Приказ Минздрава СССР от 07.08.1990 № 327

«О защите населения от гриппа и других острых респираторных заболеваний»

(вместе с «Методическими указаниями по вакцинопрофилактике гриппа у взрослых и детей», «Методическими указаниями по неспецифической профилактике гриппа и ОРЗ», «Методическими указаниями по организации работы лечебно-профилактических учреждений в период эпидемии гриппа в городе (населенном пункте)», «Методическими указаниями по лабораторным методам диагностики гриппа и других ОРЗ»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ПРИКАЗ

от 7 августа 1990 г. № 327

О ЗАЩИТЕ НАСЕЛЕНИЯ ОТ ГРИППА И ДРУГИХ ОСТРЫХ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Обобщение опыта проведения массовых мероприятий по защите населения от гриппа и других острых респираторных заболеваний (ОРЗ), а также результаты научных исследований вызывают необходимость пересмотра всей сложившейся системы профилактики, диагностики и лечения этой группы инфекционных заболеваний.

Несмотря на проводимые мероприятия, ежегодное число случаев гриппа и ОРЗ превышает 70 млн., выплаты по листам нетрудоспособности — более 3,5 млрд. рублей.

Медленно разрабатываются и внедряются в практику новые средства и методы эффективной профилактики, лабораторной диагностики и лечения (трехкомпонентные очищенные живые вакцины, противовирусные химиопрепараты, иммуноферментный анализ и т.д.).

Широко распространился негативизм медицинских работников и населения к профилактическим прививкам и другим мероприятиям.

Современная компенсация борьбы с гриппом и ОРЗ предусматривает использование как общих, так и специальных средств и методов. Широкий круг общих (санитарно-гигиенических) мероприятий включает оздоровление быта и труда, охрану окружающей среды, искоренение вредных привычек. От общих мероприятий, оберегающих, укрепляющих и восстанавливающих здоровье человека, в значительной степени зависит реализация и эффективность комплекса специальных средств и методов предупреждения и лечения гриппа и ОРЗ.

В целях повышения эффективности профилактики, диагностики и лечения гриппа и других ОРЗ у взрослых и детей приказываю:

1. Министрам здравоохранения союзных республик:

1.1. Обеспечить реализацию комплекса мероприятий, предусмотренных прилагаемыми Методическими указаниями (приложение 1 - 4).

1.2. Расширить применение средств и методов неспецифической, сезонной и экстренной профилактики гриппа и ОРЗ, особенно для защиты детей и для снижения детской смертности.

Утверждаю:

Методические указания:

• По вакцинопрофилактике гриппа у взрослых и детей (Приложение 1);
• По неспецифической профилактике гриппа и ОРЗ (Приложение 2);
• По организации работы лечебно-профилактических учреждений в период эпидемии гриппа в городе, населенном пункте (Приложение 3);
• По современным методам лабораторной диагностики гриппа и ОРЗ (Приложение 4).

Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на заместителя министра здравоохранения СССР тов. Кондрусева А.И.

Министерствам здравоохранения союзных республик, Министерствам и ведомствам СССР, имеющим медицинскую службу, разрешается размножить настоящий Приказ и утвержденные Методические указания и положения в необходимом количестве экземпляров.

Считать утратившими силу:

1. Приказ Минздрава СССР № 716 от 08.07.80 «О мероприятиях по борьбе с гриппом».

2. Приказ Минздрава СССР № 810 от 18.06.87 «О корректировке тактики массовой вакцинопрофилактики гриппа».

Министр И. Н. Денисов

Приложение 1 к Приказу Минздрава СССР от 7 августа 1990 г. № 327

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКЕ ГРИППА У ВЗРОСЛЫХ И ДЕТЕЙ

Введение. В комплексе защитных противогриппозных мероприятий вакцинопрофилактика занимает ведущее положение.

При правильном проведении этих мероприятий отечественные инактивированные и живые гриппозные вакцины производства 1980 — 87 гг. обеспечивали снижение годовых показателей заболеваемости населения суммарно гриппом и ОРЗ на 15 — 20%. По экономическим расчетам иммунизация вакцинами поколения 1980 — 1987 гг. приносила прибыль от 2 до 8 рублей на 1 рубль затрат.

В то же время объективные изменения в закономерностях движения эпидемического процесса при гриппе, характеризующиеся одновременной циркуляцией трех известных вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и B, и накопившиеся новые научные данные, повлекшие, в частности, отмену безыгольных инъекторов, обусловили необходимость внесения определенных поправок в сложившуюся систему защиты населения от гриппа. С одной стороны, они были направлены на усовершенствование и повышение потенциальной эффективности вакцин и с другой — на корректировку тактики и способов их применения.

В СССР, в отличие от других стран, применяются не только инактивированные, но и живые гриппозные вакцины.

Цельновирионная инактивированная гриппозная трехкомпонентная вакцина для взрослых

Вакцина включает в себя вирусы гриппа типов A(H₁N₁), A(H₃N₂) и B, полученные из вируссодержащей аллантоисной жидкости куриного эмбриона, очищенные и инактивированные формалином или ультрафиолетовыми лучами. В одной прививочной дозе (0,5 мл) вакцины содержится по 9 — 11 мкг важнейшего для создания иммунитета вирусного белка — гемагглютинина вирусов гриппа A(H1N1), A(H3N2) и 12 — 14 мкг вируса гриппа B, всего 30 — 36 мкг.

Вакцина вызывает формирование специфического иммунитета против гриппа и предназначена для взрослых в возрасте 18 лет и старше.

Возможность иммунизации инактивированной вакциной детей и подростков будет определяться поэтапно от старших возрастов к младшим по результатам проводимых исследований.

Способы применения и дозировка

Инактивированная вакцина предназначена в основном для подкожного введения шприцами одноразового использования. Головку флакона с пригодной к применению вакциной обрабатывают ватным тампоном со спиртом. Стерильным пинцетом или скальпелем вскрывают торцовую часть металлической окантовки, обнажая центр резиновой пробки флакона. Из комплекта шприца одноразового пользования извлекают стерильную иглу и вводят ее во флакон, пробивая резиновую пробку. Через эту иглу, которая сохраняется в емкости флакона до полного расходования препарата, следующим одноразовым шприцем набирают 0,5 мл вакцины и надевают на него стерильную иглу, приложенную к комплекту, вакцину вводят в область наружной поверхности плеча.

Инактивированные гриппозные вакцины из актуальных штаммов вирусов гриппа, как показали исследования последних лет, оказались достаточно эффективными не только при парентеральном, но и интраназальном применении. Наиболее эффективна двухкратная интраназальная прививка с интервалом 3 — 4 недели. Интраназальный метод иммунизации выгодно отличается от парентерального отсутствием прививочных реакций и безопасностью в отношении инфекций с парентеральным механизмом передачи.

Интраназальную прививку проводят распылителем-дозатором жидкости типа РДЖ-М4 производства Полтавского завода медицинского стекла Минмедбиопрома СССР.

Корпус РДЖ-М4 изготовлен из стекла. В комплект входит резиновый баллон, металлическая капиллярная трубка и 10 носовых наконечников из полиэтилена.

Вакцина из раскрытого флакона заливается в распылитель через специальное отверстие, которое затем закрывается наконечником.

Вакцинацию каждого человека осуществляют в положении сидя на стуле с легко отклоненной назад головой. Во время введения вакцины прививаемый должен сделать глубокий вдох. После введения препарата он должен оставаться с запрокинутой головой в течение 2 — 3 минут и не очищать носа в течение получаса. Наконечник РДЖ-М4 вводят поочередно в оба носовые отверстия на глубину до 0,5 см, не касаясь их стенок, и 1 — 2 нажатиями резинового баллона распыляют в каждый носовой ход по 0,25 мл вакцины, что соответствует приблизительно половине жидкости, имеющейся в мернике (стеклянном отростке корпуса). Для введения вакцины следующему пациенту пластмассовый наконечник заменяют другим из числа запасных.

Прибор РДЖ-М4 прост в эксплуатации, не требует отладки, позволяет многократно дозировать вакцину без повторной заливки. Но перед началом прививок полученную партию приборов следует проверить на исправность. Для этого резервуар корпуса РДЖ-М4 заливают холодной водой, и, набирая ее в мерник, распыляют. Появление мелкодисперсной струи-облака указывает на исправность прибора и пригодность его к работе.

Непосредственно перед началом прививок в течение рабочего дня приборы дезинфицируют. Стеклянный корпус и капиллярную трубку с введенным мандреном дезинфицируют в кипящей воде, полиэтиленовые наконечники погружают в 3% раствор перекиси водорода, имеющий температуру 18 — 20 °C, с экспозицией 30 минут. Сокращение сроков обеззараживания наконечников возможно при применении 3% раствора перекиси водорода с 0,5% моющего средства «Новость», «Прогресс», «Сульфенол». После обеззараживания наконечники тщательно промывают в проточной воде. По завершению дезинфекции стеклянного корпуса и наконечников, все детали РДЖ-М4 необходимо просушить, стеклянный корпус обернуть ватой и уложить в коробку. В течение рабочего дня не допускаются длительные перерывы (1 час и более) в эксплуатации РДЖ-М4, заполненным вакциной. Попадающая в капиллярную трубку вакцина в ее внутреннем просвете быстро загустевает и высыхает, что требует дополнительной разборки и наладки прибора. В таких случаях, при маленьких остатках вакцины в резервуаре, ее следует слить и тщательно промыть систему кипяченой водой или стерильным физ. раствором. При заполненном вакциной резервуаре, во избежание заклеивания капиллярной трубки, 1 — 2 нажатиями резинового баллона систему следует прокачать с направлением струи вакцины в любую емкость с жидкостью на дне.

Оптимальным способом иммунизации, обеспечивающим наибольшую эффективность, конечно, следует признать введение препарата в мелком дисперсном виде с помощью РДЖ-М4.

Живые гриппозные вакцины для взрослых и детей

Живые гриппозные интраназальные вакцины представляют лиофильно высушенную в ампулах аллантоисную жидкость куриных эмбрионов, предварительно зараженных вакцинным аттенуированным (с ослабленной вирулентностью) штаммом вируса гриппа. Одна из живых вакцин предназначена для профилактики гриппа у взрослых в возрасте 16 лет и старше, другая — у детей 3 — 15 лет.

Живые вакцины выпускаются в ампулах по 2 мл в виде моновалентных препаратов из штаммов вирусов гриппа A(H₁N₁), A(H₃N₂) и B, которые в зависимости от эпидемиологического прогноза и наличия препаратов используют самостоятельно или смешивают непосредственно перед иммунизацией. В каждой ампуле вакцины содержится 8 прививочных доз.

Благодаря наличию живого вируса, вакцины вызывают ответную иммунологическую реакцию, патогенетически наиболее адекватную естественно с выработкой как циркулирующих (сывороточных), так и местных (секреторных) антител, а также со стимуляцией клеточного иммунитета. Кроме того, живые вакцины обладают избирательным действием: вакцинный вирус приживается (размножается) лишь у восприимчивых к гриппу людей, в то время как парентерально вводимые инактивированные вакцины вызывают иммунологическую реакцию как у восприимчивых, так и иммунных людей, которым она, по существу, не приносит пользы.

