Дополнение к документу «Временные гигиенические нормативы и метод определения содержания гистамина в рыбопродуктах»

(утв. Минздравом СССР 31.03.1987 № 4274-87)

ДОПОЛНЕНИЕ К ДОКУМЕНТУ «ВРЕМЕННЫЕ ГИГИЕНИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ И МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИСТАМИНА В РЫБОПРОДУКТАХ»

Необходимость дополнения документа колориметрическим методом определения гистамина обусловлена недостаточной оснащенностью лабораторий рыбоперерабатывающих предприятий спектрофлуориметрами, которые требуются для осуществления контроля гистамина в рыбопродуктах флуориметрическим методом. Колориметрический метод выделения, идентификации и количественного определения гистамина в рыбных продуктах предполагает использование широко распространенных отечественных колориметров или спектрофотометров и прост в использовании.

Метод выделения, идентификации и количественного определения гистамина в рыбопродуктах (колориметрический метод)

1. Сущность метода

В основе колориметрического метода определения гистамина лежит измерение величины абсорбции окрашенного производного, полученного при взаимодействии гистамина с диазореактивом. Предел обнаружения метода — 10 мг/кг, относительное стандартное отклонение при определении гистамина в интервале концентраций 20 — 175 мг/кг изменяется от 0,08 до 0,25. Степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина — 94 — 99%.

2. Аппаратура, материалы, реактивы

Баня водяная.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104-80 с допускаемой погрешностью взвешивания +/- 0,001 г.

Весы лабораторные общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 1 кг по ГОСТ 24104-80 с допускаемой погрешностью взвешивания +/- 0,1 г.

Воронки В-100-150-ХС; В-35-50-ХС по ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250-29/32 ХС по ГОСТ 25336-82.

Колбы конические К -1-100-29/32 ТС по ГОСТ 25336-82. н

Колбы мерные 1-100-2 или 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

Колориметр фотоэлектрический по ГОСТ 12083-78 со светофильтром с лямбда = 490 +/- 10 нм или спектрофотометр СФ-26 (или другой аналогичный).

Микроразмельчитель тканей РТ-2 по МРТУ 64-1-1505-63.

Мясорубка по ГОСТ 4025-83.

Пипетки 4-1-1 или 5-1-1, 7-1-5 или 7-2-5; 7-1-10 или 7-2-10 по ГОСТ 20292-74.

Пробирки мерные П-2-10 или П-2-15 по ГОСТ 1770-74.

Термометр 0 — 100 °C по ГОСТ 2045-71.

Холодильник бытовой.

Шкаф лабораторный сушильный.

Цилиндры мерные 1-50 или 2-50 по ГОСТ 1770-74.

Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919-83.

Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026-76.

н-Бутанол по ГОСТ 6006-78, ч.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.

Гистамин или гидрохлорид гистамина.

Кислота соляная по ГОСТ 3118-77, х.ч., раствор 3,75 г/куб. дм (0,1 н раствор).

Кислота трихлоруксусная по ТУ 6-09-1926-77, раствор 50 г/куб. дм (5-процентный раствор).

Натрий азотистокислый по ГОСТ 4197-74, ч.д.а., раствор 50 г/куб. дм (5-процентный раствор).

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, ч.д.а., раствор 200 г/куб. дм (5 н раствор).

Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166-76, х.ч., прокаленный.

Натрий углекислый по ГОСТ 83-79, х.ч., раствор 40 г/куб. дм (4-процентный раствор).

Паранитроанилин, ч.д.а.

Этилацетат по ГОСТ 22300-76, ч.д.а.

3. Подготовка к испытанию

3.1 Приготовление раствора паранитроанилина

Паранитроанилин очищают путем перекристаллизации в воде. Для этого растворяют его в горячей дистиллированной воде и охлаждают раствор до комнатной температуры. Выпавшие кристаллы отфильтровывают и высушивают при 80 °C в течение 10 — 15 мин., 0,1 г паранитроанилина растворяют в 100 куб. см 0,1 н соляной кислоты. Хранят раствор в холодильнике до момента употребления.

3.2 Приготовление диазореактива

Диазореактив получают непосредственно перед использованием путем смешивания 10 куб. см раствора 1 г/куб. дм паранитроанилина в 0,1 н соляной кислоте и 1 куб. см раствора 50 г/куб. дм азотистокислого натрия и охлаждают до 0 °C.

3.3 Приготовление н-бутанола, насыщенного водой

Для приготовления н-бутанола, насыщенного водой, встряхивают 50 куб. см н-бутанола и 20 куб. см дистиллированной воды в делительной воронке. После разделения фаз отделяют верхний бутанольный слой.

3.4 Подготовка проб к анализу

Отбор проб проводится по ГОСТ 7631-85 «Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний» и ГОСТ 87.56.0-70 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».

