Изменение № 1 ГОСТ Р 52174-2003 «Биологическая безопасность. Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа»

(утв. и введено в действие Приказом Ростехрегулирования от 25.12.2008 № 731-ст)

от 25 декабря 2008 г. № 731-ст

ИЗМЕНЕНИЕ № 1 ГОСТ Р 52174-2003 «БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ. СЫРЬЕ И ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА»

1 июля 2009 года

Разделы 1 (первый абзац), 5. Заменить слова: «пищевое сырье» на «продовольственное сырье»;

дополнить абзацем:

«Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением технологии FLASH изложен в обязательном приложении Д».

Пункт 4.1. Исключить слова: «или „Био-1“ [23]».

Пункт 4.2. Исключить слова: «или „Евробио-ВТО“ [24]».

Пункт 6.2.1 дополнить абзацем:

«6.2.1. Дополнительно готовят отрицательную контрольную пробу. Для этого в чистую стерильную микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 см3 помещают 50 мм3 особо чистой воды по 4.30 и 400 мм3 буфера экстракции по 6.1.8. Дальнейшее приготовление и хранение отрицательной контрольной пробы — в соответствии с требованиями 6.2.2 — 6.2.6 настоящего стандарта <*>».

---

<*> Отрицательную контрольную пробу по 6.2.1 подготавливают только при применении технологии FLASH (приложение Д).

Пункт 8.1. Исключить слова: «или „Био-1“ [23]».

Приложение Д изложить в новой редакции:

(обязательное)

ТЕХНОЛОГИИ FLASH

Д.1. Сущность метода

Метод основан на технологии FLASH, то есть проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфической гибридизацией флуоресцентномеченых зондов в процессе амплификации и последующей детекции продуктов амплификации при помощи ПЦР-детектора «Джин». Чувствительность метода — не менее 100 копий ДНК на реакционный объем.

Д.2. Определения

Д.2.1. ПЦР-детектор «Джин»: специализированный флуориметр, предназначенный для регистрации результатов ПЦР при использовании комплектов реагентов, основанных на принципах флуоресцентной детекции.

Д.3. Аппаратура, материалы и реактивы — в соответствии с разделом 4 настоящего стандарта со следующими дополнениями:

Д.3.1. Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин» [23].

Д.3.2. ПЦР-детектор «Джин» [24] или ПЦР-детектор «Джин-4» [25].

Д.3.3. Четыре комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК в микроцентрифужных пробирках для амплификации — «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt» [26], каждый из которых включает:

• 50 микроцентрифужных пробирок для амплификации, запечатанных парафином, содержащих по 20 мм3 смеси, включающей ПЦР-буфер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, праймеры, флуоресцентномеченые зонды, внутренний контрольный образец ДНК;
• 500 мм3 раствора Taq-полимеразы — одна микроцентрифужная пробирка;
• 200 мм3 буферного раствора «ПЦР-буфер» — одна микроцентрифужная пробирка;
• 1,0 см3 минерального масла — одна микроцентрифужная пробирка;
• положительная контрольная проба ДНК, 150 мм3 — одна микроцентрифужная пробирка.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных в приложении Д и разделе 4 настоящего стандарта.

Д.4. Отбор проб

Отбор проб — в соответствии с требованиями раздела 5 настоящего стандарта.

Д.5. Подготовка к проведению анализа

Д.5.1. Приготовление растворов

Приготовление растворов осуществляется в соответствии с 6.1 настоящего стандарта.

Д.5.2. Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК)

Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК) — в соответствии с требованиями 6.2 настоящего стандарта

Д.6. Проведение анализа

Д.6.1. Растворы ДНК, подготовленные в соответствии с Д.5 и 6.2, анализируют при помощи комплектов для амплификации ДНК: «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt» по Д.3.3.

Д.6.2. Маркируют микроцентрифужные пробирки с запечатанной парафином смесью для амплификации по Д.3.3 в количестве, соответствующем количеству анализируемых растворов ДНК. Дополнительно маркируют:

• две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К+» (положительный контроль);
• две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «К-» (отрицательный контроль);
• две микроцентрифужные пробирки для ПЦР-амплификации ДНК маркируют как «ФОН».

