карбоксиметилирования. Готовят 100 г/л раствор йодацетамида в 96% спирте.
Буферный раствор. Используют восстанавливающий раствор, приготовленный, как указано в Методе 8.
Методика. Испытуемый образец растворяют в 50 мкл буферного раствора и прибавляют около 2,5 мкл исходного раствора C. Выдерживают в течение 2 ч при комнатной температуре в защищенном от света месте в атмосфере азота или аргона. Прибавляют раствор для карбоксиметилирования в 1,5-кратном избытке по отношению к теоретическому общему содержанию тиолов, и выдерживают дополнительно в течение 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света месте. Если содержание тиолов в белке неизвестно, прибавляют 5 мкл 0,1 М раствора йодацетамида из расчета на каждые 20 нмоль испытуемого образца белка. Для прекращения реакции прибавляют избыток 2-меркаптоэтанола. Обессоливают белок/пептид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, собирая белковую/пептидную фракцию. Перед кислотным гидролизом собранный образец может быть высушен при помощи вакуумного центрифугирования. В процессе кислотного гидролиза полученный S-карбоксиамидометилцистеин будет превращаться в S-карбоксиметилцистеин.
Цистеин/цистин, прореагировавший с дитиогликолевой кислотой или дитиодипропионовой кислотой, образует смешанный дисульфид. Выбор дитиогликолевой кислоты или дитиодипропионовой кислоты зависит от требуемого разрешения пиков в хроматографической методике аминокислотного анализа.
Восстанавливающий раствор. Раствор 10 г/л дитиогликолевой кислоты (или дитиодипропионовой кислоты) в 0,2 М растворе натрия гидроксида.
Методика. Около 20 мкг испытуемого образца помещают в ампулу для гидролиза и прибавляют 5 мкл восстанавливающего раствора. Прибавляют 10 мкл изопропилового спирта и удаляют всю жидкость из образца при помощи вакуумного центрифугирования. Образец гидролизуют, используя Метод 1. Преимущество данного метода заключается в том, что остатки других аминокислот не участвуют в побочных реакциях, а образец не нуждается в обессоливании перед гидролизом.
Аспарагин и глутамин в процессе кислотного гидролиза превращаются в аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, соответственно. Аспарагин и глутамин в составе белков/пептидов могут взаимодействовать с бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензолом, что при последующем кислотном гидролизе приводит к получению диаминопропионовой кислоты и диаминомасляной кислоты, соответственно. Эти превращения позволяют определять в белке/пептиде содержание аспарагина и глутамина в присутствии остатков аспарагиновой кислоты и глутаминовой кислоты.
Восстанавливающие растворы. Готовят и фильтруют 3 раствора: 10 мМ раствор трифторуксусной кислоты (раствор A); 5 М раствор гуанидина гидрохлорида, содержащий 10 мМ трифторуксусной кислоты (раствор B); свежеприготовленный раствор 36 мг/мл бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензола в диметилформамиде (раствор C).
Методика. Около 200 мкг испытуемого образца помещают в чистую ампулу для гидролиза и прибавляют 2 мл раствора A или раствора B и 2 мл раствора C. Ампулу для гидролиза герметично запаивают в вакууме. Полученный образец выдерживают в течение 4 ч при температуре 60 °C в защищенном от света месте. Затем образец подвергают диализу водой для удаления избытка реактивов. Диализированный образец трижды экстрагируют равными объемами бутилацетата и лиофилизируют. Белок затем может быть гидролизован согласно описанным ранее методикам. Пики \alpha,\beta - \text{диаминопропионовой} и \alpha,\gamma - \text{диаминомасляной} кислот обычно не отделяются от пика лизина при ионохроматографическом разделении. Таким образом, при использовании ионообменной хроматографии для разделения аминокислот содержание аспарагина и глутамина представляет собой разницу между содержаниями аспарагиновой и глутаминовой кислот, полученными в кислотных гидролизатах образцов белка/пептида без предварительной дериватизации бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензолом и с дериватизацией бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензолом. Определяемое содержание треонина, метионина, цистеина, тирозина и гистидина может изменяться при проведении дериватизации бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензолом; при необходимости определения этих аминокислотных остатков следует проводить гидролиз белка/пептида без предварительной дериватизации бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензолом.
