--- title: "<Письмо> Роспотребнадзора от 13.12.2013 N 01/14260-13-32" number: "01/14260-13-32" issuer: "Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" issued_on: 2013-12-13 status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/pismo-0114260-13-32" --- ## <Письмо> Роспотребнадзора от 13.12.2013 N 01/14260-13-32 # <Письмо> Роспотребнадзора от 13.12.2013 N 01/14260-13-32 "О направлении рекомендаций ВОЗ по лабораторным исследованиям ближневосточного респираторного синдрома коронавируса" **ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ** **ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА** ## ПИСЬМО от 13 декабря 2013 г. N 01/14260-13-32 **О НАПРАВЛЕНИИ РЕКОМЕНДАЦИЙ ВОЗ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ** **БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА КОРОНАВИРУСА** Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека направляет [рекомендации](#p100006) Всемирной организации здравоохранения "Лабораторные исследования ближневосточного респираторного синдрома коронавируса" для использования в работе.
Вр.и.о. руководителя
**А.Ю.ПОПОВА**
**ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЛИЖНЕВОСТОЧНОГО РЕСПИРАТОРНОГО** **СИНДРОМА КОРОНАВИРУСА** Межсессионные рекомендации Сентябрь 2013 ### 1. Введение Целью данного документа является предоставление лабораториям и вовлеченным в процесс лабораторных исследований посредникам межсессионных рекомендаций по ближневосточному респираторному синдрому коронавируса (БРС-КВ). Всемирная организация здравоохранения регулярно публикует обновляемые сведения о текущем положении заболеваемости БРС-КВ на: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/en/. Рекомендации, подготовленные ВОЗ, основаны на текущих знаниях. Они были пересмотрены лабораторными экспертами, включая специалистов, которые имеют опыт обращения с данным вирусом и другими коронавирусами, и квалифицированных специалистов в области диагностических проб на коронавирусы. ВОЗ тщательно отслеживает исследования, относящиеся к этому вирусу, и пересмотрит данные ею рекомендации, если это будет необходимо. В случае если нововведения не появятся, срок действия данного документа истечет 28 февраля 2014 г. ### 2. Показания для обследования ВОЗ рекомендует, чтобы практикующие врачи, врачи-эпидемиологи и лабораторные научные работники для выявления заболевания следовали схеме опроса, разработанной ВОЗ и опубликованной здесь: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/case_definition/en/index.html, которая будет при необходимости обновляться. Тестирование на другие патогенные заболевания, используя лабораторные процедуры, как это установлено руководствами местного уровня по приобретенной пневмонии, должно проводиться в рабочем порядке, но не задерживая при этом тестирование на БРС-КВ. Примеры другой этиологии болезни включают: пневмококк, ХИБ-инфекция, легионелла пневмобилия, вирусы гриппа и синцитиальный респираторный вирус человека. ### 3. Хранение и транспортировка проб Когда бы ни были взяты пробы для исследования, необходимо следовать руководству по инфекционному контролю. ВОЗ разработано специальное руководство, которое доступно по следующей ссылке: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/IPCnCoVguidance_06Мау13.pdf. Забор проб лучше производить из нижних дыхательных путей, где находятся содержащие наивысшие концентрации вируса материалы, такие как бронхоальвеолярные выделения, мокротные и трохейные материалы. Недавние сообщения о случаях заболеваемости инфекцией БРС-КВ в Саудовской Аравии [(3)](#p100085) подтвердили также важность при выявлении вируса забора проб из верхних дыхательных путей, таких как мазки из носо- и ротоглотки. При возможности необходимо забирать пробы как из верхних, так и из нижних дыхательных путей. Для того чтобы увеличить вероятность обнаружения вируса, в течение курса лечения необходимо забирать множество проб с различных участков тела пациента. Даже после первичного обнаружения вируса настоятельно рекомендуется продолжать забор проб и их исследование, так как это позволит улучшить знания в области продолжительности бессимптомного