В связи с тем, что подготовка и апробация штаммов для живых вакцин занимает значительно больше времени, чем для инактивированных, полное антигенное соответствие вакцинных и эпидемических штаммов в первый год появления в циркуляции новых вариантов вируса в живых вакцинах обеспечить трудно, а при неполном соответствии эффективность прививок снижается. Тем не менее, в контролируемых наблюдениях живые интраназальные вакцины обеспечивали снижение заболеваемости гриппом и ОРЗ в период эпидемии в среднем в 1,3 — 2,0 раза.

Методика применения живой вакцины

Перед вакцинацией тщательно просматривают каждую ампулу с сухой вакциной. При наличии даже незначительных трещин ампулу бракуют. Непосредственно перед началом прививок вакцину разводят.

Для этого шейку ампулы обтирают спиртом, подпиливают в верхней части, вторично протирают спиртом и обламывают. При применении моновакцин в каждую ампулу добавляют 4 мл дистиллированной или остуженной кипяченой воды, чтобы получить требуемое разведение вакцины 1:2. При использовании дивакцин, сочетание которых может быть в трех вариантах — A(H1N1) + A(H3N2), A(H1N1) + B, A(H3N2) + B, — в каждую ампулу вливают по 2 мл воды и их содержимое смешивают. В случае применения тривакцины в каждую из трех ампул с моновакцинами A(H1N1), A(H3N2) и B вводят по 1,3 — 1,4 мл воды и затем содержимое их также смешивают. Общий объем тривакцины (так же как моно- или дивакцины) должен быть равен 4 мл, чтобы обеспечить прививку 8 человек: по 0,5 мл на каждого.

Приготовленная вакцина должна быть использована в течение 1 часа со времени разведения.

Любым из названных сочетаний препарата (моно-, ди-, или тривакцина) прививку взрослых проводят однократно, а детей — двукратно с интервалом 25 — 30 дней. Для непосредственного введения живых вакцин по 0,25 мл в каждый носовой ход, так же как и инактивированных препаратов, используется РДЖ-М4. Следует учитывать, что капельное и струйное введение снижает эффективность прививок по сравнению с мелкодисперсным.

Организация и тактика вакцинопрофилактики гриппа

В настоящее время для людей с нормальным здоровьем принята такая схема иммунизации против гриппа: вакцинация, через год первая ревакцинация и последующие ревакцинации с интервалом в три года.

В период удлиненных интервалов между ревакцинациями используются средства и методы неспецифической профилактики гриппа и ОРЗ.

Особое внимание уделяется «группе риска», в которую входят, во-первых, люди, страдающие хроническими заболеваниями и, во-вторых, люди, часто болеющие ОРЗ. У всех этих людей есть основание подозревать наличие вторичных иммунодефицитов, им требуется корректирующая санация с использованием иммуномодуляторов. Противогриппозные прививки в «группе риска» во всем мире проводятся ежегодно, при этом в СССР рекомендуется чередовать парентеральный и интраназальный способы иммунизации.

К «группе риска» приравниваются некоторые контингенты с повышенной опасностью инфицирования: организованные дети, новобранцы, вновь формируемые коллективы, медицинские работники, работники сферы обслуживания, пассажирского транспорта и т.п.

Прививочная кампания начинается с составления списка и предварительного отбора лиц, подлежащих прививкам (форма 64 леч.). Учитываются постоянные и временные медицинские противопоказания и прививочный анамнез в предшествующие годы. Перечень противопоказаний имеется в инструкции (наставлении) по применению вакцины, и не следует стремиться к его необоснованному расширению. Во всех странах, где применяются инактивированные гриппозные вакцины, определено только одно постоянное противопоказание: аллергия к яичному белку.

Непосредственно перед прививкой измеряется температура тела, проводится обязательный медицинский осмотр детей и при предъявлении жалоб — взрослых. Расход вакцин планируют от численности подлежащих иммунизации плюс 10% «на разлив» и другие непредвиденные расходы. Следует учитывать, что 1 доза современной инактивированной вакцины стоит 2 руб.

Проведение прививок осуществляют специально сформированные на базе медико-санитарных частей и территориальных поликлиник прививочные бригады. В их состав входят врач, ответственный за работу бригады в целом, и две — три медицинские сестры. Они проводят вакцинацию и оформляют медицинскую документацию о прививках.

Прививки на предприятиях и в учреждениях проводят в специально организованных прививочных пунктах.

Для прививок «группы риска» из числа неработающего взрослого населения прививочные пункты развертываются в территориальных поликлиниках.

Начальник Главного эпидемиологического управления Минздрава СССР М. И. Наркевич

Приложение 2 к Приказу Минздрава СССР от 7 августа 1990 г. № 327

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКЕ ГРИППА И ОРЗ

Неспецифическая профилактика предусматривает использование как общих, так и специальных средств и методов.

Специальные средства и методы целесообразно разделить на две группы: 1) препараты и процедуры, способствующие нормализации функций иммунной системы организма, повышающие его неспецифическую резистентность к инфекционным агентам; 2) противовирусные препараты, воздействующие на возбудителей гриппа и ОРЗ.

Препараты первой группы используются для коррекции иммунного статуса у людей, находящихся в состоянии вторичного иммунодефицита. Этот многочисленный контингент взрослых и детей составляет по некоторым оценкам до 50% населения. Без специальных иммунологических исследований к нему можно отнести почти безошибочно всех людей с хроническими заболеваниями, а также тех, кто часто болеет ОРЗ.

Иммуностимулирующие препараты рекомендуется применять в виде курсов в период сезонного подъема респираторных заболеваний. Эта сезонная (плановая) неспецифическая профилактика в период эпидемии гриппа или локальных вспышек других ОРЗ дополняется экстренной (по эпидемическим показаниям) профилактикой, которая заключается в приеме противовирусных препаратов.

Сезонная и экстренная профилактика проводится на фоне комплекса обоснованных санитарно-гигиенических, базисных мероприятий.

Сезонная профилактика гриппа и ОРЗ

Применение медикаментозных препаратов с целью повышения неспецифической резистентности организма к возбудителям ОРЗ допустимо лишь при гарантированной безвредности и эффективности. Перечень таких препаратов пока не широк: витамины, адаптогены, индукторы интерферона и др.

Витамины. Наиболее широко следует использовать витамины — C, A и групп B в возрастных дозировках. Оптимальное соотношение указанных витаминов содержат препараты «Гексавит», «Ревит», «Декамевит» и «Ундевит». Их рекомендуется принимать в возрастных дозировках по 1 драже 2 — 3 раза в день после еды в виде курса продолжительностью 20 — 30 дней.

В дошкольных детских учреждениях в холодный сезон года рекомендуется применять сироп из плодов шиповника по 1 чайной ложке в день.

Адаптогены растительного происхождения

Экстракт элеутерококка — препарата из корней дальневосточного кустарника — обладает общеукрепляющим и тонизирующим свойствами, повышает неспецифическую резистентность организма. Применяется в виде 25 — 30 дневных курсов взрослым по 20 — 40 капель на прием 2 — 3 раза в день, детям по 1 — 2 капле на год жизни 2 раза в день.

Экстракт элеутерококка с комплексом трав «Желудочные капли», в состав которых входят валериана, полынь, мята перечная и красавка в соотношении 4:3:2:1. Этому препарату кроме свойств адаптогена присуща способность снижать аллергическую настроенность у часто болеющих детей. Рекомендуется применять в смеси с экстрактом элеутерококка в соотношении 1:1 по 2 кап. смеси на год жизни ребенка один раз в день в течение 2 — 3 недель.

Настойка аралии — растительный препарат из корней аралии маньчжурской. Прозрачная жидкость янтарного цвета, приятная на вкус, обладает общеукрепляющим и тонизирующим действием. Детям назначают по 1 — 2 кап. на год жизни 1 раз в день за 30 минут до еды в течение 2 — 3 недель.

Экстренная профилактика

В организационном отношении этот вид профилактики следует разделить на внутриочаговую и внеочаговую.

Внутриочаговая профилактика гриппа проводится среди людей, находящихся в непосредственном контакте с больными в семьях, квартирах, комнатах общежитий, больничных палатах, т.е. в эпидемических очагах. Продолжительность очаговой профилактики может колебаться от 2 дней при немедленном прекращении контакта с источником инфекции до 5 — 7 дней, если больной не изолирован и контакт с ним в очаге не прекращен.

Внеочаговый экстренной защите от гриппа подлежат определенные, заранее намеченные группы населения или отдельные лица, в основном не привитые против гриппа, а из них, в первую очередь, лица с высоким риском неблагоприятных исходов заболевания. Это хронические больные — дети и взрослые, пожилые, часто и длительно болеющие люди, у которых чаще развиваются осложнения и возможны летательные исходы. Плановая профилактика рекомендуется для лиц с повышенным риском заражения вирусами гриппа (медработники, работники пассажирского транспорта, торговли, общественного питания, коммунального хозяйства). В экстренной защите нуждаются коллективы интернатного типа с тесным размещением контингента, учебные и производственные коллективы с высокой плотностью рабочих мест, если эти контингенты оказались непривитыми.

В массовой практике для борьбы с гриппом в СССР используются противовирусные химиопрепараты (ремантадин, оксолиновая мазь) и иммунопрепараты (лейкоцитарный интерферон, иммуноглобулины: чигаин), а также дибазол.

Наиболее эффективным и доступным средством экстренной профилактики гриппа у взрослых является ремантадин, обладающий выраженным профилактическим действием в отношении всех известных вариантов вирусов гриппа типа A. Экстренная профилактика гриппа ремантадином проводится в период эпидемии гриппа. Прием препарата начинается при появлении первых больных гриппом в семье (внутриочаговая профилактика) или в коллективе (внеочаговая профилактика).

В первом случае ремантадин по 1 таблетке в день принимают все взрослые члены семьи, с учетом противопоказаний.

В период эпидемии гриппа ремантадин применяется для раннего лечения больных взрослых и детей (с 7 лет). Лечебное действие ремантадина проявляется при назначении препарата с первых часов заболевания.

0,25% оксолиновая мазь предназначена для самостоятельного интраназального применения, не имеет противопоказаний, рекомендуется для экстренной профилактики заболеваний в период эпидемии гриппа.

Человеческий лейкоцитарный интерферон применяется преимущественно для экстренной защиты детей дошкольного возраста от заболеваний гриппом и другими ОРЗ в коллективах, где имеется опасность быстрого распространения указанных заболеваний. Интерферон является наиболее универсальным средством, обладающим профилактической активностью против большинства респираторных вирусов.

С лечебной целью интерферон применяется в ранних стадиях заболевания при появлении первых клинических симптомов гриппа и других ОРЗ.

Чигаин (человеческий иммуноглобулин A) готовят из молозива, собранного от здоровых рожениц на 2 — 3 сутки после родов. Молозиво очищается от жира, стерилизуется фильтрацией, пастеризуется; действующее начало — секреторный иммуноглобулин A. Препарат вводят интраназально с помощью индивидуальной стерильной пипетки по 3 капли в каждый носовой ход 3 раза в день в течение первых 5 суток болезни при неосложненном ОРЗ и 10 суток — при бронхитах и пневмониях.