Методология аминокислотного анализа: общие принципы
Существует множество методик аминокислотного анализа. Выбор конкретной методики зачастую определяется требуемой чувствительностью количественного определения. В целом, около половины применяемых методик аминокислотного анализа основаны ионохроматографическом разделении свободных аминокислот с последующей пост-колоночной дериватизацией (например, нингидрином или о-фталевым альдегидом).
Методики, основанные на пост-колоночной дериватизации, могут быть использованы для образцов, содержащих небольшое количество буферных компонентов (таких как соли и мочевина) и обычно требуют от 5 до 10 мкг испытуемого образца белка для проведения одного анализа. Остальные методики аминокислотного анализа обычно используют предколоночную дериватизацию свободных аминокислот (например, фенилизотиоцианатом (PITC, ФИТЦ); 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом (AQC, АХК) или о-фталевым альдегидом (OPA, ОФА); 4-(диметиламино)азобензол-4'-сульфонилхлоридом (DABS-Cl, дабсилхлорид); 9-фторенилметилхлорформиатом (FMOC-Cl, ФМОК-Cl); 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом (7-фтор-4-нитробензофуразан, НБФ)) с последующим определением полученных производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Метод предколоночной дериватизации отличается высокой чувствительностью (обычно требуется от 0,5 до 1,0 мкг испытуемого образца белка для проведения одного анализа), однако его использование может быть ограничено за счет мешающего влияния компонентов солевого буфера, содержащихся в испытуемом образце. Предколоночная дериватизация в некоторых случаях приводит к образованию нескольких производных для одной аминокислоты, что может усложнить интерпретацию результатов. Методики, основанные на пост-колоночной дериватизации, показывают, как правило, меньшую вариабельность результатов анализа, чем методики, основанные на предколоночной дериватизации.
Для количественного аминокислотного анализа могут быть использованы приведенные ниже методы. Приборы и реактивы, используемые для проведения этих испытаний, коммерчески доступны, как правило, представлены на рынке в виде готовых решений (аминокислотные анализаторы, работа которых основана на методиках с пост-колоночной дериватизацией, и специализированные наборы для ОФ-ВЭЖХ методик, основанных на предколоночной дериватизации). Кроме того, существует множество модификаций этих методов, отличающихся приготовлением реактивов, процедурой дериватизации, условиями хроматографического разделения и так далее. Некоторые параметры могут варьироваться в зависимости от конкретного оборудования и методики выполнения анализа. Многие лаборатории используют несколько методик аминокислотного анализа, так как каждая из них имеет свои преимущества.
МЕТОД 1. Пост-колоночная дериватизация с нингидрином
Ионообменная хроматография с пост-колоночной дериватизацией нингидрином является одним из наиболее распространенных методов, предназначенных для количественного аминокислотного анализа. Как правило, для анализа большинства сложных физиологических образцов используются хроматографические колонки на основе катионообменников в литиевой форме, а экспрессное разделение на катионообменниках в натриевой форме используется для более простых смесей аминокислот, полученных при гидролизе белков (содержащих обычно 17 аминокислот). Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором pH и ионной силы. Для улучшения разделения часто используют температурный градиент.
При взаимодействии аминокислоты с нингидрином образуется продукт характерного фиолетового или желтого цвета. Аминокислоты, за исключением иминокислот, образуют продукт фиолетового цвета, имеющий максимум поглощения при 570 нм. Иминокислоты, такие как пролин, образуют продукт реакции желтого цвета, имеющий максимум поглощения при 440 нм. Продукты постколоночной реакции между нингидрином и элюируемыми из колонки аминокислотами детектируются при длинах волн 440 нм и 570 нм, а полученная хроматограмма используется для определения аминокислотного состава.