вирусовыделения. Вирус обнаружен в моче и кале, но на предыдущем уровне он был найден в нижних дыхательных путях [(1)](#p100083). На сегодняшний день существует мало информации о значении цельной крови при заборе проб для выявления БРС-КВ. Необходимо забирать сыворотку крови. Парные пробы более предпочтительны, однако одинарная проба тоже ценна. Забор сыворотки для парных проб должен производиться спустя 14 - 21 день, при условии, что первая проба была взята в течение первой недели заболевания. Если возможна только одинарная проба, она должна быть произведена минимум через 14 дней после появления симптомов. В таблице 1 перечислены виды проб, которые могут быть взяты, а также нормы по их хранению, транспортировке. | Тип материала | Определенная среда при транспортировке | Транспортировка до лаборатории | Категория при перевозке опасных материалов | | --- | --- | --- | --- | | Сыворотка | нет | 4 °C [<*>](#p100030)
Если период после взятия пробы > 48 часов, необходима заморозка и транспортировка на сухом льду | Биологические препараты, Категория Б | | Бронхоальвеолярные выделения | нет | аналогично | аналогично | | Трохейные аспираты | нет | аналогично | аналогично | | Аспираты из носоглотки | нет | аналогично | аналогично | | Комбинированные мазки из носо- и ротоглотки | Вирусная транспортная среда | аналогично | аналогично | | Ткани, полученные при биопсии или аутопсии, включая ткани легких | Вирусная транспортная среда или стерильный физиологический раствор, если проба на бактериальные культуры | аналогично | аналогично | | Сыворотка для серологического исследования:
Парные пробы с первым забором предпочтительно в первую неделю болезни и вторым забором двумя - тремя неделями позже.
Одинарная проба должна быть взята минимум через 14 дней после проявления симптомов | нет | 4 °C [<*>](#p100030)
или заморозить и перевозить на сухом льду | аналогично | ---
<*> С использованием водного льда или путем холодного обертывания, по обстоятельствам.
Пробы должны быть доставлены в лабораторию как можно быстрее. Важность надлежащего обращения при транспортировке не может быть переоценена. Если существует вероятность задержек при доставке проб в лабораторию, настоятельно рекомендуется пробы заморозить, предпочтительно при -80 °C, и транспортировать на сухом льду. Однако важно избегать повторного замораживания и размораживания проб. Сыворотка должна быть выделена из цельной крови и может храниться при 4 °C, а также может быть заморожена до -20 °C и ниже и транспортироваться на сухом льду. Необходимо избегать хранения респираторных и сывороточных проб в домашних морозильных камерах без образования наледи в связи с сильными температурными колебаниями в них. Перевозка проб в пределах государственных границ должна отвечать действующим федеральным нормативам. Международная транспортировка проб БРС-КВ должна отвечать международным нормативам, как описано в "Руководстве ВОЗ по транспортировке патогенных материалов 2013 - 2014", доступном по ссылке: http://www.who.int/ihr/publications/who_hse_ihr_20100801/en/index.html. ### 4. Алгоритм выявления БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и секвенирования Порядок подтверждения случаев инфекции БРС-КВ основан на выявлении уникальных цепочек вирусной РНК путем осуществления в режиме реального времени полимеразной цепной реакции с обратной транскриптацией (рвОТ ПЦР) с подтверждением с помощью секвенирования нуклеиновой кислоты, если это необходимо. Ниже приведены результаты серологического исследования БРС-КВ. При определенных условиях, но не в случае рутинной диагностики, лаборатории с соответствующим опытом и системами сдерживания распространения инфекции могут предпринять попытку выделить вирус из клетки. Процедуры по выделению вируса не подпадают под текущую редакцию предлагаемых рекомендаций. При наличии данного вируса все исследования должны проводиться в соответствующим образом оборудованных лабораториях персоналом, обученным правилам техники безопасности. Межсессионные рекомендации ВОЗ по системе управления лабораторными биорисками при работе с БРС-КВ опубликованы по