Дибазол — бензил-бензимидазол гидрохлорид повышает устойчивость организма к неблагоприятным внешним воздействиям, обладает противовоспалительным и гипотензивным действием. Для профилактики гриппа и ОРЗ назначают взрослым по 0,02 г, детям с 3-х лет по 0,01 г с глюкозой и аскорбиновой кислотой 1 раз в день в перерывах между едой в течение 10 дней.

Базисные оздоровительные и санитарно-гигиенические мероприятия

Закаливающие процедуры — относятся к мероприятиям, повышающим сопротивляемость организма к гриппу и ОРЗ. Выбор метода закаливания обусловлен местными условиями, а эффективность связана с соблюдением основных принципов закаливания:

постепенность увеличения закаливающих воздействий,

систематичность,

учет индивидуальных особенностей организма,

проведение их на фоне положительных эмоций,

многофакторность (использование нескольких физических агентов),

полиградационность (тренировки к слабым и сильным, быстрым и замедленным раздражителям).

Постоянных противопоказаний для применения закаливания нет. К местным методам относятся полоскание рта прохладной водой, хождение босиком по полу, сон в холодный период года с открытыми окнами, фрамугами и т.д. К общим — ванны, души, бассейн и др. Арсенал закаливающих процедур широк, в частности, для детей без ограничений могут применять следующие:

1. прогулка на открытом воздухе 2 раза в день, общей продолжительностью не менее 4-х часов в соответствующей одежде в любую погоду;

2. воздушные ванны с утренней гимнастикой продолжительностью 10 — 15 мин. при температуре +18 — 20 °C;

3. дневной сон на свежем воздухе или в хорошо проветренном помещении при температуре +14 — 15 °C;

4. умывание водой температуры +14 — 16 °C, при этом дети моют шею, верхнюю часть груди, руки до плеч;

5. контрастное обливание стоп по схеме: для здоровых детей до 3-х лет 38° — 22° — 38° — 22° и старше 3-х лет 38° — 18° — 38° — 18°, для ослабленных 38° — 28° — 38°;

6. пребывание на солнце в летнее время может быть дополнено хождением босиком по хорошо очищенному грунту.

Для достижения оптимального эффекта целесообразно применение комбинированных воздействий воздуха и воды при различной силе действующего фактора и его экспозиции.

Профилактическое ультрафиолетовое облучение детей в дошкольных учреждениях, школах проводится передвижными облучателями типа ОЭР, оснащенных эритемными люминесцентными лампами ЛЭ-30 или облучателями маячного типа (ОКБ или ОКМ) с лампами ДРТ-1000 и ДРТ-1000 и ДРТ-375 соответственно. В течение осенне-зимнего периода дети получают 2 курса облучения по одной из схем:

1. ежедневное облучение в течение 1 месяца (октябрь или ноябрь в зависимости от широты местности), повторный курс через 2 месяца после завершения первого курса (январь или февраль);

2. облучение через день в течение 2-х месяцев (октябрь — ноябрь) с 2-месячным перерывом и повторным курсом в феврале — марте.

Процедуры начинают с 1/4 биодозы и в процессе облучения ежедневную дозу доводят до 2-х биодоз, повышая ее через каждые 2 сеанса на 1/4 биодозы. У ослабленных детей облучение начинается с 1/8 — 1/10 биодозы и доводится до 1/2 — 3/4 дозы. У детей 3 — 6 лет осуществляется групповое облучение, у детей ясельного возраста — индивидуальное.

Профилактическое ультрафиолетовое облучение рабочих промышленных предприятий осуществляется в фотариях или непосредственно на рабочих местах с помощью люминесцентных ламп, вмонтированных в систему общего освещения.

Рефлексопрофилактика. В качестве средств неспецифической профилактики гриппа и ОРЗ следует рекомендовать метод точечного пальцевого самомассажа биологически активных зон (БАЗ) кожи, разработанный А.А. Уманской. Метод основан на мобилизации собственных функциональных резервов организма и их адекватном использовании, имеет минимальное число противопоказаний и малую вероятность побочных эффектов, экономичен и технически прост.

БАЗ кожи, обладая множеством прямых и обратных связей между собой и с различными внутренними органами и их участками, обеспечивают связь внутренней системы организма и ее подсистем с окружающей средой. Воздействие на БАЗ позволяет производить своего рода «настройку» внутренней среды организма, вышедшей по тем или иным причинам из своего физиологического оптимального уровня.

Механическое раздражение зоны кожи производится путем надавливания на нее пальцем или твердым телом, напоминающим форму пальца. Делается 9 — 10 вращательных движений по часовой стрелке и против нее три вращения в секунду на счет раз и два. Для массажа определены 9 основных зон кожи. Процедуру следует выполнять не реже 2 — 3 раза в день в течение 1 — 2 мин. Метод точечного массажа применим в любом возрасте с первого дня жизни и на всем ее протяжении. Высокая профилактическая эффективность указанного мероприятия достигается только при его регулярном и систематическом проведении. Первоначальное обучение технике самомассажа следует пройти у врача-специалиста.

Начальник Главного эпидемиологического управления Минздрава СССР М. И. Наркевич

Приложение

СХЕМА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ, ПОВЫШАЮЩИХ НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА

Мероприятия, препараты	Средства и методы повышения неспецифической сопротивляемости и схемы их применения
1. Физическое воспитание	Осуществляется в соответствии с требованиями «Программы воспитания в детском саду» утренняя гимнастика и 2 раза в неделю физкультурные занятия
2. Закаливающие процедуры	Прогулки и одна из закаливающих процедур или их сочетание:
	1. Прогулка на свежем воздухе 2 раза в день общей продолжительностью не менее 4 часов
	2. Контрастное обливание стоп
	3. Воздушные ванны в сочетании с утренней гимнастикой
	4. Умывание прохладной водой (14 — 16°)
	5. Дневной сон на свежем воздухе в хорошо проветренной комнате
	6. Солнечные ванны по 5 — 10 мин. 2 — 3 раза в день
	7. Рефлексопрофилактика (массаж БАЗ по Уманской)
3. Ультрафиолетовое облучение (УФО)	В зависимости от условий использования одной из схем:
	а) Ежедневное облучение открытых частей тела в теч. 4 — 6 ч. от 1/8 до 3/4 биодоз в день в период с I/XI по I/IV апреля на территориях севернее 60° с.ш., с I/XI по I/III в средних широтах (50 — 60°) и с I/XII по X/III южнее 50° с.ш.
	б) 2 курса облучения по 18 — 20 процедур, начиная с 1/8 до 2-х биодоз, ежедневно в течение 1 мес. (ноябрь и февраль)
	в) 2 курса облучения по 18 — 20 процедур с 1/8 до 2-х биодоз через день в теч. 2 мес. (X — XI и I — II)
4. Витаминизация пищи	Ежедневная витаминизация первого или третьего блюда в кол-ве 40 мг для детей 1 — 5 лет и 50 мг для детей 6 — 7 лет
5. Рефлексопрофилактика	Самомассаж БАЗ по А.А. Уманской (см. Методические рекомендации «Профилактика и лечение ОРЗ и их осложнений методами рефлексопрофилактики», Минздрав СССР, 1985)
1. Лекарственные препараты растительного происхождения I курс — осенний (XI — XII) II курс — весенний (III — IV)	а) Экстракт элеутерококка внутрь, 2 капли на год жизни 1 раз в день в течение 3 — 4 недель
	б) Экстракт элеутерококка 2 кап. на год жизни в смеси с желудочными каплями — 1 кап. на год жизни 1 раз в день в теч. 3 — 4 недель
	в) Настойка аралии внутрь — 2 кап. на год жизни 1 раз в день в теч. 2 — 3 недель
2. Продигиозан	Интраназально по 0,25 мл в каждый носовой ход взрослым дважды с интервалом 3 — 5 мин. (1 мл на процедуру), школьникам один раз (0,5 мл на процедуру). Процедура введения препарата повторяется 3 раза с интервалом 5 — 7 дней, перерыв между курсами 3 — 4 мес.
3. Лейкоцитарный человеческий интерферон
Индивидуальная профилактика: Первые 7 — 10 дней пребывания в ДДУ или при контакте с больным в семье	Ежедневное закапывание или распыление 0,25 мл (5 кап.) в каждый носовой ход 2 раза в сутки с интервалом не менее 6 часов
Групповая экстренная профилактика: В период эпидемии гриппа в городе или вспышки ОРЗ в ДДУ во время карантина в группах
4. Чигаин	3 кап. в каждый носовой ход 3 раза в день 5 дней при неосложненном ОРЗ и 10 дней при бронхитах и пневмониях
5. Оксолиновая мазь во время эпидемии и вспышек ОРЗ, при контакте с больным в семье	Ежедневное двукратное смазывание слизистой оболочки носа в течение 7 — 10 дней
6. Дибазол	Внутрь в таблетках детям по 0,01 г взрослым 0,02 г за час до еды 1 раз и день в теч. 2 недель (по схеме)

Приложение 3 к Приказу Минздрава СССР от 7 августа 1990 г. № 327

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОРГАНИЗАЦИИ РАБОТЫ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ В ПЕРИОД ЭПИДЕМИИ ГРИППА В ГОРОДЕ (НАСЕЛЕННОМ ПУНКТЕ)

Введение

Характерной формой развития эпидемического процесса при гриппе являются почти ежегодно возникающие эпидемии, которые не только наносят ущерб здоровью населения, но и оказывают существенное влияние на жизнь общества и отражаются на экономике народного хозяйства.

В условиях эпидемии гриппа значительная роль отводится комплексу противоэпидемических и санитарно-гигиенических мероприятий, основная цель которых — прервать механизм передачи возбудителя от больного к здоровому, предупредить образование вторичных очагов гриппозной инфекции.

При методически обоснованном и своевременном применении комплекса противоэпидемических мероприятий их эффективность в определенных условиях может быть не ниже, чем при применении современных вакцин и других противогриппозных препаратов.

Организация борьбы с гриппом в период эпидемии определяются в заранее разработанном комплексном плане, утвержденном исполнительным комитетом местного Совета народных депутатов. План предусматривает совместную эффективную работу всех служб и учреждений на данной территории (республика, область, город, район). План мероприятий по борьбе с гриппом составляется также во всех учреждениях лечебно-профилактической сети. Он включает профилактические мероприятия, проводимые в предэпидемический период, и противоэпидемические мероприятия, которые предусмотрены непосредственно на период начавшейся эпидемии.

В плане должны быть соблюдены следующие принципы:

1. одновременная защита основных социально-возрастных групп населения — детей, работающего населения, лиц пожилого возраста;

2. приоритетная защита «группы риска», т.е. часто и длительно болеющих лиц в коллективах, хронически больных людей;

3. комплексность противогриппозных мероприятий и применение всего арсенала противогриппозных средств, с учетом оптимальной эффективности их действия в определенной социально-возрастной группе.