Предел обнаружения для большинства производных аминокислот обычно составляет 10 пмоль, а для производных пролина — 50 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20 — 500 пмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных результатов рекомендуется использовать для гидролиза образцы белка/пептида массой более 1 мкг.
МЕТОД 2. Пост-колоночная дериватизация с о-фталевым альдегидом (ОФА)
о-Фталевый альдегид (ОФА) реагирует с первичными аминами в присутствии тиольных соединений, образуя производные изоиндола, обладающие сильной флуоресценцией. Эта реакция используется для постколоночной дериватизации в аминокислотном анализе методом ионообменной хроматографии. Основные подходы к ионохроматографическому разделению такие же, как указано в Методе 1.
Поскольку ОФА не взаимодействует с вторичными аминогруппами (иминокислоты, такие как пролин) с образованием флуоресцирующих производных, для образования флуоресцирующих производных с ОФА вторичные амины предварительно окисляют натрия гипохлоритом или хлорамином Т. В методике используются ионообменные колонки на основе сильных катионообменников для разделения свободных аминокислот с последующим пост-колоночным окислением натрия гипохлоритом или хлорамином Т и пост-колоночной дериватизацией с использованием ОФА и тиольных соединений, таких как N-ацетил-L-цистеин или 2-меркаптоэтанол. Длительное воздействие натрия гипохлорита или хлорамина Т не оказывает заметного влияния на дериватизацию первичных аминокислот.
Разделение аминокислот на ионообменной колонке достигается подбором pH и ионной силы. После пост-колоночной дериватизации элюируемых аминокислот с ОФА продукты реакции проходят через флуориметрический детектор. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных аминокислот измеряется при длине волны возбуждения 348 нм и длине волны эмиссии 450 нм.
Предел обнаружения для большинства ОФА-производных аминокислот обычно составляет несколько десятков пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области от нескольких пмоль до нескольких десятков нмоль. Для получения удовлетворительных результатов рекомендуется использовать для гидролиза образцы белка/пептида массой более 500 нг.
МЕТОД 3. Предколоночная дериватизация с фенилизотиоцианатом (ФИТЦ)
Фенилизотиоцианат (ФИТЦ) реагирует с аминокислотами с образованием фенилтиокарбамильных (ФТК) производных, которые детектируются с высокой чувствительностью при длине волны 254 нм.
После удаления реактива под вакуумом ФТК-производные аминокислот могут храниться в сухом состоянии в морозильнике в течение нескольких недель без заметной деградации. Готовый раствор пробы для анализа может храниться в течение 3 дней в холодильнике без заметных изменений хроматографического сигнала.
Разделение ФТК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, достигается путем подбора концентрации ацетонитрила в подвижной фазе и ионной силы буферного раствора. Элюируемые из колонки ФТК-производные аминокислот детектируются при длине волны 254 нм.
Предел обнаружения для большинства ФТК-производных аминокислот обычно составляет 1 пмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 20 — 500 пмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных результатов рекомендуется использовать для гидролиза образцы белка/пептида массой более 500 нг.
МЕТОД 4. Предколоночная дериватизация с 6-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидилкарбаматом (АХК)
АХК реагирует с аминокислотами с образованием стабильных флуоресцирующих несимметричных производных мочевины (АХК-аминокислот), которые определяют методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием.
Разделение АХК-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, достигается подбором концентрации ацетонитрила в подвижной фазе и ионной силы буферного раствора. Селективное флуоресцентное детектирование производных при длине волны возбуждения 250 нм и при длине волны эмиссии 395 нм допускает прямой ввод реакционной смеси без существенного мешающего влияния единственного флуоресцирующего побочного продукта разложения АХК — 6-аминохинолина. Избыток реактива быстро гидролизуется (t1/2 < 15 с) с образованием 6-аминохинолина, N-гидроксисукцинимида и диоксида углерода, а через 1 мин образование производных становится невозможным.