ссылке: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/NovelCoronavirus_InterimRecommendationsLaboratoryBiorisk_190213/en/index.html. Отдельные страны - члены ВОЗ будут решать, какая из лабораторий, если таковые имеются, будет проводить данные исследования. Было разработано три метода рвОТ-ПЦР для рутинного выявления БРС-КВ, а их детали были опубликованы. Это следующие методы: исследование, нацеленное на изменение гена E протеина (upE) [(4)](#p100086), и исследование, направленное на открытую рамку считывания 1б (ОРС 1б) (4) и открытую рамку считывания 1а (ОРС 1а) [(5)](#p100087). Исследование upE считается высокочувствительным и поэтому является рекомендуемым при скрининге, также как и ОРС 1а исследование, которое обладает той же чувствительностью. ОРС 1б исследование считается менее чувствительным по отношению к ОРС 1а. Источники [(4)](#p100086) и [(5)](#p100087) содержат подробные описания по осуществлению данных исследований. Кроме того, в Центрах по Контролю и Профилактике Заболеваний США (ЦКПЗ) было разработано тестирование рвОТ-ПЦР, направленное на БРС-КВ нуклеокапсид (Н) белкового гена, которое может служить дополнением к upE и ОРС 1а исследованиям для скрининга и подтверждения. Было установлено 2 участка генома нового коронавируса, подходящих для секвенирования, для более точного подтверждения диагноза. Они находятся в РНК-зависимой РНК полимеразе (РзРп) и в (Н) генах [(5)](#p100087). Дальнейшее описание данных исследований доступно на сайте Института Вирусологии, Бонн, Германия: http://www.virology-bonn.de/index.php?id=40. Дальнейшую информацию о данных исследованиях, сформулированную американскими ЦКПЗ, можно получить у Декана Д. Ердмана (dde1@cde.gov). Рисунок 1 показывает алгоритм проведения исследования при подозрении на случай заболеваемости БРС-КВ с помощью рвОТ ПЦР.
Рисунок 1. Алгоритм проведения исследования на БРС-КВ
методом рвОТ-ПЦР
![4. Алгоритм выявления БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и секвенирования](https://i.bukva.ai/iBHSrbv7Y/img_0.png) Результаты исследования на БРС-КВ лабораторий с ограниченным опытом в данных исследованиях должны подтверждаться лабораториями с большим опытом обработки образцов, содержащих этот вирус. ВОЗ может оказывать помощь государствам-членам в поиске лабораторий, способных предоставить такую услугу. Кроме того, лаборатории возможно будут заинтересованы в перепроверке своих положительных результатов методом повторного извлечения нуклеиновой кислоты и повторного тестирования образцов. При противоречии двух анализов рвОТ-ПЦР, направленных на уникальное местоположение в геноме БРС-КВ, необходимо проведение секвенирования ампликона, полученного из соответствующего ОТ-ПЦР анализа. Эти данные секвенирования, в дополнение к подтверждению присутствия вируса, могут также дать ценную информацию, которая может помочь в понимании происхождения вируса и способов его распространения. Поэтому рекомендуется секвенировать максимально возможное количество нуклеиновых кислот БРС-КВ из положительных образцов. Известны случаи четырех коронавирусов человека с поражением дыхательных путей легкой и средней тяжести. Это бэта-коронавирусы hCoV-OC43 и hCoV-HKU1 и альфа-коронавирусы hCoV-229E и hCoV-NL63. Коммерческий многоканальный тест ПЦР для респираторных возбудителей в состоянии определить эти вирусы. Важно положительные результаты данных тестов ошибочно не связать с БРС-КВ. Серия отрицательных результатов не должна полностью исключать вероятность инфицирования. Ниже описан ряд факторов, которые могут привести к ложно-отрицательным результатам: - низкое качество образца, - образец был взят либо слишком поздно, либо слишком рано, - образец был взят и транспортирован не должным образом, - технические причины, возникающие при тестировании, например мутация ПЦР ингибирования. Если получен отрицательный результат у пациентов с высоким индексом подозрения на заражение коронавирусом, то необходимо взять и проверить дополнительные образцы. Лаборатории также могут рассмотреть вопрос о направлении одного или более отрицательных образцов в зарубежные лаборатории для подтверждения результатов.