Непосредственная борьба с эпидемией гриппа обычно начинается с заседания Чрезвычайной противоэпидемической комиссии или комитета (оперативная группа). На этом заседании проводят анализ и обсуждение эпидемической обстановки по данным регистрации заболеваний, их клинической характеристики у детей и взрослых, вирусологической и серологической диагностики, информации из Всесоюзного центра по гриппу. Чрезвычайная противоэпидемическая комиссия или Комитет по борьбе с гриппом принимают решение объявить о начале эпидемии и введении (специальным приказом) в действие плана противоэпидемических мероприятий в городе или области. Среди них:

развертывание гриппозных отделений в поликлиниках;

перевод амбулаторно-поликлинических учреждений на 6 — 7-дневную рабочую неделю с удлиненным рабочим днем;

поэтапное перепрофилирование соматических стационаров для госпитализации больных гриппом;

направление в поликлиники дополнительного медицинского персонала из числа клинических ординаторов, интернов, студентов старших курсов медицинских институтов;

выделение дополнительного автотранспорта для обслуживания больных на дому и доставки медикаментов из аптек;

выделение дополнительных телефонов для регистратуры поликлиник;

ограничение или запрещение проведения всех массовых детских мероприятий в закрытых учреждениях;

усиление противоэпидемического режима в медицинских и детских учреждениях (соблюдение температурного режима, текущая дезинфекция, ношение марлевых масок и т.д.), а также прекращение допуска посетителей к больным в стационары и к детям в учреждения интернатного типа (дома ребенка, детские дома и т.д.);

усиление контроля за санитарно-гигиеническим состоянием предприятий, учреждений, учебных заведений, в особенности мест скопления людей (пассажирский транспорт, магазины, зрелищные учреждения и т.д.);

активация всех видов санитарно-просветительной работы с акцентом на профилактику заражения гриппом и оказания помощи больным.

Оперативно-методическое руководство противоэпидемической работой в период эпидемии осуществляют Комитеты по борьбе с гриппом, созданные при соответствующих органах здравоохранения (в союзных республиках, областях, городах, районах). Кроме представителей здравоохранения в работе Комитетов необходимо участие руководителей государственных, хозяйственных и общественных организаций. В случае необходимости отдельные вопросы выносятся на обсуждение Чрезвычайных противоэпидемических комиссий при исполкомах местных Советов народных депутатов.

Методическое руководство и контроль за работой всех служб, принимающих участие в борьбе с гриппом на соответствующей территории, осуществляет санитарно-эпидемиологическая станция. Сотрудники санитарно-эпидемиологической станции принимают участие в подготовке и утверждении постановлений местных Советов депутатов и Чрезвычайной противоэпидемической комиссии, приказов руководителей органов здравоохранения и инструктивно-методических документов, заявок на противогриппозные препараты и других документов.

Для своевременного развертывания программы противоэпидемических мероприятий в городе необходимо как можно более раннее определение начала эпидемии. Это и является основной задачей эпидемиологического надзора за гриппом и ОРЗ, осуществляемого санитарно-эпидемиологическими станциями. Для этого проводится ежедневный и еженедельный учет и систематический анализ заболеваемости гриппом и ОРЗ в различных возрастных контингентах населения.

Для крупнейших 60 городов страны эпидемические пороги и сезонный (неэпидемический) уровень заболеваемости рассчитаны на основании многолетних наблюдений на ЭВМ во Всесоюзном центре по гриппу и ОРЗ при ВНИИ гриппа и разосланы в соответствующие опорные базы центра.

Общепринятый способ определения начала эпидемии гриппа вполне доступен для практического здравоохранения и в других городах. Сначала определяют средний показатель заболеваемости в интересующую нас неделю года за ряд предыдущих лет, когда эта неделя была свободна от эпидемии гриппа. После этого вычисляются среднеквадратическое отклонение и верхний толерантный предел вероятных колебаний среднего показателя — эпидемический порог, превышение которого рассматривается как признак начинающейся эпидемии.

Для быстрой ориентировочной оценки за начало эпидемии принимается день или неделя, когда показатель заболеваемости гриппом и другими ОРЗ (суммарно) превышает в 1,5 раза сезонный уровень, то есть средний показатель заболеваемости в такую же неделю или в такой же день в прошлые годы, явно спокойные по гриппу.

При появлении локальных вспышек заболеваний в детских дошкольных учреждениях, учебных заведениях, на предприятиях и в учреждениях лечебно-профилактической сети, эпидемиологи обследуют очаг заболеваний, стараясь реализовать основные задачи:

выявление первоисточника возбудителя инфекции, т.е. путей заноса заразного начала в обследуемый очаг;

определение границ очага как по территории, так и по числу людей, находившихся в контакте с источником возбудителя инфекции;

выяснение условий, способствующих образованию очага и развитию эпидемического процесса (нарушение режимов отопления, проветривания, скученность и т.д.);

установление этиологии заболеваний с помощью клинических и лабораторных методов и взятия с этой целью материалов от больных для проведения исследований: вирусологического или ИФ-исследования носоглоточных мазков, серологического исследования парных сывороток крови;

проведение мероприятий по предотвращению вторичных заболеваний в очаге.

Система противоэпидемических мероприятий при гриппе должна быть направлена на прерывание отдельных звеньев эпидемического процесса:

воздействие на источник инфекции (госпитализация, изоляция на месте, лечение больного);

прерывание путей передачи (текущая дезинфекция, ношение марлевых масок и т.д.);

стимуляция невосприимчивости контактных лиц (витаминизация пищи, применение адаптогенов, экстренная профилактика в очагах ремантадином, интерфероном);

общие мероприятия, способствующие проведению и повышению эффективности всей системы.

Важным разделом работы санитарно-эпидемиологической станции является повышение квалификации врачей, среднего и младшего медицинского персонала по вопросам борьбы с гриппом. С этой целью проводятся научно-практические конференции, обсуждение отчетов о работе, семинары, лекции, занятия во всех медицинских учреждениях. Проводится обследование работы поликлиник и стационаров по правильности соблюдения противоэпидемического режима в период эпидемий гриппа. Ведется контроль за полнотой госпитализации больных с тяжелым течением гриппа.

Работа лечебно-профилактических учреждений в период эпидемии

Программа работы лечебно-профилактических учреждений города в период эпидемии гриппа определяется заранее с учетом профиля учреждения, местных условий и возможной интенсивности эпидемии. Ряд запланированных противоэпидемических мероприятий реализуется лишь в период наиболее крупных эпидемий.

Все медицинские учреждения города по задачам, стоящим перед ними в период эпидемии гриппа, условно можно разделить на два типа:

а) учреждения, в обязанности которым вменяется оказание своевременной и квалифицированной помощи больным гриппом — поликлиники, инфекционные больницы, отделения;

б) учреждения, задача которых, наряду с оказанием специализированной помощи (по профилю учреждения) больным или здоровым лицам, предупредить занос и распространение гриппозной инфекции на своей территории — соматические больницы, родильные дома, дома ребенка, санатории и т.п.

Независимо от задач и режима работы учреждения в период эпидемии требуется:

постоянное ношение персоналом на работе масок из 4-слойной марли со сменой их через каждый 3 — 4 часа;

экстренная профилактика гриппа у персонала, имеющего контакт с больным. Экстренная профилактика проводится ремантадином — (50 мг в сутки) или мефенаминовой кислотой (по 0,25 г 2 раза в сутки после еды) в течение 5 дней после последнего контакта с больным или в течение всей эпидемии. Рекомендуется также прием препаратов, содержащих витамины группы A, C, B6, E;

обезвреживание возбудителей гриппа на предметах, окружающих больного и в воздушной среде: влажная уборка палат, процедурных кабинетов, холлов, коридоров, мест общего пользования 2 — 3 раза в сутки с применением хлорсодержащих средств (0,5% раствор хлорамина, 0,5% раствор хлорной извести), проветривание помещений в течение 8 — 10 минут несколько раз в день, ультрафиолетовое (УФ) облучение помещений.

Работа поликлиник в период эпидемии гриппа

Основная тяжесть по приему и лечению больных гриппом в период эпидемии приходится на поликлиники.

Организация работы поликлиники во многом определяет общий уровень противоэпидемических мероприятий в городе, их результативность, экономический ущерб от эпидемии, количеств осложнений, смертность от гриппа.

С момента объявления эпидемии в поликлинике развертывается гриппозное отделение во главе с опытным заведующим и старшей медицинской сестрой. Автономное функционирование отделения обеспечивается отдельным входом, гардеробом, регистратурой, кабинетом доврачебного осмотра, страховым столом, помещением для взятия крови. Отделение работает в 2 смены с 30-минутным перерывом для проведения влажной уборки, проветривания, ультрафиолетового облучения. Эффективное и быстрое обслуживание больных достигается за счет увеличения часов работы отделения (6 — 7-дневная рабочая неделя, удлинение времени работы отделения), привлечения к работе врачей-интернов, ординаторов, специалистов терапевтического профиля и рационализации работы врачей на приеме: снабжения их готовым набором рецептов на наиболее часто употребляемые лекарства, бланками направлений на флюорографическое и лабораторное исследование, стандартными бланками «Амбулаторная карта больного гриппом», с перечнем возможных жалоб, симптомов болезни, анализов, лечения больного. Меньшему скоплению больных в отделении способствует также выдача больничных листков на срок до 5 дней и четкая работа кабинетов доврачебного осмотра, где заполняется паспортная часть амбулаторной карты, измеряется и заносится в карты температура тела и кровяное давление.

Работа инфекционных стационаров и отделений

Госпитализации подлежат больные с тяжелым течением гриппа, с присоединившимися осложнениями (пневмония, круп и др.), а также с отягощенным преморбидным фоном. Показаниями для госпитализации являются также невозможность обеспечить уход за больными на дому (одинокие люди) и необходимость изоляции больных (из общежитий, гостиниц и т.п.). Дополнительный коечный фонд рассчитывается исходя из того, что госпитализации подлежит около 1% взрослых больных гриппом и 2,5% больных детей. В наиболее интенсивные эпидемии гриппа заболевает приблизительно 20% взрослого и 40% детского населения. Общее количество «гриппозных» коек в стационарах должно быть, примерно, в 2 раза меньше предполагаемого количества больных, которые будут нуждаться в госпитализации.

Особое внимание должно быть уделено сортировке госпитализируемых больных. Больных с тяжелыми осложненными формами гриппа и сопутствующими заболеваниями должны направляться в основные инфекционные стационары. В перепрофилированные отделения госпитализируются больные с менее тяжелыми формами гриппа.

Правильная диагностика и верная оценка тяжести состояния больного уже в приемном покое позволяет выделить больных, нуждающихся в оказании немедленной помощи (еще в приемном отделении), в помещении их в блок или палаты интенсивного наблюдения и терапии.

Для исключения перекрестных инфекций рекомендуется одномоментное заполнение палат.

Больные должны находиться в стационаре до полного клинического выздоровления.

Особенности работы стационаров, не связанных непосредственно с лечением больных гриппом

Прекращается допуск посетителей к больным. При наличии у больных при поступлении или во время пребывания в стационаре симптомов ОРЗ они помещаются в отдельную палату или бокс.

Проводится экстренная профилактика гриппа среди персонала и лиц, контактировавших с заболевшими гриппом. Усиливается санитарно-гигиенический режим.