Площади пиков для АКХ-аминокислот, не изменяются значимо, по меньшей мере, в течение 1 недели при хранении растворов при комнатной температуре. Следовательно, АХК-аминокислоты обладают более чем достаточной стабильностью для проведения круглосуточного автоматического хроматографического анализа. Предел обнаружения для каждой аминокислоты, кроме цистеина, находится в области от 40 до 320 фмоль. Предел обнаружения для цистеина составляет около 800 фмоль. Линейность сигнала наблюдается в области 2,5 — 500 мкмоль с коэффициентом корреляции более 0,999. Для получения удовлетворительных результатов рекомендуется использовать для гидролиза образцы белка/пептида массой более 30 нг.
МЕТОД 5. Предколоночная дериватизация с о-фталевым альдегидом (ОФА)
ОФА в присутствии тиольных соединений реагирует с первичной аминогруппой, образуя производные изоиндола с сильной флуоресценцией. Метод не позволяет определять вторичные аминокислоты (иминокислоты, например, пролин). В качестве тиольных соединений могут быть использованы 2-меркаптоэтанол и 3-меркаптопропионовая кислота. ОФА не обладает флуоресценцией и, следовательно, не образует мешающих пиков на хроматограмме. Кроме того, его растворимость и стабильность в водном растворе, наряду с высокой скоростью реакции, позволяют проводить автоматическую дериватизацию с использованием программируемого автоматического инжектора (автосэмплера) для смешивания испытуемого образца и реагента(-ов). Основным недостатком ОФА является его неспособность реагировать с вторичными аминокислотами (например, пролином). Компенсировать данный недостаток можно сочетанием с методиками, описанными в методах 7 или 8.
За предколоночной дериватизацией аминокислот с ОФА следует дальнейшее разделение смеси ОФА-производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с последующим флуориметрическим детектированием. Так как ОФА-производные аминокислот неустойчивы, анализ методом ВЭЖХ проводят сразу после дериватизации. Использование программируемого автоматического инжектора для проведения дериватизации позволяет производить ввод проб в хроматограф строго через равные промежутки времени после ее завершения, что минимизирует вариабельность получаемых результатов, связанную с нестабильностью ОФА-производных аминокислот во времени. Интенсивность флуоресценции ОФА-производных аминокислот измеряют при длине волны возбуждения 348 нм и длине волны эмиссии 450 нм.
Заявленный предел обнаружения при флуориметрическом детектировании составляет около 50 фмоль, однако на практике предел обнаружения остается на уровне 1 пмоль.
Реагентом-аналогом ОФА является 2,3-нафталиндиальдегид (НДА), который также успешно используется для предколоночной дериватизации аминокислот. Преимуществом НДА-производных аминокислот является их относительная стабильность по сравнению с ОФА-производными.
МЕТОД 6. Предколоночная дериватизация с (диметиламино)-азобензолсульфонилхлоридом (ДАБС-Cl)
Производные аминокислот с ДАБС-Cl (ДАБС-аминокислоты), обладают высокой стабильностью и имеют максимум поглощения при 436 нм в видимой области спектра. ДАБС-производные всех аминокислот белкового происхождения, могут быть разделены на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием градиентного элюирования и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и водного буферного раствора.
Метод позволяет проводить с одинаковой чувствительностью анализ как аминокислот, так и иминокислот (таких как пролин). Метод дериватизации с ДАБС-Cl позволяет количественно определять остатки триптофана, полученные при гидролизе белка/пептида с сульфоновыми кислотами (такими как меркаптоэтансульфоновая, кислота п-толуолсульфоновая или метансульфоновая кислота) как указано в методе 2, описанном в разделе «Гидролиз белка». Другие лабильные остатки аминокислот, такие как аспарагин и глутамин, можно анализировать, как и прежде, после их превращения, соответственно, в диаминопропионовую и диаминомасляную кислоты под действием бис-(1,1-трифторацетокси)-йодбензола, как указано в методе 11, описанном в разделе «Гидролиз белка».
В качестве внутреннего стандарта для этого метода не может быть использован норлейцин, так как его производное элюируется в области хроматограммы со скоплением пиков производных первичных аминокислот. В качестве внутреннего стандарта используют нитротирозин, который элюируется в свободной от пиков области хроматограммы.