Д.6.3. В промаркированные микроцентрифужные пробирки по Д.6.2, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», не повреждая слой парафина, микродозатором по 4.12 настоящего стандарта вносят по 10 мм3 раствора Taq-полимеразы по Д.3.3, тщательно перемешанного на аппарате для встряхивания по 4.10 настоящего стандарта. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» по Д.6.2, микродозатором вносят по 10 мм3 ПЦР-буфера по Д.3.3.

Д.6.4. Во все микроцентрифужные пробирки по Д.6.3 микродозатором вносят по 20 мм3 минерального масла по Д.3.3, плотно закрывают пробирки крышками.

Д.6.5. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, за исключением пробирок, промаркированных как «ФОН», «К-» и «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 анализируемого раствора ДНК по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.6. В микроцентрифужные пробирки, промаркированные как «ФОН» и «К-» по Д.6.4, не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 отрицательной контрольной пробы по 6.2 настоящего стандарта.

Д.6.7. В микроцентрифужные пробирки по Д.6.4, промаркированные как «К+», не повреждая слой парафина, микродозатором вносят по 5,0 мм3 положительной контрольной пробы из состава соответствующего комплекта реагентов для амплификации ДНК по Д.3.3.

Д.6.8. Все микроцентрифужные пробирки, подготовленные по Д.6.5 — Д.6.7, плотно закрывают крышками и центрифугируют на настольной микроцентрифуге по 4.8 настоящего стандарта при частоте вращения 1000\text{мин}^{- 1} в течение 5 — 10 с и сразу же используют для проведения анализа.

Д.6.9. Все микроцентрифужные пробирки по Д.6.8 помещают в амплификатор ДНК по 4.3 настоящего стандарта и проводят ПЦР по программе, указанной в таблице Д.1. При запуске программы указывают объем реакционной смеси, равный 35 мм3.

Таблица Д.1

Программа проведения ПЦР

Шаг программы	Температура	Время инкубации	Число циклов
1	94 °C	1 мин	1
2	94 °C 67 °C	5 с 15 с	5
3	94 °C 67 °C	1 с 15 с	40
4	10 °C	Режим хранения

Д.6.10. Все определения должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [22]. При проведении анализа каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции — сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром по 4.14 настоящего стандарта.

Д.7. Обработка результатов анализа

Д.7.1. После прохождения реакции амплификации все микроцентрифужные пробирки по Д.6.9 помещают в ПЦР-детектор «Джин» по Д.3.2 для проведения регистрации результатов ПЦР. В соответствии с руководством по эксплуатации к ПЦР-детектору «Джин» проводят регистрацию результатов ПЦР (пороговые значения для продукта амплификации и для внутреннего контрольного образца указаны в инструкции к комплектам реагентов для амплификации ДНК).

Д.7.2. Учет и интерпретация результатов

Д.7.2.1. Учет и интерпретация результатов анализа осуществляется автоматически при помощи компьютерной программы «Gene» [23]. Результаты анализа отображаются на экране компьютера в виде таблицы (рисунок Д.1).

Рисунок Д.1. Пример результатов анализа

Д.7.2.2. За положительный результат принимают отображение символа «+» на красном фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Положительный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-35S», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-npt» для анализируемых проб, содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.

Д.7.2.3. За отрицательный результат принимают отображение символа «-» на зеленом фоне напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы. Отрицательный результат фиксируется в микроцентрифужных пробирках комплектов реагентов «СКАН-35S», «СКАН-nos», «СКАН-gus», «СКАН-npt» для проб, не содержащих нуклеотидные последовательности, характерные для промотора 35S, промотора nos, гена gus, гена nptII соответственно.

Пример оформления протокола испытания — в соответствии с приложением Г настоящего стандарта.

