1.
-
в положительном контрольном образце ДНК должна выявляться полоса красно-оранжевого цвета, соответствующая по размеру специфическим фрагментам селективных маркеров ГММ;
-
в отрицательном контрольном образце полоса красно-оранжевого цвета должна отсутствовать;
-
наличие в анализируемом материале полосы красно-оранжевого цвета, располагающейся строго на уровне полосы положительного контрольного образца ДНК, свидетельствует о наличии в исследуемом образце соответствующего селективного маркерного гена ГММ. При отсутствии такой полосы результат считают отрицательным;
-
наличие полосы красно-оранжевого цвета в отрицательном контрольном образце, располагающейся на уровне полосы положительного контрольного образца ДНК, считают результатом контаминации.
IV. Молекулярно-генетический анализ пищевой продукции, полученной с использованием генно-инженерно-модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генно-инженерно-модифицированные аналоги, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени
4.1. Для выявления ГММ и МГМА в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени используют следующие материалы, оборудование, реактивы:
1)
амплификатор с оптической приставкой типа Rotor Gene - 3000, ABI Prism 7000, iCycler IQ или отечественные аналоги;
2)
компьютер, совместимый с программным обеспечением амплификаторов с оптической приставкой;
3)
оптические 96-луночные планшеты типа MicroAmp;
4)
оптические крышки типа MicroAmp;
5)
оптически прозрачные адгезивные пленки;
6)
термостат, поддерживающий температуру +45 °C, для пробирок объемом 1,5 мл;
7)
центрифуга со скоростью вращения ротора до 12000 об./мин. для пробирок вместимостью 1,5 и 0,5 мл типа "эппендорф";
8)
встряхиватель вибрационный типа "вортекс" со скоростью вращения до 3000 об./мин.;
9)
очки/маска защитные;
10)
холодильник бытовой электрический;
11)
морозильная камера, обеспечивающая температуру (-20) °C или ниже;
12)
гомогенизатор типа "SilentCrusher" или других моделей;
13)
ступка фарфоровая с пестиком;
14)
пинцет медицинский;
15)
ножницы медицинские;
16)
скальпель медицинский;
17)
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности;
18)
дистиллятор;
19)
анализатор потенциометрический;
20)
облучатель бактерицидный настенный;
21)
дозаторы с переменным объемом дозирования:
0,2 - 2,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 с шагом 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 с шагом 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 с шагом 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 с шагом 1 мм3, 2 - 10 см3 с шагом 0,1 см3;
22)
пробирки типа "эппендорф" вместимостью 1,5 мл;
23)
пробирки типа "эппендорф" для ПЦР вместимостью 0,5 мл;
24)
наконечники полимерные объемом 1 - 200 мкл;
25)
наконечники полимерные объемом 200 - 1000 мкл;
26)
перчатки резиновые;
27)
колбы плоскодонные конические разной вместимости;
28)
цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 см3;
29)
воронки стеклянные;
30)
штативы для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;
31)
комплект N 2 (модифицированный) реагентов для амплификации ДНК "Набор для выделения ДНК из ферментных препаратов, стартерных и заквасочных культур, БАД к пище";
32)
реактивы:
-
тритон Х-100,
-
гуанидина гидрохлорид,
-
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),
-
додецилсульфат натрия,
-
суспензия двуокиси кремния,
-
фенол водонасыщенный,
-
хлороформ водонасыщенный,
-
спирт этиловый ректификованный,
-
ацетат аммония,
-
протеиназа K,
-
магния хлорид,
-
калия хлорид,
-
водный раствор дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),
-
креозоловый красный,
-
термостабильная ДНК-полимераза,
-
масло вазелиновое,
-
трис-ацетат,
-
ледяная уксусная кислота,
-
агароза для электрофореза,
-
бромистый этидий,
-
вода деионизированная.
4.2. Допускаются к использованию оборудование, инструменты и материалы аналогичного назначения других типов, разрешенные к применению в установленном порядке и с характеристиками, обеспечивающими проведение исследований в соответствии с данным документом.
4.3. Выделение ДНК ГММ и МГМА из заквасочных и стартерных культур, БАД, ферментных препаратов и пищевых продуктов осуществляют в соответствии с [п. п. 3.13](#p101445) - [3.17](#p101476) настоящих Методических указаний.