Предел обнаружения ДАБС-аминокислот обычно составляет 1 пмоль. Предел количественного определения ДАБС-аминокислот составляет 2 — 5 пмоль. Для проведения одного анализа требуется всего лишь 10 — 30 нг дериватизированного ДАБС-Cl белкового гидролизата.
МЕТОД 7. Предколоночная дериватизация с 9-фторенилметилхлорформиатом
ФМОК-Cl взаимодействует с первичными и вторичными аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Реакция протекает в мягких условиях в водном растворе в течение 30 с. Получаемые производные аминокислот стабильны, за исключением производных гистидина, подвергающихся постепенной деградации. Несмотря на то, что ФМОК-Cl сам по себе обладает флуоресценцией, избыток реагента и флуоресцирующие побочные продукты реакции могут быть удалены из реакционной смеси без потерь ФМОК-производных аминокислот.
ФМОК-аминокислоты могут быть разделены на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Разделение проводят по программе градиентного элюирования с линейным изменением состава подвижной фазы от смеси «ацетонитрил : метанол : ацетатный буферный раствор» (10:40:50 (об./об./об.)) до смеси «ацетонитрил : ацетатный буферный раствор» (50:50 (об./об.)), что позволяет разделить 20 производных аминокислот в течение 20 мин. Элюируемые из колонки производные аминокислот детектируют при длине волны возбуждения 260 нм и длине волны эмиссии 313 нм.
Пределы обнаружения производных аминокислот находятся в нижнем фемтомолярном диапазоне. Линейность сигнала для большинства аминокислот наблюдается в области 0,1 — 50 мкмоль/л.
МЕТОД 8. Предколоночная дериватизация с 7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом (НБФ)
7-фтор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазолом (7-фтор-4-нитробензофуразан, НБФ) взаимодействует с первичными и вторичными аминокислотами с образованием производных с сильной флуоресценцией. Аминокислоты дериватизируются НБФ в течение 5 мин при температуре 60 °C.
НБФ-производные аминокислот могут быть разделены на колонке, заполненной октадецилсиликагелем, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием программы градиентного элюирования и подвижной фазы, состоящей из ацетонитрила и водного буферного раствора. В результате 17 производных аминокислот разделяются в течение 35 мин. В качестве внутреннего стандарта может быть использована \epsilon - \text{аминокапроновая} кислота, которая элюируется в свободной от пиков области хроматограммы. Элюируемые из колонки производные аминокислот детектируют при длине волны возбуждения 480 нм и длине волны эмиссии 530 нм.
Чувствительность этого метода почти такая же, как в предколоночной дериватизации с ОФА (метод 5), за исключением пролина, который не реагирует с ОФА (преимущественное отличие метода с НБФ). Предел обнаружения для каждой аминокислоты составляет около 10 фмоль. Анализ проводят с использованием 1,5 мг белкового гидролизата в предколоночной реакционной смеси.
МЕТОД 9. Использование масс-спектрометрического детектирования для определения производных аминокислот, полученных предколоночной дериватизацией.
Масс-спектрометрическое детектирование в режимах мониторинга по выделенным ионам (MS) или мониторинга множественных реакций (MS/MS) с электрораспылительной или химической ионизацией при атмосферном давлении позволяет проводить высокочувствительное и селективное определение производных аминокислот после предколоночной дериватизации с различными реагентами, описанными выше. Разделение производных аминокислот обычно осуществляется методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в режиме градиентного элюирования при использовании элюентов на основе легколетучих компонентов (органические кислоты и их аммонийные соли, гидрокарбонат аммония, аммиак и алкиламины и пр.). Высокая селективность масс-спектрометрического детектирования позволяет выполнять экспрессный анализ сложных смесей аминокислот без необходимости достижения полноты разделения критичных пар и групп пиков. Пределы обнаружения производных аминокислот обычно составляют несколько нг/мл.
Использование масс-спектрометрического детектирования для определения нативных аминокислот также возможно, однако характеризуется значительно меньшей чувствительностью.