Д.7.2.4. За недостоверный результат принимают отображение символа «нд» на оранжевом фоне или символа «?» на желтом фоне (на рисунке Д.1 желтый фон отсутствует) напротив обозначения анализируемой пробы в графе «Результат» таблицы.

Это может быть вызвано несоблюдением условий анализа или несоблюдением условий выделения ДНК. В случае получения недостоверного результата определение повторяют.

Д.7.2.5. В случае отображения символа «+» на красном фоне напротив обозначения отрицательной контрольной пробы в графе «Результат» таблицы результаты анализа считают ложноположительными.

Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае определение повторяют с заменой реактивов на свежеприготовленные.

Д.8. Требования безопасности

При проведении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности в соответствии с разделом 9 настоящего стандарта».

Стандарт дополнить приложением — Е:

(справочное)

1. Центр биологических Компьютерная программа «Imageware» для микрочипов ИМБ РАН анализа изображений, полученных при помощи «Чипдетектора-03»

2. ТУ 9443-001-02699501-2003 Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов «Чипдетектор-03»

3. ТУ 9452-001-4648062-98 Амплификатор «Терцик МС-2»

4. ТУ 42-619-61 Термостат суховоздушный ТВР-25

5. Корпорация «Эппендорф», Микроцентрифуга настольная 5415С, кат. № 5425 000.014 -1 13000 мин

6. Корпорация «Хеликон», кат. Мешалка магнитная с подогревом № MSH-300

7. Корпорация «Хеликон», кат. Аппарат для встряхивания (центрифуга — № FV-2400 вортекс)

8. Корпорация «Хеликон», кат. Штативы под микроцентрифужные пробирки № RP-30 и RP-80

9. Корпорация «Хеликон», кат. Наконечники с фильтром для микропипеток № FA 104; FA 108; FA 111; FA 113N

10. ТУ 6-09-11-1721-83 Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат

11. ТУ 6-09-4292-76 Трис(оксиметил)аминометан [NH C(CH OH) ] 2 2 3

12. Корпорация «Сигма Алдрич» Додецилсульфат натрия (SDS) («Sigma»), кат. № L-6026

13. Корпорация «Сигма Алдрич» Фермент Taq-полимераза 5 Ед.акт./мм3 («Sigma»), кат. № Д 1806

14. Корпорация «Хеликон», Гуанидин тиоцианат [CH N -HSCN] кат. № Am-038-0.5 3 3

15. Корпорация «Хеликон», N-[2-оксиэтил]пиперазин-N'-[2-

   кат. N Am-0485-01                этансульфоновая кислота] (HEPES)
   [C H  N J SNa]

8 17 2 4

16. Корпорация «Хеликон», Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ, по кат. № Н-4044-0.4 25 мМ каждого

17. ИФР РАН Раствор заведомо трансгенной ДНК около 100 6 нг/мм3 или 10 копий/мм3

18. ИФР РАН Раствор заведомо нетрансгенной ДНК около 6 100 нг/мм3 или 10 копий/мм3

19. ТУ 46-22-603-75 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом

20. Центр биологических Раствор водный праймеров «ПР-1» микрочипов ИМБ РАН

21. Центр биологических Микрочипы гелевые с иммобилизованными микрочипов ИМБ РАН олигонуклеотидами

22. Методические рекомендации Государственный Комитет Санэпиднадзора

   по проведению работ в            Российской Федерации; N 06-19/52-17 от
   диагностических лабораториях,    15.06.95

использующих метод полимеразной цепной реакции. Основные положения

23. ООО «НПО ДНК-Технология» Компьютерная программа «Gene» для учета и интерпретации результатов, полученных при помощи ПЦР-детектора «Джин»

24. ТУ 9443-005-46482062-2003 ПЦР-детектор «Джин»

25. ТУ 9443-001-96301278-2007 ПЦР-детектор «Джин-4»

26. ООО «БИОМАСТЕР-ПРОМ» Комплекты реагентов для ПЦР-амплификации ДНК «СКАН-35S», «СКАН-gus», «СКАН-nos» и «СКАН-npt»

------------------------------------------------------------------