Режим работы родильных домов и отделений новорожденных

В период эпидемии гриппа необходимо усилить контроль за состоянием здоровья поступающих рожениц (термометрия, осмотр носоглотки). При выявлении симптомов ОРЗ роженицы госпитализируются в специальные родильные дома или специальное отделение в общем родильном доме.

В случае возникновения очага гриппа или ОРЗ:

больные дети должны изолироваться в индивидуальные боксы с отдельным обслуживающим персоналом на 7 — 10 дней;

за контактными детьми устанавливается наблюдение с 2-кратным измерением температуры и осмотром слизистой носоглотки. При выписке контактных новорожденных из роддома в карте указывают на контакт по гриппу для дальнейшего наблюдения за ребенком по месту жительства;

больные и контактные матери переводятся в обсервационное отделение при условии соблюдения в нем изоляции;

при кормлении ребенка больная мать надевает 4-слойную маску (каждый раз свежую) или ребенок получает сцеженное молоко. После каждого кормления пеленки новорожденного меняются на свежие;

среди контактных новорожденных проводится экстренная профилактика заболеваний лейкоцитарным интерфероном (по 2 — 3 капли в каждый носовой ход 2 — 3 раза в сутки) или чигаином (по 1 капле в каждый носовой ход 2 — 3 раза в день).

Работа аптек в период эпидемии

Условиями своевременного и полного обеспечения населения медикаментами для лечения гриппа во время эпидемии являются:

заблаговременное создание в аптечной сети города противогриппозного запаса лекарств, количество которых должно быть обосновано расчетами и опытом предыдущих эпидемий.

Оптимальный режим работы аптек подразумевает быстрое (без очередей) и удовлетворяющее спрос обслуживание посетителей, что достигается:

за счет привлечения к работе в аптеках студентов химико-фармацевтических институтов и училищ;

заблаговременной расфасовкой наиболее часто используемых лекарственных препаратов, например, антигриппина;

хорошо налаженной информацией о наличии лекарств в других аптеках города;

увеличение часов работы аптеки.

Кроме того, в период эпидемии необходимы дежурные аптеки, проводящие круглосуточную продажу противогриппозных средств.

В целях предупреждения распространения гриппа на промышленных предприятиях и в общежитиях необходимо:

1. принять меры к выявлению заболевших гриппом силами персонала здравпунктов, с привлечением активистов Красного Креста с целью раннего начала этиотропного лечения ремантадином и изоляции;

2. проводить экстренную химиопрофилактику для защиты непривитых в коллективе и как метод дополнительной защиты «группы риска», а также контактировавших с больными в общежитии, в семейных очагах;

3. проводить обходы цехов медперсоналом для контроля за санитарно-гигиеническим режимом на предприятии.

Противоэпидемические мероприятия в детских учреждениях зависят от характера коллектива:

в домах ребенка ежедневный осмотр детей с измерением температуры тела утром и вечером;

в детских яслях каждое утро при приеме детей осмотр слизистой носоглотки с измерением температуры тела;

в детских садах общий утренний осмотр проводят воспитатели. Во время эпидемии гриппа в данном учреждении организуется ежедневная термометрия детей.

Больных детей, выявленных на приеме, не допускают в коллектив, а выявленных в течение дня помещают в изолятор до прихода родителей (в детских яслях и садах), до госпитализации (в коллективах интернатного типа).

В период эпидемии гриппа прекращается допуск посетителей к детям в учреждения интернатного типа и ограничивается или запрещается проведение всех массовых детских мероприятий в закрытых помещениях: утренников и киносеансов, спортивных соревнований для детей.

При возникновении в группе 3 — 5 случаев ОРЗ, связанных между собой или с общим источником, на группу накладывается карантин на 14 дней после регистрации последнего случая заболевания и посылается извещение в районную санэпидстанцию. В период карантина запрещается перевод из группы в группу и прием вновь поступающих детей. Персонал карантинных групп должен работать в 4-слойных марлевых масках, которые необходимо менять через каждые 3 — 4 часа. При появлении признаков ОРЗ персонал отстраняется от работы по непосредственному обслуживанию детей.

Из санитарно-гигиенических мероприятий рекомендуется:

дезинфекция посуды;

кипячение предметов индивидуального пользования больного (полотенца, носовые платки и т.д.);

текущая дезинфекция игрушек;

энергичное 3-кратное в течение дня проветривание помещений в течение 8 — 10 минут в отсутствии детей;

влажная уборка помещений 2 раза в день с применением растворов хлорсодержащих препаратов (0,5% раствора хлорной извести или 0,5% раствора хлорамина);

обеззараживание воздушной среды помещений ультрафиолетовыми лучами с помощью бактерицидных ламп с отражательными щитками;

удлинение пребывания детей на свежем воздухе до 4-х часов в день в соответствующей одежде.

Для повышения резистентности организма ребенка следует проводить витаминизацию пищи, экстренную профилактику гриппа интерфероном.

В школах, школах-интернатах, детских домах:

При регистрации очага с 3 — 5 и более случаями ОРЗ в классе (группе, спальне) проводят карантинные мероприятия:

раннее выявление больных силами воспитателей, преподавателей и санитарных постов;

заболевших в школе отправляют домой для лечения в поликлинике, больных детей из школ-интернатов и детских домов или госпитализируют, или помещают в изолятор для медицинского наблюдения и лечения;

за контактными по классу и по спальне в школе-интернате или детском доме устанавливают ежедневное медицинское наблюдение с измерением температуры, осмотром носоглотки;

среди контактных детей проводится очаговая экстренная профилактика с использованием ремантадина, лейкоцитарного интерферона, оксолиновой мази.

Методика применения средств экстренной профилактики приводится в приложении 2 к данному приказу.

Из санитарно-гигиенических мероприятий рекомендуется:

влажная уборка классов, спален силами технического персонала с применением 0,5% раствора хлорной извести;

проветривание классов и спален;

облучение воздуха помещений бактерицидными ультрафиолетовыми лампами.

Начальник Главного эпидемиологического управления Минздрава СССР М. И. Наркевич

Приложение 4 к Приказу Минздрава СССР от 7 августа 1990 г. № 327

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ МЕТОДАМ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА И ДРУГИХ ОРЗ

1. Выделение и идентификация респираторных вирусов

Метод вирусологической диагностики гриппа и ОРЗ, наиболее трудный и продолжительный по времени, по частоте положительных результатов существенно уступает другим лабораторным тестам. Однако в ряде случаев изоляция вирусов дает незаменимые по значению результаты, в частности, в случае этиологической расшифровки интенсивных вспышек гриппа и ОРЗ в коллективах или определения природы крайне тяжелых заболеваний с летальным исходом.

К числу достоинств метода относится его достоверность и возможность оперативного приготовления новых диагностических и профилактических препаратов из современных штаммов циркулирующих вирусов гриппа и ОРЗ.

Частота выделения респираторных вирусов зависит от сроков взятия материалов от больных, условий их хранения, доставки и времени первичной обработки. Решающее значение имеет подбор и качество клеточных культур, на которых проводят исследования. К сожалению, не удается ограничиться лишь одним видом высокочувствительных клеток, так как при этом неизбежно выключается из репродукции ряд вирусных агентов, не размножающихся в данной культуре. Поэтому используют несколько клеточных культур различного видового состава, отличающихся по чувствительности к разным вирусам. Клеточные культуры должны обладать четкой морфологической структурой, без признаков дегенеративных изменений и использоваться в первые два дня после формирования клеточного пласта. Следует учитывать, что стареющие клетки менее чувствительны к большинству вирусных агентов и дают более ранние неспецифические изменения из-за возрастной дегенерации.

Необходимо также обращать внимание на подбор поддерживающих питательных сред, которые должны быть не токсичными, обладать хорошей буферностью при умеренной питательности, чтобы исключить ускоренное развитие и старение клеток.

При выделении и идентификации возбудителей респираторных вирусных инфекций следует пользоваться таким минимальным набором клеточных культур:

1. Первичная культура клеток почек эмбриона человека (ПЭЧ).

2. Перевиваемая культура фибробластов легкого эмбриона человека (ЛЭЧ).

3. Перевиваемые клетки Hep-2 или Hela.

Каждая из этих клеточных культур отличается достаточно высокой активностью роста, длительным сохранением клеток в незараженных посевах (до 20 — 25 суток ПЭЧ и ЛЭЧ, до 15 — 16 суток Hep-2), четкой и характерной структурой, позволяющей уверенно документировать цитопатические изменения, вызванные вирусными агентами.

Используемые материалы: стерильные пробирки, резиновые пробки, марлевые тампоны, стеклянный песок, фарфоровые ступки.

Растворы и среды: раствор Хенкса, среда Игла или среда 199, содержащая антибиотики (600 ед./мл пенициллина и 300 мкг/мл стрептомицина).

Оборудование: лабораторная центрифуга, термостат (37 °C), холодильник (+4 °C), микроскоп.

Материалом для выделения вирусов служат отделяемое носа, зева, конъюнктивы, а также секционный материал (ткань легкого, кусочки бронхов и др.).

Взятие материала производят с помощью тампона, который погружают затем в пробирки с 5,0 мл среды Игла или среды 199 с антибиотиками. В лаборатории марлевые тампоны с вирусным материалом отжимают в среду, материал центрифугируют в течение 20 мин., при 2000 — 3000 об./мин. при температуре 4 °C.

Кусочки секционного материала растирают в фарфоровой ступке со стеклянным песком, добавляют 10-кратное количество раствора Хенкса, взвесь ресуспендируют, после чего осветляют центрифугированием. Насадочную жидкость используют для заражения куриных эмбрионов или тканевых культур.

Для выделения вирусов гриппа исследуемые материалы после их первичной обработки вводят по 0,1 мл в амниотическую пользу 10-дневных куриных эмбрионов. Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 72 часа при 33 — 34 °C. После инкубации эмбрионы помещают на ночь в рефрижератор при 40 °C.

Изоляцию аденовирусов, парагриппозных, PC, простого герпеса и др. производят на клеточных культурах (ПЭЧ, ЛЭЧ, Hep-2). Наиболее чувствительной является клеточная культура почки эмбриона человека (ПЭЧ). В чувствительные культуры вносят по 0,2 мл зараженного материала. Через 30 — 60 минут адсорбции вируса на клетках в культуры вносят по 0,8 мл поддерживающей среды Игла с антибиотиками (100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина), и с 2 — 5% инактивированной сыворотки (крупного рогатого скота, лошади или эмбриона коров). Зараженные культуры инкубируют при температуре 36 °C до появления в них характерного для каждой группы вирусов цитопатогенного действия (ЦПД).

Индикацию вируса гриппа осуществляют в реакции гемагглютинации (РГА) путем добавления 0,5 мл 1% суспензии отмытых эритроцитов кур к 0,5 мл вируссодержащего материала. Результаты РГА учитывают после 30-минутного оседания эритроцитов, в лунках панелей при комнатной температуре.

Индикацию парагриппозных вирусов проводят по гемадсорбции с 0,4% взвесью эритроцитов морской свинки, а остальных вирусов — по характерному цитопатогенному действию.