МЕТОД 10. Определение нативных аминокислот с импульсным амперометрическим детектированием
Аминокислоты в белковом/пептидном гидролизате разделяются ионохроматографически на колонке, заполненной гидрофобной полимерной анионообменной смолой с тетраалкиламмониевыми функциональными группами. Разделение проводят в градиентном режиме путем изменения концентрации гидроксид- и ацетат-ионов в водном элюенте. Детектирование аминокислот в элюате осуществляется при помощи импульсного амперометрического детектора по току окисления между золотым рабочим электродом и комбинированным электродом сравнения (pH/Ag/AgCl). Развертка потенциала между рабочим электродом и электродом сравнения во времени осуществляется по специальной программе.
Пределы обнаружения аминокислот находятся в середине фемтомолярного — начале пикомолярного диапазона концентраций. Отклик детектора линеен в пределах 3 порядков концентрации аминокислот.
МЕТОД 11. Определение нативных аминокислот с испарительным детектором светорассеяния
Для разделения аминокислот используются методы ионообменной или ион-парной хроматографии с элюентами на основе легколетучих компонентов (органические кислоты и их аммонийные соли, гидрокарбонат аммония, аммиак и алкиламины, перфорированные органически кислоты и пр.). Возможно также использование жидкостной хроматографии гидрофобных взаимодействий (HILIC).
В ионообменном варианте аминокислоты в белковом/пептидном гидролизате разделяются на сульфокатионообменной колонке в градиентном режиме элюирования. В качестве компонентов подвижной фазы для создания бинарного градиента по ионной силе и pH используются водные буферные растворы на основе ацетата аммония и трифторуксусной кислоты, что позволяет добиться разделения 18 протеиногенных аминокислот в течение 1 часа. Детектирование аминокислот выполняют при температуре испарительной трубки детектора 70 °C и скорости потока газа-носителя (азот) 1,5 л/мин. Пределы обнаружения аминокислот составляют от нескольких сотен пмоль до нескольких нмоль.
Альтернативным является использование ион-парного разделения аминокислот на колонке, заполненной октадецилсиликагелем. В качестве компонентов подвижной фазы для градиентного элюирования используются водный раствор, содержащий 0,1 — 0,5% трифторуксусной кислоты и 0,2 — 0,3% гептафтормасляной кислоты, и метанол или ацетонитрил в качестве органического модификатора. Детектирование аминокислот выполняют при температуре испарительной трубки детектора 40 — 50 °C и скорости потока газа-носителя (азот) 2,5 л/мин. Пределы обнаружения аминокислот составляют от десятков до сотен нг.
Отклик испарительного детектора светорассеяния нелинейно зависит от концентрации аминокислот в растворе, для получения линейных калибровочных зависимостей используют билогарифмические координаты или используют нелинейную калибровку, аппроксимированную полиномом 2-ой степени.
Оптимальные (в рамках рассматриваемой аналитической задачи) параметры работы испарительного детектора светорассеяния (температуры испарительной трубки и распылителя, скорость потока (или давление) газа-носителя) могут варьироваться в зависимости от модели детектора и анализируемого образца и должны подбираться в ходе валидации методики аминокислотного анализа.
МЕТОД 12. Определение нативных аминокислот с детектором заряженного аэрозоля
Для разделения аминокислот в белковом/пептидном гидролизате используют те же варианты хроматографического разделения, что и при использовании испарительного детектора светорассеяния. Настройки детектора (температуру испарителя, давление газа-носителя) подбирают в зависимости от модели детектора и анализируемого образца в ходе валидации методики. Пределы обнаружения аминокислот составляют от десятков до сотен нг.
Отклик детектора нелинейно зависит от концентрации аминокислот в растворе, для получения линейных калибровочных зависимостей используют билогарифмические координаты или используют нелинейную калибровку, аппроксимированную полиномом 2-ой степени. Детектор характеризуется лучшей чувствительностью и более широким динамическим диапазоном по сравнению с испарительным детектором светорассеяния.