Чтобы считать случай лабораторно подтвержденным, должно быть выполнено одно из следующих условий:
- положительный результат ПЦР как минимум для двух разных клеток в геноме БРС-КВ
или
- один положительный результат ПЦР для конкретной клетки в геноме БРС-КВ и дополнительный секвенированный другой ПЦР продукт, подтверждающий принадлежность к известной последовательности БРС-КВ. Случай положительного результата ПЦР для одной конкретной клетки без дальнейшего тестирования, но с динамикой потенциального воздействия и последовательных клинических признаков считается вероятным случаем. ### 5. Серологическое исследование на БРС-КВ Детали двух исследований по иммунофлюоресценции для выявления антител к БРС-КВ были опубликованы в источнике [(5)](#p100087). Данные исследования, наравне с реакцией сывороточной нейтрализации, были использованы в случаях с больными, лечащимися в Немецком госпитале, с высокой чувствительностью и специфичностью [(7)](#p100089).
Также были проведены исследования по выявлению антител к БРС-КВ с использованием технологии белковой микроматрицы, и результаты данных исследований опубликованы в источнике [(8)](#p100090). Они оказались очень индивидуальными. Американские ЦКПЗ разработали двухступенчатый подход к выявлению антител к БРС-КВ, основанный на скрининговом исследовании при помощи рекомбинантного нуклеокапсида (Н) белкового фермент-связанного иммуносорбентного исследования (ELISA), следующего за контрольным тестом с использованием непрямой реакции флюоресцирующих цельно-вирионных антител (IFA) или реакции нейтрализации.
Все серологические тесты, разработанные на сегодняшний день, срабатывали для небольшого количества проб в фазе выздоровления при БРС-КВ, и еще не представлялась возможность сравнить действенность разных методов. В данное время инструменты для проведения серологического теста недоступны.
Рекомендуется при любом положительном результате одинарного серологического исследования подтвердить данные с помощью реакции нейтрализации. Хотя такое оборудование, как ELISA, используемое для исследования проб, может в конечном итоге стать повсеместно используемым в лабораториях множества стран, нейтрализационные исследования все равно необходимо будет проводить в специализированных лабораториях высококвалифицированным персоналом.
На сегодняшний день нет единого мнения об интерпретации результатов серологических тестов у конкретных пациентов. Данные методы были подтверждены с использованием ограниченного количества проб сыворотки крови в фазе выздоровления, поэтому при подтверждении заболевания на основании только этого теста разумно оценивать результаты с осторожностью. Таким образом, на настоящий момент, в случаях, когда исследовательские лаборатории сообщают о положительном серологическом тесте без проведения ПЦР теста или секвенирования, подтверждение вероятного заболевания БРС-КВ наступает только тогда, когда инфекция проявляет себя в других условиях и тестах. Итоговая классификация случаев заболевания будет зависеть от клинической и эпидемиологической информации, объединенной с результатами лабораторных исследований. Процедура определения заболеваемости, разработанная ВОЗ, находится по ссылке: http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/case_definition/en/index.html. Однако серологические тесты могут предоставить ценную информацию об уровне заболеваемости населения, поэтому поддерживается проведение массовых серологических исследований, особенно внутри известных групп риска. Государства - члены ВОЗ и лаборатории, желающие проводить серологическое тестирование для БРС-КВ, должны связаться с институтом, разработавшим вышеизложенные методы, для обсуждения наиболее подходящего решения для соответствия требуемым условиям.
При необходимости ВОЗ может содействовать общению между государствами-членами и специализированными лабораториями. Содействуется дальнейший сбор и тестирование сыворотки крови у людей с подтвержденным диагнозом и у людей, подверженных заболеванию, поскольку это помогает общему пониманию БРС-КВ инфекции, а также развитию методов исследования, существующих на сегодняшний день.