Если при первичном заражении вирус не был выявлен ни в одном из тестов, материалы дополнительно пассируют еще 2 раза в тех же условиях до появления признаков вирусной инфекции.

При первичной идентификации вируса гриппа в РТГА следует включать диагностические лошадиные сыворотки к различным подтипам вируса гриппа А и к актуальным вариантам вируса гриппа B производства Ленинградского НИИ вакцин и сывороток Минмедпрома СССР. Для последующей детальной характеристики вирусов используют штаммоспецифические иммунные крысиные сыворотки к различным антигенным вариантам вирусов гриппа A или B. РТГА ставят традиционным способом (см. раздел 3).

Идентификацию других вирусов проводят в чувствительных тканевых культурах с помощью реакции нейтрализации (PH) со специфическими иммунными сыворотками. Вируссодержащую культуральную жидкость разводят в 10 — 50 раз (для группы аденовирусов) или используют 100 ИД 50/мл (для вирусов PC, простого герпеса, парагриппа и др.). Разведенный вирус в объеме 0,2 мл смешивают с 0,2 мл каждой из типоспецифических иммунных сывороток, взятых в разведении 1:20. Смесь вируса и сыворотки выдерживают 2 часа при комнатной температуре, после чего по 0,2 мл каждой смеси вносят в 2 пробирки с монослоем чувствительных клеток, затем в пробирки добавляют по 0,8 мл поддерживающей среды. Инфицированные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 36 °C. Параллельно типоспецифические сыворотки контролируют в отношении их активности к типовым эталонным штаммам.

Учет реакции проводят по активности блокирования цитопатогенного действия (для группы аденовирусов, PC, простого герпеса) либо по интенсивности ингибиции феномена гемадсорбции (для парагриппозных вирусов) в тот день, когда типируемый вирус (контроль вируса) вызвал выраженное ЦПД клеток (при отсутствии дегенерации в контрольных посевах клеток и в контролях диагностических сывороток), в то время как эталонные штаммы полностью нейтрализованы типоспецифическими сыворотками. Тип выделенного штамма определяют по сыворотке, которая полностью предохранила клетки от дегенерации.

2. Выявление вирусных антигенов в материалах от больных для диагностики гриппа и ОРЗ

Методы быстрой диагностики основаны на обнаружении вирусных антигенов в материалах от больных с помощью специфических антител, маркированных флуорохромами или ферментами. Они широко используются в инфекционных стационарах для выяснения природы сходных по клиническим проявлениям, но отличных по этиологии острых респираторных вирусных заболеваний в целях:

• раннего назначения специфических средств этиотропной терапии,
• прогнозирования тяжести развития заболевания,
• рационального размещения больных по этиологическому принципу (во избежание перекрестного внутрибольничного инфицирования).

Методы ранней лабораторной диагностики используют также для быстрой расшифровки природы эпидемических вспышек в целях проведения соответствующих профилактических и лечебных мероприятий.

В последние годы в практике здравоохранения широкое распространение получил метод иммунофлуоресцентной диагностики гриппа и др. ОРЗ. Наряду с ним внедряется и новый метод ранней диагностики гриппа, основанный на применении иммуноферментного анализа.

Метод иммунофлуоресцентной диагностики гриппа и других ОРЗ (МИФ)

Прямой метод иммунофлуоресцентного анализа позволяет обнаружить вирусные антигены по их характерной локализации непосредственно в клетках цилиндрического эпителия за счет взаимодействия антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом. По чувствительности МИФ не уступает другим методам лабораторной диагностики, однако для правильной интерпретации результатов необходим определенный опыт работы, тщательная микроскопия мазков требует значительного внимания и времени, что ограничивает возможности исследований и приносит элементы субъективизма в заключительный анализ.

К числу преимуществ метода относится возможность быстрого анализа небольшого числа проб (за 2 — 3 часа). Эффективность анализа наибольшая в острой фазе (первые 3 дня) заболевания и существенно зависит от качества забора клинических материалов.

Используемые материалы: сухие тампоны из стерильной ваты, пробирки, марлевые салфетки, пинцет, обезжиренные предметные стекла, лейкопластырь, планшеты для предметных стекол, пастеровские пипетки, стеклянный сосуд для фиксации мазков, мерные пипетки, фильтровальная бумага, влажная камера для окраски препаратов, сосуд для промывания.

Растворы: 0,01 моль/л фосфатно-солевой буферный раствор (ФБР), pH 7,4 — 7,5 (Na2HPO4 x 2H2O — 7,12 г, KH2PO4 — 1,36 г, NaCl — 42,5 на 5 л дистиллированной воды); флуоресцирующие иммуноглобулины, нелюминесцирующее иммерсионное масло или его заменитель (диэтиловый эфир фталевой кислоты).

Оборудование: люминесцентный микроскоп любого типа с масляным иммерсионным объективом, лабораторная центрифуга, термостат (+37 °C), холодильник (+4 °C), настольный вентилятор, ионометр, весы торзионные.

Для получения клинических материалов в полость носа больного на глубину 2 — 3 см вводят тампон легким движением по наружной стенке носа. Затем тампон слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход, прижимают наружную стенку носа и вращательными движениями тщательно снимают десквамированный эпителий. Тампон погружают в пробирку с 2 мл ФБР. Взятые материалы необходимо быстро (в течение 1 — 4 час.) доставить в лабораторию.

Для получения осадка клеток цилиндрического эпителия пробирки с тампонами в ФБР встряхивают, тампоны отжимают и удаляют. Полученную суспензию клеток центрифугируют в течение 5 — 7 мин. при 500 — 600 g. Надосадочную жидкость сливают, осадок суспендируют пастеровской пипеткой в нескольких каплях остающейся на дне жидкости.

Для приготовления мазков применяют тщательно обезжиренные чистые предметные стекла, которые хранятся до использования в этиловом (96°) спирте. Стекла маркируют, на каждое из них наносят девять капель осадка клеток и готовят мазки диаметром 6 — 7 мм, расположенные в шахматном порядке, которые высушивают при комнатной температуре под вентилятором. Затем мазки фиксируют, погружая стекла на 10 мин. в химически чистый безводный ацетон, предварительно охлажденный до 2 — 4 °C. Полученные препараты используют для окраски флуоресцирующими антителами (ФА).

Мазки от каждого больного окрашивают антителами к вирусам гриппа A(H1N1), A(H3N2), B, парагриппа 1, 2 и 3 типов, PC-вирусу, аденовирусам и микоплазме пневмонии. С этой целью сухие препараты ФА регидратируют до исходного объема, указанного на этикетке, дистиллированной водой, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре до полного растворения препарата. После этого проводят центрифугирование конъюгатов (5 — 7 мин. при 6000 g). Рабочее разведение ФА готовят на ФБР в соответствии с указанием на этикетке. Разведенные ФА хранят в темноте при +4 °C в течение 2 недель.

Предметные стекла с фиксированными мазками помещают во влажную камеру, на каждый мазок наносят каплю соответствующих флуоресцирующих иммуноглобулинов.

Стекла с мазками обрабатывают ФА в течение 30 мин. при комнатной температуре (19 — 22 °C) или в течение 20 мин. при 37 °C во влажной камере. Затем препараты вынимают, стряхивают с них капли ФА, споласкивают стекла в дистиллированной воде и помещают в сосуд с ФБР для промывания мазков (два раза по 10 — 15 мин. при комнатной температуре). Далее препараты споласкивают дистиллированной водой и высушивают в вертикальном положении при комнатной температуре под вентилятором.

Мазки просматривают с масляной иммерсией, обращая внимание на число и тип клеток, уровень их свечения, наличие флуоресцирующих включений. В препаратах из носовой полости человека наиболее часто встречаются клетки цилиндрического эпителия, плоские эпитальные клетки, лейкоциты. Диагностическое значение имеет выявление специфического свечения в 3 — 4 клетках цилиндрического эпителия, имеющих бокаловидную или округлую форму с относительно крупным ядром и малой цитоплазмической зоной. Локализация свечения в клетках чаще всего цитоплазмическая, хотя при гриппе и аденовирусной инфекции можно видеть специфическую флуоресценцию и в ядрах клеток.

Лейкоциты и крупные полигональные клетки с мелким ядром (плоского эпителия) при анализе мазков во внимание не принимаются. Следует учитывать результаты микроскопии только тех мазков, в которых содержится не менее 15 — 20 клеток цилиндрического эпителия.

Иммуноферментный анализ (ИФА) для быстрой диагностики гриппа и ОРЗ

Иммуноферментный метод может быть использован для экспресс-диагностики гриппа и других ОРЗ в качестве альтернативы к иммунофлуоресцентному. Оба метода по частоте диагностирования дают равноценные результаты, однако ИФМ позволяет проводить количественную оценку содержания вирусного антигена, что исключает субъективизм в трактовке результатов анализа. Кроме того, при использовании ИФА можно провести одновременное исследование большого числа материалов.

Применяется для ранней диагностики гриппа в инфекционных стационарах, при расшифровке этиологии вспышек, для изучения вирусоносительства среди лиц с хронической бронхо-легочной патологией, а также для оценки приживляемости живых гриппозных вакцин.

Наилучшие результаты ИФА получаются при использовании аспиратов из носовой полости от больных ОРЗ. С этой целью мягкий катетер специального устройства для забора жидкости вводится в нос, а второй отвод присоединяется к вакуумному насосу. Секреты собираются в приемный резервуар, после чего последний перекрывается пробкой и доставляется в лаборатории или сразу замораживается. Перед анализом пробы подвергают двукратному замораживанию и оттаиванию, после чего разводят в 5 раз 0,01 м фосфатносолевым буфером (ФСБ) с 0,05% твина-20.

Допустимо использование носоглоточных смывов или мазков из области нижних носовых ходов, а также с трахеи (в условиях специализированных клиник). В этом случае слизь и клеточное содержимое с тампонов, тщательно ресуспендируют в 2 мл ФСБ, содержащего 0,05% твина-20, после чего подвергают двукратному замораживанию и оттаиванию.

Материалы можно хранить в течение 3 — 4 мес. при температуре -20 +/- 5 °C.

При работе с вируссодержащими материалами от больных все операции следует выполнять в масках, не допускается пипетирование ртом, все использованные материалы следует подвергать обработке хлорамином (3% раствор) в течение 18 ч. Необходимо избегать попадания раствора ортофенилендиамина на кожу и слизистые, в случае контакта — промыть большим количеством воды.

Материалы и оборудование: планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения, многоканальный спектрофотометр отечественного (АИФ-Ц-01С) или зарубежного производства (мультискан), регулируемые микропипетки одноканальные на 10 — 50 мкл и на 50 — 250 мкл, а также 8-канальные — на 50 — 250 мкл, устройство для забора жидкости однократного применения, электроотсос, ионометр, шейкер, термостаты, низкотемпературный прилавок, бытовой холодильник, лабораторная центрифуга, пробирки, мерные пипетки, иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов вирусов гриппа типа A или B (ИФТС «Грипп-виротест»).

Состав ИФТС «Грипп-виротест»:

1. Антитела к вирусу гриппа (типа A или B) — 1 амп.

