Изменение № 1 ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа»
(утв. и введено в действие Приказом Ростехрегулирования от 25.12.2008 № 731-ст)
Внимание
Документ утратил силу в связи с изданием Приказа Ростехрегулирования от 24.04.2009 № 142-ст. Документ введен в действие с 1 июля 2009 года с правом досрочного применения.
Утверждено и введено в действие
Приказом Федерального
агентства по техническому
регулированию и метрологии
от 25 декабря 2008 г. № 731-ст
ИЗМЕНЕНИЕ № 1 ГОСТ Р 52174-2003 «БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ. СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА»
65.160,
67.060,
67.080,
67.100,
67.120,
67.140,
67.140.30,
67.160,
67.180,
67.190,
67.200,
67.220
Группа Н11,
Н13,
Н17,
Н23,
Н31 — Н34,
Н36,
Н41 — Н43,
Н51 — Н56,
Н62,
Н65,
Н68,
Н72 — Н74,
Н81,
Н97,
С11,
С23 — С25,
С32 — С36,
С41 — С45,
С52
1 июля 2009 года
Разделы 1 (первый абзац), 5. Заменить слова: «пищевое сырье» на «продовольственное сырье»;
дополнить абзацем:
«Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением технологии FLASH изложен в обязательном приложении Д».
Пункт 4.1. Исключить слова: «или „Био-1“ [23]».
Пункт 4.2. Исключить слова: «или „Евробио-ВТО“ [24]».
Пункт 6.2.1 дополнить абзацем:
«6.2.1. Дополнительно готовят отрицательную контрольную пробу. Для этого в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3 помещают 50 мм3 особо чистой воды по 4.30 и 400 мм3 буфера экстракции по 6.1.8. Дальнейшее приготовление и хранение отрицательной контрольной пробы — в соответствии с требованиями 6.2.2 — 6.2.6 настоящего стандарта <*>».
<*> Отрицательную контрольную пробу по 6.2.1 подготавливают только при применении технологии FLASH (приложение Д).
Пункт 8.1. Исключить слова: «или „Био-1“ [23]».
Приложение Д изложить в новой редакции:
(обязательное)
МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ
ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ
ТЕХНОЛОГИИ FLASH
Метод основан на технологии FLASH, то есть проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфической гибридизацией флуоресцентномеченых зондов в процессе амплификации и последующей детекции продуктов амплификации при помощи ПЦР-детектора «Джин». Чувствительность метода — не менее 100 копий ДНК на реакционный объем.
Д.2.1. ПЦР-детектор «Джин»: специализированный флуориметр, предназначенный для регистрации результатов ПЦР при использовании комплектов реагентов, основанных на принципах флуоресцентной детекции.
Д.3. Аппаратура, материалы и реактивы — в соответствии с разделом 4 настоящего стандарта со следующими дополнениями:
Д.3.1. Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин» [23].
Д.3.2. ПЦР-детектор «Джин» [24] или ПЦР-детектор «Джин-4» [25].
Д.3.3. Четыре комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК в микроцентрифужных пробирках для амплификации — «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt» [26], каждый из которых включает:
- 50 микроцентрифужных пробирок для амплификации, запечатанных парафином, содержащих по 20 мм3 смеси, включающей ПЦР-буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентномеченые зонды, внутренний контрольный образец ДНК;
- 500 мм3 раствора Taq-полимеразы — одна микроцентрифужная пробирка;
- 200 мм3 буферного раствора «ПЦР-буфер» — одна микроцентрифужная пробирка;
- 1,0 см3 минерального масла — одна микроцентрифужная пробирка;
- положительная контрольная проба ДНК, 150 мм3 — одна микроцентрифужная пробирка.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных в приложении Д и разделе 4 настоящего стандарта.
Отбор проб — в соответствии с требованиями раздела 5 настоящего стандарта.
Д.5. Подготовка к проведению анализа
Д.5.1. Приготовление растворов
Приготовление растворов осуществляется в соответствии с 6.1 настоящего стандарта.
Д.5.2. Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)
Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК) — в соответствии с требованиями 6.2 настоящего стандарта
Д.6.1. Растворы ДНК, подготовленные в соответствии с Д.5 и 6.2, анализируют при помощи комплектов для амплификации ДНК: «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt» по Д.3.3.
Д.6.2. Маркируют микроцентрифужные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации по Д.3.3 в количестве, соответствующем количеству анализируемых растворов ДНК. Дополнительно маркируют:
- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К+» (положительный контроль);
- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К-» (отрицательный контроль);
- две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «ФОН».
Д.6.3. В промаркированные микроцентрифужные пробирки по Д.6.2, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», не повреждая слой парафина, микродозатором по 4.12 настоящего стандарта вносят по 10 мм3 раствора Taq-полимеразы по Д.3.3, тщательно перемешанного на аппарате для встряхивания по 4.10 настоящего стандарта. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» по Д.6.2, микродозатором вносят по 10 мм3 ПЦР-буфера по Д.3.3.
Д.6.4. Во все микроцентрифужные пробирки по Д.6.3 микродозатором вносят по 20 мм3 минерального масла по Д.3.3, плотно закрывают пробирки крышками.
Д.6.5. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», «К-» и «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 анализируемого раствора ДНК по 6.2 настоящего стандарта.
Д.6.6. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» и «К-» по Д.6.4, не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 отрицательной контрольной пробы по 6.2 настоящего стандарта.
Д.6.7. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, промаркированные как «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 положительной контрольной пробы из состава соответствующего комплекта реагентов для амплификации ДНК по Д.3.3.