Проверка пригодности хроматографической системы
Хроматографические методики аминокислотного анализа, в зависимости от их направленности в рамках решаемой аналитической задачи (подтверждение подлинности, количественное определение, контроль примесей), должны соответствовать всем стандартным требованиям, предъявляемым к хроматографическим методикам контроля качества. В общем случае, главной особенностью аминокислотного анализа является необходимость одновременного определения большого числа аналитов, концентрации которых могут значительно (в десятки раз) отличаться друг от друга. Необходимость многокомпонентного определения накладывает жесткие требования к разрешающей способности хроматографической системы, которая в идеале должна обеспечивать полное разделение пиков определяемых соединений (аминокислот или их производных) за максимально короткое время. На практике достичь полного разделения пиков аминокислот (или их производных) между собой и с другими пиками (компоненты плацебо, мешающие вещества, избыток реагента и побочные продукты реакции) достаточно сложно, особенно в рамках экспрессной методики. Такие пары и группы пиков, для которых не удается добиться полного разделения (так называемые «критичные»), требуют пристального внимания при проверке пригодности хроматографической системы, а установленные нормы для разрешения между этими пиками должны быть тщательно валидированы.
Хроматографическая методика аминокислотного анализа должна включать в себя следующие пункты в рамках проверки пригодности хроматографической системы:
- проверку воспроизводимости (ОСО, %) и стабильности времен удерживания пиков аналитов и внутреннего стандарта на хроматограммах стандартного раствора. Оценка воспроизводимости выполняется по серии последовательных вводов стандартного раствора в начале последовательности анализов, а оценка стабильности — по всем вводам стандартного раствора в последовательности. (контроль работы прибора)
- проверку воспроизводимости (ОСО, %) и стабильности площадей пиков внутреннего стандарта на хроматограммах стандартного раствора. Оценка воспроизводимости выполняется по серии последовательных вводов стандартного раствора в начале последовательности анализов, а оценка стабильности — по всем вводам стандартного раствора в последовательности. (контроль работы прибора и воспроизводимость процедуры дериватизации)
- проверку воспроизводимости (ОСО, %) и стабильности для отношения площади пика каждой аминокислоты к площади пика внутреннего стандарта. Оценка воспроизводимости выполняется по серии последовательных вводов стандартного раствора в начале последовательности анализов, а оценка стабильности — по всем вводам стандартного раствора в последовательности. (контроль процедуры дериватизации отдельных аминокислот и контроль стабильности отдельных производных).
- проверку факторов асимметрии пиков аналитов и внутреннего стандарта.
- проверку разрешения для пиков, образующих «критичные» пары и группы.
- проверку чувствительности для аналитов, концентрация которых близка к пределу количественного определения (нижней границе определяемых концентраций методики).
- проверку значений открываемости, рассчитанных для определяемых аминокислот в контрольном образце (белка/пептида или ином), если методика предусматривает использование контрольного образца.
- проверку чистоты холостой пробы от определяемых аминокислот.
Расчет и анализ полученных данных
При определении содержания аминокислот в белковом/пептидном гидролизате следует учитывать, что при кислотном гидролизе триптофан и цистеин разрушаются, серин и треонин разрушаются частично, в то время как связи по остаткам изолейцина и валина расщепляются не полностью. Метионин во время кислотного гидролиза может подвергаться окислению, а некоторые широко распространенные аминокислоты (например, глицин и серин) могут попасть в образец образца извне. Использование вакуума (менее 0,2 мм рт. ст., или 26,7 Па) или заполнение пространства реакционного сосуда инертным газом (аргон) может уменьшить степень окислительной деструкции в ходе парофазного гидролиза. По этим причинам результаты количественного определения, полученные для цистеина, триптофана, треонина, изолейцина, валина, метионина, глицина и серина в белковом/пептидном гидролизате могут быть непостоянными и потребуют дальнейших исследований.
