ГОСТ 33536-2015. Межгосударственный стандарт. Изделия кондитерские. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
(введен в действие Приказом Росстандарта от 09.10.2015 № 1521-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 4, 2020. Документ введен в действие с 01.01.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 октября 2015 г. № 1521-ст
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МЕЗОФИЛЬНЫХ АЭРОБНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
Confectionery. Method for quantity determination of mesophilic aerobic and facultative-anaerobic microorganisms
67.060
67.140.30
67.180.10
67.190
Дата введения 1 января 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт кондитерской промышленности» (ФГБНУ ВНИИКП)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 сентября 2015 г. № 80-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 09 октября 2015 г. № 1521-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33536-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на кондитерские изделия и кондитерские полуфабрикаты (далее — продукт) и устанавливает метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) — бактерий, дрожжей и плесневых грибов методом глубинного посева в агаризованные питательные среды с использованием специальных приемов снижения ползучего роста микроорганизмов.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям
ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе
ГОСТ ISO/TS 11133-1-2014 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов
ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования
ГОСТ 27543-87 Изделия кондитерские. Аппаратура, материалы, реактивы и питательные среды для микробиологических анализов
ГОСТ 27752-88 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 32751-2014 Изделия кондитерские. Методы отбора проб для микробиологических анализов
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Условия проведения анализа
При подготовке и проведения анализа должны быть соблюдены следующие условия:
4. Требования безопасности
При выполнении анализа необходимо соблюдать требования безопасности при работе с микроорганизмами III — IV групп патогенности, с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.018, электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технических документах на применяемые средства измерений и вспомогательное оборудование.
5. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений и обработке результатов допускается специалист, имеющий опыт работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности, освоивший методы и прошедший инструктаж по технике безопасности при работе с вредными веществами и пожарной безопасности.
6. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда и материалы, питательные среды
6.1 Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) применяют следующие средства измерений, вспомогательное оборудование, посуду и материалы:
- весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности не более +/- 0,001 г;
- часы по ГОСТ 27752;
- плитка электрическая закрытого типа по ГОСТ 14919;
- термостат по ГОСТ ISO 7218;
- спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336;
- пипетки 2-2-2-(20;50) по ГОСТ 29227;
- чашки Петри бактериологические по ГОСТ 25336;
- лупа по ГОСТ 25706;
- вата медицинская по ГОСТ 5556;
- спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья по ГОСТ 5962.
6.2 Допускается применение других средств измерений, посуды с метрологическими характеристиками и вспомогательного оборудования с техническими характеристиками, а также материалов по качеству не ниже указанных.
6.3 Для проведения анализа применяют растворы, реактивы и питательные среды по ГОСТ 10444.1, ГОСТ 27543.
Допускается использование других готовых и сухих дегидратированных, питательных сред, предназначенных для выявления и определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.
6.4 Питательные среды приготавливают и стерилизуют в соответствии с ГОСТ ISO/TS 11133-1.
7. Сущность метода определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
Метод основан на высеве в агаризованную питательную среду определенного количества продукта или его разведения, аэробном культивировании посевов при температуре (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч, подсчете всех выросших видимых колоний и определении количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г продукта.
8. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов
8.1 Отбор и подготовка проб по ГОСТ 32751, ГОСТ 26669.
8.2 Из анализируемой пробы продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить предполагаемое количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г анализируемого продукта.
8.3 Из каждого последовательного разведения суспензию анализируемой пробы по 1 см3 высеивают в чашку Петри, используя одну чашку на каждое разведение. В каждую чашку Петри с посевным материалом не позднее чем через 15 мин добавляют по (18 +/- 2) см3 одной из агаризованных расплавленных и охлажденных до температуры (45 +/- 1) °C питательных сред по 6.3. Для переноса материала из каждого разведения используют отдельную стерильную пипетку, кроме случаев, когда работу ведут от самого большого разведения к самому малому. Чашка Петри должна иметь маркировку с указанием номера пробы, разведения, даты и другой необходимой информации.
8.4 Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки и не загрязняла крышку. Закрытые чашки Петри с посевами расставляют на горизонтальной поверхности до полного застывания питательной среды.
8.5 Для предотвращения роста микроорганизмов, образующих сплошной газон на поверхности питательной среды — ползучий рост, применяют специальные мероприятия по 8.5.1, ограничивающие рост таких микроорганизмов.
8.5.1 На поверхность застывшей питательной среды с посевным материалом наливают 3 — 5 см3 расплавленного и охлажденного до (45 +/- 1) °C голодного (водного) агара по ГОСТ 27543 или агара идентичного питательной среде, которая используется для испытаний.
8.5.2 Поверхность чашки Петри с посевным материалом и застывшей питательной средой подсушивают в боксе в течение 5 — 15 мин до полного высыхания поверхности питательной среды.
8.6 После застывания среды чашки с посевами, переворачивают вверх дном и культивируют в термостате в аэробных условиях при температуре (30 +/- 1) °C в течение 72 ч.