4.4. ПЦР в реальном времени осуществляют с использованием модифицированного комплекта N 2 реагентов для амплификации ДНК "Набор реагентов для выявления селективных маркеров генетически модифицированных микроорганизмов". Модификация предусматривает использование в реакционной смеси не только праймеров, но и флуоресцентно-меченых зондов, а также использование контрольной ДНК ГММ с известной концентрацией в нескольких десятикратных разведениях.
4.5. Флуоресцентно-меченые зонды представляют собой олигонуклеотиды, комплементарные амплифицируемой последовательности-мишени, содержащие на 5'-конце флуорофор - донорфлуоресцентного излучения, а на 3'-конце - его акцептор (гаситель).
Нарастание флуоресцентного свечения наблюдают после физического разобщения флуорофора и гасителя; разобщение флуорофора и гасителя происходит при гибридизации с амплифицируемым фрагментом ДНК за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы, разрушающей зонд после его гибридизации с амплифицируемой последовательностью. Рост регистрируемого флуоресцентного свечения происходит пропорционально нарастанию числа ампликонов. Это позволяет регистрировать накопление продуктов амплификации в реальном времени, а сравнение кинетики флуоресценции ДНК-стандартов и исследуемого образца - определять относительную концентрацию ДНК в образце.
4.6. Зонды синтезируют на автоматическом олигонуклеотидном синтезаторе типа ASM102U фосфитамидным методом в режиме DMT-on, используя фосфорамидиты и полимерный носитель типа Glen Reseach. Для введения на 3'-конец зонда метки диметиламинофенилазобензойной кислоты (DABCYL) в качестве гасителя флуоресценции используют фазу 3'-Dabcyl CPG (типа Glen Reseach) в стандартном режиме синтеза. Введение на 5'-конец зонда флуорофора - донора флуоресценции - осуществляют автоматическим синтезом, при использовании 6-карбоксифлуоресцеин-амидита (FAM-фосфорамидит). Первичную очистку зондов осуществляют на колонках типа Poly-Pac, с последующей дополнительной очисткой в полиакриламидном геле.
4.7. Для ПЦР в реальном времени используют ферменты Taq-полимеразу Termo-Star, или Taq-полимеразу HotRescue, инактивированные антителами, или полимеразу AmpliTaq Gold, обладающие выраженной 5'-экзонуклеазной активностью.
4.8. Для проведения ПЦР в реальном времени используют систему, состоящую из термоциклера (амплификатора) и флуоресцентного детектора продуктов ПЦР в реальном времени.
4.9. Концентрацию ДНК ГММ в образце определяют путем сравнения кинетики флуоресценции ДНК-стандартов в диапазоне разведений контрольных препаратов (10-кратных разведений контрольной ДНК известной концентрации) и исследуемого образца.
4.10. Амплификацию проводят по двухступенчатой программе, объединяющей стадии отжига и элонгации в один этап; конечная концентрация зондов в реакционной смеси - до 200 нМ.
Реакцию проводят в реакционной смеси объемом 50 мкл, включающей в себя: десятикратный реакционный буфер, адаптированный к используемому типу полимеразы; 250 мкМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов; 300 нМ каждого из праймеров; 200 нМ флуоресцентно-меченого зонда; 5 ед. Taq-полимеразы.
Амплификацию проводят по программе:
1)
1 цикл - 10 мин. -95 °C;
2)
50 циклов: 20 с - 95 °C, 1 мин. - 65 °C.
4.11. Для постановки ПЦР в реальном времени в используемом приборе для амплификации создают специальный протокол в соответствии с инструкциями по пользованию; после завершения создания протокола проверяют наличие в списке режима компенсации базовой линии ПЦР и отмечают используемые флуоресцентные красители. Контрольную ДНК используют в известных разведениях определенной концентрации (стандартах); количество повторов стандартов определяют в соответствии с руководством по эксплуатации прибора.
4.12. Детекцию результатов ПЦР в реальном времени производят автоматически в рамках созданного протокола в графическом и цифровом виде. Автоматический анализ данных происходит следующим образом: последние 95% данных, собранных на каждом шаге, фильтруются средневзвешенным методом. Для экспериментов по амплификации выбирают циклы базовой линии для каждой кривой (образцы) индивидуально с учетом общего оптимального значения порога. По значениям стандартов вычисляют стандартную кривую, на основе которой определяют концентрации ДНК ГММ в исследуемых пробах.