Д.6.8. Все микроцентрифужные пробирки, подготовленные по Д.6.5 — Д.6.7, плотно закрывают крышками и центрифугируют на настольной микроцентрифуге по 4.8 настоящего стандарта при частоте вращения 1000\text{мин}^{- 1} в течение 5 — 10 с и сразу же используют для проведения анализа.
Д.6.9. Все микроцентрифужные пробирки по Д.6.8 помещают в амплификатор ДНК по 4.3 настоящего стандарта и проводят ПЦР по программе, указанной в таблице Д.1. При запуске программы указывают объем реакционной смеси, равный 35 мм3.
| Шаг программы | Температура | Время инкубации | Число циклов |
| 1 | 94 °C | 1 мин | 1 |
| 2 | 94 °C 67 °C | 5 с 15 с | 5 |
| 3 | 94 °C 67 °C | 1 с 15 с | 40 |
| 4 | 10 °C | Режим хранения | |
Д.6.10. Все определения должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. При проведении анализа каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции — сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром по 4.14 настоящего стандарта.
Д.7. Обработка результатов анализа
Д.7.1. После прохождения реакции амплификации все микроцентрифужные пробирки по Д.6.9 помещают в ПЦР-детектор «Джин» по Д.3.2 для проведения регистрации результатов ПЦР. В соответствии с руководством по эксплуатации к ПЦР-детектору «Джин» проводят регистрацию результатов ПЦР (пороговые значения для продукта амплификации и для внутреннего контрольного образца указаны в инструкции к комплектам реагентов для амплификации ДНК).
Д.7.2. Учет и интерпретация результатов
Д.7.2.1. Учет и интерпретация результатов анализа осуществляется автоматически при помощи компьютерной программы «Gene» [23]. Результаты анализа отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рисунок Д.1).
Рисунок Д.1. Пример результатов анализа
Д.7.2.2. За положительный результат принимают отображение символа «+» на красном фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Положительный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-35S», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-npt» для анализируемых проб, содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.
Д.7.2.3. За отрицательный результат принимают отображение символа «-» на зеленом фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Отрицательный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-35S», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-npt» для проб, не содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.
Пример оформления протокола испытания — в соответствии с приложением Г настоящего стандарта.
Д.7.2.4. За недостоверный результат принимают отображение символа «нд» на оранжевом фоне или символа «?» на желтом фоне (на рисунке Д.1 желтый фон отсутствует) напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы.
Это может быть вызвано несоблюдением условий анализа или несоблюдением условий выделения ДНК. В случае получения недостоверного результата определение повторяют.
Д.7.2.5. В случае отображения символа «+» на красном фоне напротив обозначения отрицательной контрольной пробы в графе «Результат» таблицы результаты анализа считают ложноположительными.
Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае определение повторяют с заменой реактивов на свежеприготовленные.
При проведении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с разделом 9 настоящего стандарта».
Стандарт дополнить приложением — Е:
(справочное)
1. Центр биологических Компьютерная программа «Imageware» для микрочипов ИМБ РАН анализа изображений, полученных при помощи «Чипдетектора-03»
2. ТУ 9443-001-02699501-2003 Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чипдетектор-03»
3. ТУ 9452-001-4648062-98 Амплификатор «Терцик МС-2»
4. ТУ 42-619-61 Термостат суховоздушный ТВР-25
5. Корпорация «Эппендорф», Микроцентрифуга настольная 5415С, кат. № 5425 000.014 -1 13000 мин
6. Корпорация «Хеликон», кат. Мешалка магнитная с подогревом № MSH-300
7. Корпорация «Хеликон», кат. Аппарат для встряхивания (центрифуга — № FV-2400 вортекс)
8. Корпорация «Хеликон», кат. Штативы под микроцентрифужные пробирки № RP-30 и RP-80
9. Корпорация «Хеликон», кат. Наконечники с фильтром для микропипеток № FA 104; FA 108; FA 111; FA 113N
10. ТУ 6-09-11-1721-83 Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат
11. ТУ 6-09-4292-76 Трис(оксиметил)аминометан [NH C(CH OH) ] 2 2 3
12. Корпорация «Сигма Алдрич» Додецилсульфат натрия (SDS) («Sigma»), кат. № L-6026
13. Корпорация «Сигма Алдрич» Фермент Taq-полимераза 5 Ед.акт./мм3 («Sigma»), кат. № Д 1806
14. Корпорация «Хеликон», Гуанидин тиоцианат [CH N -HSCN] кат. № Am-038-0.5 3 3
15. Корпорация «Хеликон», N-[2-оксиэтил]пиперазин-N'-[2-
кат. N Am-0485-01 этансульфоновая кислота] (HEPES) [C H N J SNa]
8 17 2 4
16. Корпорация «Хеликон», Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по кат. № Н-4044-0.4 25 мМ каждого
17. ИФР РАН Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 6 нг/мм3 или 10 копий/мм3
18. ИФР РАН Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 6 100 нг/мм3 или 10 копий/мм3
19. ТУ 46-22-603-75 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом
20. Центр биологических Раствор водный праймеров «ПР-1» микрочипов ИМБ РАН
21. Центр биологических Микрочипы гелевые с иммобилизованными микрочипов ИМБ РАН олигонуклеотидами
22. Методические рекомендации Государственный Комитет Санэпиднадзора
по проведению работ в Российской Федерации; N 06-19/52-17 от диагностических лабораториях, 15.06.95
использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения
23. ООО «НПО ДНК-Технология» Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин»
24. ТУ 9443-005-46482062-2003 ПЦР-детектор «Джин»
25. ТУ 9443-001-96301278-2007 ПЦР-детектор «Джин-4»
26. ООО «БИОМАСТЕР-ПРОМ» Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt»
------------------------------------------------------------------