8.7 Учет колоний ведут каждые 24 ч, фиксируя предварительный результат по каждому посеву с последующим окончательным учетом через 72 ч.
8.8 После культивирования посевов подсчитывают количество колоний, выросших на чашках Петри. При подсчете количества микроорганизмов учитывают все выросшие колонии. Подсчет проводят невооруженным глазом или с помощью лупы. Для подсчета отбирают чашки Петри, на которых выросло от 10 до 300 колоний.
8.9 Если подсчет колоний затруднен наличием «сливных колоний», образованных микроорганизмами, имеющими ползучий рост, то учет колоний ведут в зависимости от части пространства чашек Петри, занятого такими колониями. Если ползучий рост наблюдается менее чем на четверти чашки, то колонии подсчитывают на другой части чашки и рассчитывают по их количеству общее количество колоний в чашке. Посредством интерполяции выводится теоретическое число, которое должно соответствовать числу микроорганизмов на всей чашке.
Пример — 1/5 чашки занята колониями, имеющими ползучий рост. На остальной части чашки (4/5) содержится 19 колоний. Теоретическое число колоний на чашке 19 : 4/5 = 23,75. Количество микроорганизмов в пробе рассчитывают в соответствии с разделом 9.
Если ползучий рост микроорганизмов отмечается более чем на одной четверти чашки Петри, то подсчет на такой чашке не проводится. Колонии микроорганизмов, образующих ползучий рост, но выросших в форме цепочек, учитывают как одну колонию.
9. Обработка результатов
9.1 Результаты оценивают по каждой пробе отдельно.
9.2 Результаты подсчета количества колоний по 8.8 пересчитывают и записывают на 1 г продукта или на 1 см3 продукта.
9.3 Метод расчета: общий случай (от 10 до 300 колоний на чашке)
Для получения достоверного результата при подсчете колоний необходимо, чтобы хотя бы в одной чашке содержалось не менее 10 колоний.
Рассчитывают число микроорганизмов N, присутствующих в пробе, как средневзвешенное значение из двух подсчетов последовательных разведений по формуле
N = \frac{\Sigma C}{V \cdot 1,1d} , (1)
где \Sigma C — сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы в одной из них содержалось не менее 10 колоний;
V — объем посевного материала, внесенного в чашку, см3;
d — коэффициент разбавления, соответствующий первому выбранному разведению;
1,1 — статистический коэффициент.
Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. Если третья цифра меньше пяти, предшествующую цифру не изменяют, если третья цифра больше или равна пяти, увеличивают предшествующую цифру на единицу.
Результат выражают числом от 1,0 до 9,9, умноженным на 10 в соответствующей степени, или целым числом, состоящим из двух значащих цифр.
За результат принимают количество микроорганизмов № на грамм продукта или кубический сантиметр (для жидких продуктов).
Пример - Подсчет дал следующие результаты:
N = \frac{210 + 18}{1 \cdot 1,1 \cdot 10^{- 2}} = \frac{228}{0,011} = 20727 .
Выполнив округление результатов в соответствии с вышеописанным, получаем число микроорганизмов, равное 21000 или 2,1·104 на грамм или на кубический сантиметр продукта.
9.4 Метод расчета: малые количества
Метод применяется если одна чашка (анализируемой пробы или исходной суспензии или первого разведения) содержит менее десяти колоний.
Число микроорганизмов от десяти до значения верхнего предела каждого метода находится в диапазоне оптимальной точности. Однако точность быстро уменьшается по мере уменьшения числа колоний менее десяти. В зависимости от цели анализа нижний предел можно определить в соответствии с представленным ниже для количеств менее десяти. Если предел приемлемой относительной точности 50% (которая считается разумной в микробиологии), то нижний предел определения будет равен 4.
Таким образом, результаты, основанные на количестве меньше четырех, следует оценивать как простое выявление присутствия микроорганизмов.
Т.е. если в чашке содержится менее десяти колоний, но не менее четырех, результат вычисляют по методу для общего случая (см. 9.3) и принимают за результат вычисленное количество микроорганизмов на грамм продукта или на кубический сантиметр (для жидких продуктов).
Если общее число составит от одного до трех, точность результата будет слишком низкой, и результат необходимо записать в следующей форме: «Микроорганизмы присутствуют в количестве менее чем (4·d) на грамм или кубический сантиметр».
9.5 Чашка (анализируемый образец или исходная суспензия или первое разведение) не содержит колоний
Если чашка с анализируемой пробой или исходной суспензией не содержит колоний, результат записывают в следующей форме:
«Менее 1/d микроорганизмов на грамм или кубический сантиметр»,
где d — коэффициент разбавления исходной суспензии или первого засеянного или отобранного разведения (d = 100 = 1, если отбирается непосредственно посеянная анализируемая проба 1 г или 1 см3 продукта).
9.6 Особые случаи
Метод вычисления результатов в особых случаях в соответствии с ГОСТ ISO 7218.