Образцы доставляют в лабораторию сразу же после отбора проб. В случае длительной транспортировки (более 1 ч) рыба-сырец должна транспортироваться в охлажденном состоянии, а мороженая — в замороженном состоянии. Исследование образцов должно проводиться в день доставки их в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны храниться при температуре не выше -8 °C не более трех суток.

Доставка и хранение образцов консервов и другой продукции должны проводиться с соблюдением режимов, предусмотренных НТД (действующими инструкциями и стандартами).

3.5 Экстракция

Навеску 10 г (с точностью до 0,01 г) приготовленного образца помещают в сосуд микроразмельчителя тканей, добавляют 25 куб. см 5-процентного раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают 5 мин. Полученную смесь переносят в плоскодонную коническую колбу на 100 куб. см, ополаскивают сосуд смесителя дважды 5 — 10 куб. см 5-процентного раствора трихлоруксусной кислоты; растворы объединяют. Колбу снабжают воздушным холодильником и выдерживают на водяной бане при 60 °C в течение 15 мин. Охлажденную смесь переносят количественно в цилиндр, доводят до 50 куб. см 5-процентным раствором трихлоруксусной кислоты и фильтруют через складчатый бумажный фильтр (фильтрат 1).

3.6 Построение калибровочной кривой

Готовят стандартные растворы гистамина с концентрацией 5, 10, 20 и 40 мкг/куб. см в 5-процентной трихлоруксусной кислоте. Для приготовления основного раствора гистамина с концентрацией 40 мкг/куб. см 4,0 мг гистамина помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в 5-процентной трихлоруксусной кислоте и доводят объем до метки. Рабочие растворы гистамина с концентрациями 20, 10, 5 мкг/куб. см получают путем разбавления 5-процентным раствором трихлоруксусной кислоты основного раствора в 2, 4 и 8 раз соответственно. Основной раствор гистамина хранят в холодильнике неделю, рабочие растворы готовят в день проведения анализа.

5 куб. см каждого стандартного раствора помещают в пробирки с притертыми пробками, добавляют 1 куб. см 20-процентного раствора гидроксида натрия и вносят в раствор при перемешивании безводный углекислый натрий до получения насыщенного раствора. Добавляют 5 куб. см н-бутанола, насыщенного водой, и энергично встряхивают пробирки в течение 30 с. После разделения фаз отбирают пипеткой или шприцем 3 куб. см верхнего бутанольного слоя и переносят в другую пробирку с притертой пробкой, содержащую 3 куб. см 0,1 н раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое пробирки в течение 30 с. После разделения фаз отбирают 2 куб. см нижнего водного слоя, переносят в другую пробирку, добавляют 2 куб. см 4-процентного раствора углекислого натрия и выдерживают 5 мин. при 0 °C. Приливают к охлажденному раствору 2 куб. см холодного свежеприготовленного диазореактива, встряхивают и вновь выдерживают 5 мин. при 0 °C. Добавляют 4 куб. см этилацетата и энергично встряхивают в течение 30 с. После разделения фаз сухой пипеткой отбирают верхний слой и переносят в пробирку, содержащую безводный сульфат натрия (раствор окрашенного производного в этилацетате должен быть прозрачным). Измеряют величину абсорбции раствора при 495 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют этилацетат. На основании полученных данных строится калибровочная кривая зависимости величины абсорбции от концентрации гистамина в растворе.

4. Проведение испытаний

5 куб. см фильтрата 1, полученного по п. 3.5, помещают в пробирку и проводят процедуру, описанную в п. 3.6, начиная с добавления раствора гидроокиси натрия.

Если образцы содержат гистамина более 200 мг/кг, необходимо разбавить полученный фильтрат 5-процентным раствором трихлоруксусной кислоты.

Для определения концентрации гистамина в экстракте используется калибровочная кривая.

5. Обработка результатов

Содержание гистамина в образце продукта Г (мг/кг) вычисляют по формуле:

                              с х У

Г = ----- х Ф, м

где:

с — концентрация гистамина, найденная по калибровочной кривой, мкг/куб. см;

У — объем экстракта, куб. см (50 куб. см);

м — навеска образца продукта, г (10 г); У фильтрата 1 + У 5% трихлорукс. к-ты

Ф — фактор разбавления (Ф = -------------------------------------). У фильтрата 1

Вычисление проводят до единиц. За окончательный результат принимают среднее арифметическое значение результатов трех параллельных определений. Допустимое расхождение между результатами параллельных определений не должно превышать 50% по отношению к среднему арифметическому значению.

Определение гистамина проводится в отдельных видах рыб и рыбных продуктах в пунктах выработки продукции.

Периодичность контроля лабораториями санэпидстанций устанавливается не реже 1 раза в квартал. Содержание гистамина в экспортных и импортных консервах определяется в каждой партии отраслевыми лабораториями. В случае нарушения температурного режима хранения консервов проводится внеочередной контроль.

---