2. Положительный контрольный образец вируса гриппа (ВГ+) — 1 амп.

3. Отрицательный контрольный образец вируса гриппа (гетерологичного типа), (ВГ-) — 1 амп.

4. Антитела к вирусу гриппа, меченные пероксидазой хрена — 1 амп.

5. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) — 1 фл.

6. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБ) — 1 фл.

7. Натрий хлористый — 1 фл.

8. Бычий сывороточный альбумин (БСА) — 3 фл.

9. Твин-20 — 1 фл.

10. Натрий фосфорнокислый двузамещенный — 1 фл.

11. Кислота лимонная — 1 фл.

12. Ортофенилендиамин — 1 фл.

13. Перекись водорода (3% раствор) — 1 фл.

14. Кислота серная (1 моль/л) — 1 фл.

15. Планшет для ИФА — 2 шт.

Приготовление растворов:

Раствор 1. Содержимое флакона № 5 (80 мг натрия углекислого и 0,146 г. натрия углекислого кислого) растворяют в 50 мл дистиллированной воды (КББ).

Раствор 2. 300 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) растворяют в 30 мл раствора 1.

Раствор 3. Содержимое флакона № 6 (712 мг натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,136 г калия фосфорнокислого двузамещенного 0,136 г калия фосфорнокислого однозамещенного, 0,25 г натрия хлористого) растворяют в 500 мл дистиллированной поды (ФСБ).

Раствор 4. К 450 мл раствора 3 добавляют 226 мг БСА и 225 мкл твина-20.

Раствор 5. К 320 мл раствора 4 добавляют 0,64 г натрия хлористого.

Раствор 6. К 50 мл раствора 3 добавляют 250 мг БСА и 25 мкл твина-20.

Раствор 7. 0,216 натрия фосфорнокислого двузамещенного растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор A), 0,126 г лимонной кислоты растворяют в 6 мл дистиллированной воды (раствор B). Смешивают 5,1 мл раствора A и 4,9 мл раствора B, объем доводят до 20 мл дистиллированной водой (ЦФБ).

Раствор 8. 20 мг ортофенилендиамина растворяют в 20 мл раствора 7, добавляют 0,2 мл 3% раствора перекиси водорода (раствор 8 готовят непосредственно перед употреблением).

Рабочее разведение антител к вирусу гриппа (АВГ). Содержимое ампулы с антителами растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат антител разводят с помощью раствора 1 до титра, указанного на ампуле.

Рабочее разведение антител к вирусу гриппа, меченных пероксидазой (АВГxП). Содержимое ампулы с антителами, меченными пероксидазой, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат конъюгата разводят с помощью раствора 6 до титра, указанного на ампуле.

Рабочий раствор положительного контрольного образца вируса гриппа гомологичного типа (ВГ+). Содержимое ампулы с ВГ+ растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат ВГ+ разводят с помощью раствора 3 до титра, указанного на ампуле.

Рабочий раствор отрицательного контрольного образца вируса гриппа гетерологичного типа (ВГ-). Содержимое ампулы с ВГ- растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Препарат ВГ- разводят с помощью раствора 3 до титра, указанного на ампуле.

Примечание: иммунореагенты тест-системы после их растворения хранить при температуре 4 — 8 °C не более 5 сут.

Проведение ИФА:

1. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора антител к вирусу гриппа в рабочем разведении.

2. Планшет закрывают крышкой и выдерживают при температуре 4 — 8 °C в течение (18 +/- 2) ч.

3. По завершении этапа адсорбции антител жидкость из лунок удаляют встряхиванием перевернутого планшета и постукиванием по фильтровальной бумаге.

4. В лунки планшета вносят по 150 мкл раствора 2.

5. Планшет закрывают крышкой и инкубируют 1,5 — 2 ч при комнатной температуре.

6. Раствор 2 удаляют, каждую лунку по 3 раза промывают 0,2 мл раствора 4, 1 раз — дистиллированной водой, планшеты осушают постукиванием.

7. В 8 краевых лунок первого ряда вносят по 100 мл раствора 4.

8. Рабочие растворы ВГ+ и ВГ- вносят по 100 мкл в лунки второго ряда (по 2 лунки на каждый).

9. Исследуемые материалы от больных вносят по 100 мкл в 2 лунки каждый.

10. Планшеты закрывают и выдерживают при температуре 4 — 6 °C в течение 18 ч.

11. Содержимое лунок удаляют, планшеты промывают 4 раза раствором 5, 1 раз — дистиллированной водой.

12. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл АВГxП в рабочем разведении.

13. Планшеты закрывают и инкубируют 2 ч при температуре (30 +/- 5) °C в течение 2 ч.

14. Планшеты промывают как указано в п. 11.

15. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора 8.

16. Планшеты инкубируют 20 мин. при комнатной температуре в защищенном от света месте.

17. Реакцию останавливают внесением в лунки по 50 мкл моль раствора серной кислоты.

Результаты учитывают с помощью спектрофотометров (мультисканов) зарубежного или отечественного производства (типа АИФ-Ц-01С) при длине волны 490 — 492 нм. По показаниям прибора рассчитывают среднюю величину оптической плотности (ОД492) раствора в контрольных лунках первого ряда (Мk). Значение Мk должно быть не выше чем 0,07. Средняя величина ОД492 растворов в двух лунках с положительными контрольными образцами (М+) должна быть не ниже чем 0,5, а отклонения значений ОД492 в дубликатах проб с ВГ+ от М+ — не более 20%. Значения ОД492 раствора в лунках с ВГ- должны быть не выше чем 0,1.

К числу положительных (содержащих вирус гриппа соответствующего типа) относят те из исследуемых проб, значения ОД492 по которым превышают значения Мk не менее чем в 1,6 раза.

Серологические методы диагностики гриппа и других ОРЗ

Серологические реакции, такие как реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК), реакция радиального гемолиза (РРГ) используются для определения уровня специфических антител в сыворотках больных ОРЗ с целью ретроспективного подтверждения диагноза. Эти методы используются также для проведения иммуноэпидемиологических исследований: определения уровня коллективного гуморального иммунитета, ретроспективного анализа природы эпидемических вспышек, оценки иммуногенной активности гриппозных вакцин.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) для диагностики гриппа и парагриппозной инфекции.

Метод основан на подавлении гемагглютинирующей активности вируса в присутствии специфических антител.

Для проведения РТГА с гриппозными антигенами используют диагностикумы из штаммов, резистентных к неспецифическим сывороточным ингибиторам. Перед постановкой реакции парные сыворотки крови от больных, взятые в острой фазе инфекции и в период реконвалесценции, разводят в 10 раз физиологическим раствором (ФР) и прогревают в водяной бане при 56 °C в течение 30 мин. При постановке РТГА с парагриппозными антигенами сыворотки необходимо дополнительно освобождать от неспецифических гемагглютининов. Для этого к сывороткам, разведенным в 10 раз, добавляют по одной капле осадка эритроцитов морской свинки, смесь встряхивают и оставляют на ночь при температуре +4 °C. В работе используют надосадочную жидкость.

При проведении РТГА с вирусами гриппа используют эритроциты кур или человека 0 (1) группы крови, с вирусами парагриппа — эритроциты морской свинки. Для получения эритроцитов морской свинки используют 2,5% раствор лимоннокислого натрия на ФР, который добавляют к цельной крови в соотношении 1:5, эритроцитов кур — раствор Альсевера (1:1), состоящий из глюкозы (2,05 г), хлористого натрия (0,42 г) и лимоннокислого натрия (0,8 г), разведенных в 100 мл дистиллированной воды. Эритроциты хранят при +4 °C до появления первых признаков гемолиза (в течение 1 — 2 недель). Перед постановкой опыта эритроциты кур и морских свинок отмывают ФР три раза, человека — 6 раз с помощью центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 15 мин. В реакцию используют 1% суспензию эритроцитов.

В РТГА используют раствор антигена, содержащий 4 ГЕ/0,1 мл.

Предварительно в реакции гемагглютинации (РГА) определяют титр антигена. Для этого в ряду лунок планшета, содержащих по 0,1 мл ФР, готовят двухкратные разведения антигена (начиная с 1:2 до титра, указанного на этикетке). После этого в каждую лунку вносят дополнительно по 0,1 мл ФР и 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Для контроля оседаний эритроцитов в отсутствие антигена в дополнительном ряду смешивают по 0,2 мл ФР и 0,2 мл эритроцитов. Через 45 — 60 мин. инкубации при температуре 20 +/- 5 °C при полном оседании эритроцитов в контрольном ряду учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают его последнее разведение, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов.

Кратность разведения антигена для получения заданной дозы вируса определяют как частное от деления титра антигена на 4. В полученном растворе определяют правильность выбранной дозы повторным титрованием антигена с доведением ее (при несоответствии) до 4 ГЕ добавлением ФР или вирусного антигена. Дополнительно дозу вируса уточняют по результатам его взаимодействия со стандартной иммунной референс-сывороткой, которая должна в повторных опытах нейтрализовать 4 ГЕ в одном и том же разведении.

Парные сыворотки от больного исследуют в одном опыте. Готовят серию двукратных разведений сывороток на ФР (от 1:10 до 1:320) в объеме 0,1 мл. К каждому разведению добавляют по 0,1 мл (4 ГЕ) вируса. Панели встряхивают и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% суспензии эритроцитов. Результаты реакции учитывают после оседания эритроцитов в контрольных лунках (без вируса). Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, в котором наблюдается полная ингибиция гемагглютинации вируса. Диагностически достоверным считается не менее чем четырехкратное увеличение титров антител в постинфекционной сыворотке по сравнению с сывороткой острой фазы заболевания.

Реакция связывания комплемента (РСК-микрометод)

РСК широко используется в серодиагностике гриппа, РС-инфекции, аденовирусных заболеваний, эффективна при диагностике коронавирусных инфекций, а также заболеваний, вызванных микоплазмой пневмонии. Не дифференцирует подтипы вирусов гриппа А, а также аденовирусов (выявляются антитела к общему комплементсвязывающему антигену). Чувствительность РСК, в отличие от РТГА, при диагностике гриппа не снижается в межэпидемический период и при появлении в циркуляции новых антигенных вариантов вируса, однако РСК менее чувствительна, чем РТГА, при изучении поствакцинального иммунитета. Обнаружение комплементсвязывающих антител в высоких титрах свидетельствует о недавно перенесенной инфекции. Результаты РСК и РТГА при гриппе являются взаимодополняющими. Поэтому эффективность диагностики существенно повышается при сочетанном использовании обоих методов.

Использование микрометода РСК предпочтительно, поскольку при этом достигается существенная экономия материалов и сывороток.

Материалы: полистироловые панели (120 x 225 мм) с лунками диаметром 15 мм, шприцы на 1 мл или капельницы от микротитратора Такаччи (для раскапывания сывороток), шприцы на 10 — 20 мл (для раскапывания комплемента, антигена и гемолитической системы), иглы к шприцам, пропускающие капли объемом 20 мкл (50 капель из 1 мл). Ингредиенты реакции: Веронал-мединаловый буфер (ВМБ). Готовят концентрат буфера следующего состава: натрия хлористого — 42,5, мединала — 1,875 г, веронала — 2,875 г, бидистиллированной воды — 1 л. Концентрат хранят при +4 °C в течение 1 — 2 мес. Перед употреблением концентрат разводят в 5 раз. Рабочий раствор должен иметь pH 7,35. Хранится в течение 2 сут.