### 6. Реагенты Поскольку основной порядок проб для исследования рвОТ-ПЦР на БРС-КВ опубликован, лаборатории могут заказать реагенты у своих обычных поставщиков. Или лаборатории могут проконсультироваться по ссылке: http://www.virology-bonn.de/index.php?id=40. Положительные контрольные материалы для upE и 1а специфического рвОТ-ПЦР исследования могут быть заказаны на портале Европейского Вирусного Архива: http://www.european-virus-archive.com/Portal/produit.php?ref=1386&id_rubrique=9. Государства-члены, нуждающиеся в помощи при приобретении контрольных материалов для рвОТ-ПЦР исследования, могут обратиться за помощью к ВОЗ. Американские ЦКПЗ произвели диагностический комплект для определения БРС-КВ с помощью рвОТ-ПЦР и сделают его доступным с ограниченными условиями. Более подробную информацию спрашивайте у Декана Д. Эрдмана: (dde1@cdc.gov). ### 7. Глобальная сеть лабораторий
Доступ к своевременным и точным лабораторным тестам для случаев, требующих исследования, - необходимая часть наблюдения при возникновении инфекции. Все страны, желающие провести первичные или подтверждающие исследования, должны иметь доступ к надежному тестированию в национальных или международных лабораториях. ВОЗ может содействовать доступу государств-членов в международные лаборатории, если такая необходимость возникает. Государства-члены могут подписать с международными лабораториями Соглашение на передачу имущества, распространяющее свое действие на такие области отношений, как владение клиническими материалами и правами на интеллектуальную собственность до отправления образцов на обследование.
### 8. Сообщения о случаях заболевания и результаты тестов Лаборатории должны уведомить относящиеся к общественному здоровью власти в своей стране незамедлительно после получения ими образца на БРС-КВ и до проведения любых исследований. Все результаты тестирования, и положительные, и отрицательные, должны быть немедленно сообщены властям. Государствам-членам необходимо незамедлительно уведомить ВОЗ о первично-положительном результате лабораторного исследования, даже до завершения всех исследований и итогового подтверждения. Детали проведения конкретного исследования должны быть включены в уведомительное сообщение. ### 9. Список литературы 1. К. Дростен и др. Клинические особенности и вирусологический анализ случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса. Журнал "Lancet", 2013. Опубликовано в сети Интернет 17 июня. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70154-3 2. Б. Гиери и др. Клинические особенности и диагностирование двух случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса: отчет о внутрибольничном заражении. Журнал "Lancet", 2013. Опубликовано в сети Интернет 29 мая. http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(13)60982-4 3. А. Ассири. Эпидемиологические, демографические и клинические характеристики 47 случаев заболевания Ближневосточным респираторным синдромом коронавируса в Саудовской Аравии: наглядное исследование. Журнал "Lancet", 2013. Опубликовано в сети Интернет 26 июля. http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70204-4 4. В. Корман и др. Выявление нового коронавируса человека в реальном времени методом полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой. Журнал "Eurosurveillance", 2012. 17:20285 http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20285 5. В. Корман и др. Исследования для лабораторного подтверждения заболеваний новым коронавирусом (hCoV-EMC) человека. Журнал "Eurosurveillance", 2012. 17:20334 http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20334 6. С. Ван Богемен и др. Геномная характеристика вновь открытого коронавируса, обусловленного синдромом острой дыхательной недостаточности у людей. Журнал "mBio", 2012. Опубликовано в сети Интернет 20 ноября. 10.1128/mBio.00473-12 7. Ю. Буххолц и др. Контактное изучение случаев заболевания коронавирусом человека у лечащихся в Немецком госпитале. Октябрь-ноябрь 2012. Журнал "Eurosurveillance", 2013. 18:20406. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20406 8. К. Реускен и др. Специфическая серология развивающегося коронавируса человека с использованием протеинового микрочипа. Журнал "Eurosurveillance", 2013. 18:20441. http://www.eurosurveillance.org/ViewArticle.aspx?ArticleId=20441 ---