Мольный процент аминокислоты — это количество остатков определенной аминокислоты на 100 остатков в белке. Эта величина может быть полезной при оценке данных, полученных при аминокислотном анализе, когда молекулярная масса исследуемого белка неизвестна. Информация также может быть использована для подтверждения подлинности белка/пептида или для других целей. Мольный процент каждой аминокислоты в испытуемом образце рассчитывают по формуле:
где: rU — молярная концентрация рассматриваемой аминокислоты (нмоль/мкл);
r — суммарная молярная концентрация всех аминокислот в испытуемом образце (нмоль/мкл).
Сравнение полученных в результате испытаний мольных процентов аминокислот с известными данными для белков может помочь установить или подтвердить подлинность испытуемого образца белка.
Образцы неизвестного белка. Этот метод расчета может быть использован для оценки концентрации белка в образце неизвестного белка с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. Массу каждой высвобождаемой аминокислоты рассчитывают в микрограммах по формуле:
где: m — количество аминокислоты, определенное в испытании (нмоль);
Mr — средняя молекулярная масса данной аминокислоты, скорректированная с учетом массы молекулы воды отщепленной при образовании пептидной связи (г/моль).
Суммируя массы высвобожденных аминокислот, получают общую массу анализируемого белка после соответствующей коррекции с учетом частично или полностью разрушенных аминокислот. Если известна молекулярная масса неизвестного белка (например, определенная методом гель-электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия или методом масс-спектрометрии), можно предсказать аминокислотный состав неизвестного белка.
Число остатков каждой аминокислоты рассчитывают по формуле:
\frac{m}{(\frac{1000M}{M_{rt}})} ,
где: m — количество аминокислоты, определенное в испытании (нмоль);
Mrt — молекулярная масса неизвестного белка (г/моль).
Образцы известного белка. Этот метод расчета может быть использован для установления аминокислотного состава и концентрации белка в образце белка известной молекулярной массы и аминокислотного состава с использованием данных, полученных при аминокислотном анализе. При анализе состава известного белка учитывают, что некоторые аминокислоты высвобождаются хорошо, в то время как значение открываемости, рассчитанное для других аминокислот, может значительно отличаться от 100% вследствие полного или частичного разрушения (например, триптофан, цистеин, треонин, серин, метионин), неполного расщепления связей (например, изолейцин и валин), контаминации свободными аминокислотами (например, глицин и серин). По этой причине, количественного определения белка используют аминокислоты, значения открываемости, рассчитанные для которых, — наилучшие. Хорошо открываемыми аминокислотами обычно являются: аспартат-аспарагин, глутамат-глутамин, аланин, лейцин, фенилаланин, лизин и аргинин. Этот перечень может изменяться на основании наработанного собственного опыта по проведению аминокислотного анализа. Для количественного определения белка количество каждой хорошо открываемой аминокислоты в нмоль, делят на предполагаемое количество остатков этой аминокислоты в белке. Рассчитывают среднее значение содержания белка. Значения содержания белка, установленные по количеству каждой хорошо открываемой аминокислоты, должны быть равномерно распределены относительно среднего значения. В тех случаях, когда значения содержания белка, определенные по каким-либо из этих аминокислот, имеют неприемлемые отклонения (обычно более 5%) от средней величины, их отбрасывают. С учетом оставшихся значений пересчитывают среднее содержание белка в испытуемом образце. Для определения аминокислотного состава испытуемого образца содержание каждой аминокислоты делят на рассчитанное среднее значение содержания белка. Относительную ошибку определения аминокислотного состава рассчитывают в процентах по формуле:
где: m — экспериментально установленное количество аминокислоты (нмоль/аминокислотный остаток);
mS — число аминокислотных остатков, соответствующих рассматриваемой аминокислоте, в составе белка;
Mrt — молекулярная масса неизвестного белка (г/моль).
Среднее значение относительной ошибки определения аминокислотного состава является средним значением абсолютных величин относительных ошибок определения каждой аминокислоты, исключая данные по триптофану и цистеину. Средняя величина относительной ошибки определения аминокислотного состава может дать важную информацию об устойчивости анализа во времени. Соответствие найденного аминокислотного состава образца белка и известного состава может служить подтверждением подлинности и чистоты белка в испытуемом образце.