Эритроциты барана. Дефибринированную баранью кровь трижды отмывают ФР и из осадка готовят 1% взвесь эритроцитов на ВМБ. Отмытые эритроциты хранят не более 2 сут.

Гемолитическая сыворотка. Используют коммерческую гемолитическую сыворотку, разводят ее до пятикратного титра (при титре например 1:1500 ее разводят в 300 раз).

Гемолитическая система. Готовят непосредственно перед употреблением путем добавления разведенной гемолитической сыворотки к равному объему 1% суспензии бараньих эритроцитов. Используют сразу после приготовления.

Комплемент. Сухой коммерческий комплемент или нативную сыворотку морских свинок титруют перед каждым опытом для определения содержания комплемента.

Сыворотки. Сыворотки сохраняют в замороженном состоянии при температуре -20 °C. Перед исследованием сыворотки размораживают и обрабатывают CO2. Для этого к 0,2 мл сыворотки добавляют 1,4 мл охлажденной дистиллированной воды, насыщенной CO2. Осадок удаляют центрифугированием при 2000 об./мин. в течение 10 мин. К отобранной надосадочной жидкости добавляют 0,4 мл концентрата ВМБ. Таким образом, получают сыворотку в разведении 1:10. В день исследования обработанные CO2 сыворотки прогревают в водяной бане при температуре 56 — 58 °C в течение 30 мин.

Антигены. При исследовании сывороток детей используют антигены вируса гриппа в концентрации не менее 6 КСЕ PC-вируса и микоплазмы пневмонии не менее 12 КСЕ и аденовируса — не менее 32 КСЕ. При исследовании сывороток взрослых дозу антигена можно уменьшить в 2 раза. Перед постановкой опыта все антигены, кроме гриппозных, прогревают при 56 °C в течение 30 мин.

Постановка РСК. Все ингредиенты реакции должны быть разнесены по лункам иглами одного размера. Постановка РСК занимает 3 дня. В первый день проводится подготовка материалов, обработка сывороток CO2 и титрование комплемента в присутствии антигенов. На второй день учитываются результаты титрования комплемента, производится расчет и приготовление рабочего разведения комплемента, прогревание и титрование сывороток, их смешивание с антигенами и комплементом. На третий день вводится гемолитическая система и учитываются результаты опыта.

а) Титрование комплемента. Дозу комплемента определяют отдельно для каждого антигена по результатам его титрования в присутствии антигена. Для этого готовят вспомогательный ряд разведений комплемента от 1:11 до 1:100 по приведенной ниже схеме (табл. 1). Для титрования комплемента в два длинных горизонтальных ряда панели (по 12 лунок) вносят по одной капле рабочего разведения антигена, в два нижних ряда вместо антигена вносят по одной капле буфера. Затем по вертикальным рядам добавляют по две капли соответствующих разведений комплемента, начиная с максимального. Панели складывают, закрывают пустой панелью, подкладывают влажную марлевую салфетку, заворачивают в полиэтиленовую пленку и помещают на 18 ч в холодильник (+4 °C). После этого панели выдерживают 10 — 15 мин. при комнатной температуре и затем в каждую лунку добавляют по две капли свежеприготовленной гемолитической системы. Ингредиенты перемешивают легким встряхиванием, после чего панели помещают в водяную баню (+40 °C) на 5 мин. и определяют титр комплемента в присутствии каждого антигена. Титром является последнее разведение комплемента, которое вызывает полный гемолиз бараньих эритроцитов. Антигены с высокой антикомплементарной активностью бракуют. Рабочее разведение комплемента соответствует двум единицам и рассчитывается отдельно для каждого антигена.

б) Постановка главного опыта. Используют разведения сывороток, начиная с 1:10 до 1:320. На отдельной панели в пять лунок, кроме первой, вносят по 0,2 мл ВМБ, первую лунку оставляют пустой. Затем в первые две лунки вносят по 0,2 мл сыворотки в разведении 1:10, далее готовят разведение сыворотки, перенося ее (после перемешивания) по 0,2 мл из второй лунки последовательно вплоть до шестой. Затем по одной капле каждого разведения сыворотки переносят в основную панель в количество рядов, равное числу используемых в реакции антигенов. После раскапывания сыворотки шприц три раза промывают ВМБ. Каждый из антигенов (в рабочем разведении) смешивают с равным объемом соответствующего рабочего разведения комплемента и помещают в лед. По две капли полученной смеси добавляют к разведениям сывороток. Содержимое панелей перемешивают покачиванием и панели переносят в холодильник на 18 ч.

Таблица 1

СХЕМА РАЗВЕДЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ ЕГО ТИТРОВАНИЯ

	Номера лунок панели
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Объем комплемента в разведении 1:20 <*>	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8
Объем веронал-мединалового буфера	1,8	1,7	1,6	1,5	1,4	1,3	1,2	1,0	0,8	0,6	0,4	0,2
Получаемые разведения комплемента	1 ---- 200	1 ---- 132	1 ---- 100	1 -- 80	1 -- 66	1 -- 58	1 -- 50	1 -- 40	1 ----- 33,2	1 ----- 28,6	1 -- 25	1 -- 22
Разведение комплемента, используемое в опыте <**>	1 ---- 100	1 -- 66	1 -- 50	1 -- 40	1 -- 33	1 -- 29	1 -- 25	1 -- 20	1 ----- 16,6	1 ----- 14,3	1 ----- 12,5	1 -- 11

---

<*> Для приготовления разведения комплемента 1:20 берут 0,75 мл комплемента и добавляют 14,25 мл рабочего разведения буфера.

<**> Для ускорения работы буфер вместо отсутствующей в опыте сыворотки добавляется вместе с рабочим разведением комплемента. Это учтено при составлении схемы. Поэтому в ходе титрования комплемента в каждую лунку панели добавляют по две капли его разведений, указанных в строке 3. Таким образом, истинное разведение комплемента, используемое в опыте, будет в два раза меньше и соответствует величинам, указанным в строке 4.

Контроли: — сывороток (смешивание по одной капле сыворотки, разведенной 1:10, комплемента и буфера); — антигенов (по одной капле антигена, комплемента и буфера); — активности и специфичности антигена (по одной капле антигена, комплемента и иммунной референс-сыворотки, взятой в последовательных разведениях).

в) Учет опыта. Готовят гемолитическую систему и добавляют ее по 2 капли во все лунки панелей. Панели помещают в водяную баню (+40 °C). Реакцию учитывают сразу после наступления полного гемолиза в лунках с контролями антигенов и сыворотки. Результаты реакции считаются достоверными при условии, что антиген выявляет антитела в стандартный референс-сыворотке до полного титра. Нарастание титра антител во второй сыворотке по отношению к первой в четыре и более раз расценивается как диагностически достоверное.

Реакция радиального гемолиза (РРГ)

Принцип метода основан на гемолизе введенных в гель сенсибилизированных вирусом эритроцитов в присутствии комплемента и специфических антител. РРГ может быть использована для диагностики гриппа, парагриппа, PC-инфекции.

Об изменении концентрации антител судят по разнице в диаметре зон гемолиза, не прибегая к обычным трудоемким операциям титрования сывороток.

Показана возможность дифференцированного определения антител к гемагглютинину и нейраминидазе вирусов гриппа за счет применения соответствующих рекомбинантных штаммов, содержащих один из поверхностных антигенов, гомологичный определяемому, а второй — гетерологичный (от вирусов животных или птиц). На результаты реакции не влияют неспецифические ингибиторы сывороток. Вместе с тем следует избегать повторного замораживания — оттаивания сывороток, поскольку это может привести к появлению у них антикомплементарной активности, а также предохранять их от роста бактерий, способных вызывать неспецифический лизис эритроцитов.

Исследуемые сыворотки перед употреблением разводят в 10 раз на ФР, прогревают при 56 °C в течение 30 минут. Допускается использование нативных негретых сывороток (в частности, для индикации антител к вирусам гриппа B) в случае, если последние не вызывают неспецифический лизис в контрольных пластинах, содержащих эритроциты без вируса гриппа.

Приготовление пластин для РРГ

Эритроциты кур или барана, трижды отмытые 0,01 М ФСБ (pH 7,2), обрабатывают 5 x 10-4 моль/л раствором перйодата калия. Для этого 11,5 мг KJO4 растворяют в 100 мл ФСБ. К осадку эритроцитов добавляют равный объем раствора KJO4. Эритроциты перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин., после чего центрифугируют при 1300 о. в течение 15 мин. и разводят ФСБ до 25% концентрации.

Вирус разводят на ФСБ до концентрации 32 ГАЕ/0,1 мл и смешивают с 25% суспензией эритроцитов в соотношении 30:1. Взвесь перемешивают в течение 15 мин. при комнатной температуре, после чего центрифугируют 15 мин. при 1300 g.

Осадок сенсибилизированных эритроцитов дважды отмывают ФСБ, разводят ФСБ до 25% концентрации и разливают по пробиркам по 0,1 мл. В каждую из пробирок добавляют по 0,1 мл комплемента и 2,8 мл 1,5% раствора агарозы, охлажденного до 45 °C, смесь быстро перемешивают и переносят на пластину (производства ВНИИМТ, г. Москва), пластины хранят в сосуде с 70° спиртом-ректификатом, перед употреблением подсушивают в течение 1 ч при 37°.

После полного застывания геля в нем вырезают два ряда лунок диаметром 3 мм, агар отсасывают. Расстояние между лунками — 12 мм от края пластины — 5 - 6 мм. На 1 пластине исследуют 6 парных сывороток. Пластины рекомендуется использовать в течение первых 3 — 5 сут. после приготовления. При необходимости более длительного хранения пластин (в течение 7 — 10 суток) их готовят в стерильных условиях во избежание роста бактерий на поверхности агара. Контрольные пластины готовят из эритроцитов той же серии изложенным выше способом, исключая этап добавления вируса.

Постановка опыта. Исследуемые парные сыворотки и референс — (позитивную и негативную) — сыворотки в разведении 1:10 вносят по 10 мкл в опытные и контрольные пластины (первые сыворотки — в верхний, вторые — в нижний ряд лунок).

Пластины выдерживают в течение 18 ч при +4 °C (в закрытом виде во избежание подсыхания) для осуществления процесса диффузии антител в гель, затем 3 — 4 ч при 37 °C (формирование зон гемолиза эритроцитов). Увеличение диаметра зоны гемолиза на 1 м во второй сыворотке по отношению к первой считается достоверным при условии, что в позитивных контрольных пробах (содержащих сыворотку с известным титром антител) отчетливо воспроизводится диаметр зоны гемолиза, а в контрольной пластине (без вируса) зон гемолиза в присутствии данной сыворотки не формируются.

Начальник Главного эпидемиологического управления Минздрава СССР М. И. Наркевич

---