Определение остаточных количеств гамма-изомера гексахлорциклогексана (ГХЦГ) в присутствии фенотиазина в продуктах животного происхождения методом хроматографии в тонком слое. Методическое указание

(утв. Минздравом СССР 31.07.1973)

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ГАММА-ИЗОМЕРА ГЕКСАХЛОРЦИКЛОГЕКСАНА (ГХЦГ) В ПРИСУТСТВИИ ФЕНОТИАЗИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ

(МЕТОДИЧЕСКОЕ УКАЗАНИЕ)

Гамма-изомер гексахлорциклогексана (ГХЦГ) — пестицид, обладающий широким диапазоном инсектицидного действия. Он эффективен против вредителей садовых, овощных, бобовых и зерновых культур, картофеля, сахарной свеклы, хлопчатника, подсолнечника и др.

Фенотиазин — антигельминт, широко применяющийся в ветеринарии для профилактической дегельминтизации крупного рогатого скота, овец, коз, свиней, а также домашней птицы (кур, гусей, уток). Препарат скармливается животным с пищей.

Краткие сведения о физико-химических свойствах препаратов

    Гамма-изомер  ГХЦГ  обладает  наибольшей  инсектицидной  активностью из
известных   в   настоящее   время  восьми  изомеров  гексахлорциклогексана.
Химически  чистый гамма-изомер ГХЦГ представляет собой бесцветные кристаллы

                                                             5

без запаха с температурой плавления 112 °C, летучестью - 9,8 х 10  мг/л при
20  °C и 750 мм рт. ст. Препарат хорошо растворяется во многих органических
растворителях  (ацетоне,  бензоле, дихлорэтане, ксилоле, метаноле, этаноле,
четыреххлористом  углероде,  хлороформе  и  др.),  а также в жирах и жирных

кислотах. Растворимость его в воде составляет 10 мг/л.

Гамма-изомер ГХЦГ устойчив на воздухе, в воде, на свету и при нагревании. Он не разрушается сильными кислотами, но при действии щелочей отщепляет хлористый водород, образуя трихлорбензолы.

Для использования в сельском хозяйстве выпускаются гранулированные препараты гамма-изомера ГХЦГ 2% и 4%, 50-процентный смачивающийся порошок, 16-процентная минеральномасляная эмульсия; наряду с этим гамма-изомер ГХЦГ входит в состав следующих протравителей: гаммагексана, меркургексана, тигама, фентиурама и меркурана.

Фенотиазин (тиофениламин, дибензоимазин). Химически чистый препарат фенотиазина представляет собой кристаллическое вещество, бесцветное или слегка желтоватое. Температура плавления его 180 — 181 °C. Он хорошо растворяется в ряде органических растворителей (хлороформе, диметилформамиде, бензоле, ацетоне), мало растворим в этаноле, петролейном эфире, практически нерастворим в воде.

Фенотиазин легко окисляется, особенно в присутствии солнечного света и влаги. Такие окислители, как перекись водорода, перманганат калия, гипохлорит калия, хромовый ангидрид, нитрит натрия окисляют фенотиазин до сульфоксидов и сульфонов. При взаимодействии с дымящей азотной кислотой фенотиазин образует динитропроизводные (2, 7-динитрофенотиазин и др.).

Препараты фенотиазина, поступающие в продажу, обычно содержат 1% нетоксичного продукта окисления его зеленого цвета.

Принцип метода

Метод основан на извлечении гамма-изомера ГХЦГ и фенотиазина из пищевого продукта органическими растворителями, удалении мешающих определению примесей путем жидкостного перераспределения с последующей очисткой экстракта на активированной окиси алюминия и хроматографировании в тонком слое силикагеля.

Минимально детектируемое количество гамма-изомера ГХЦГ в хроматографируемом объеме 0,2 мкг, фенотиазина — 0,1 мкг.

Чувствительность метода для гамма-изомера ГХЦГ и фенотиазина — 0,003 мг/пробе или 0,12 мг/кг продукта. Процент определения — 75 — 80.

Применимость метода

Метод предназначен для определения остаточных количеств гамма-изомера ГХЦГ и фенотиазина в говяжьем мясе, курином мясе, яйцах, коровьем молоке.

Реактивы и растворы

н-Гексан, х.ч., перегнанный.

н-Гексан, х.ч., перегнанный, насыщенный диметилформамидом.

Диметилформамид, чистый, насыщенный н-гексаном.

Ацетон, х.ч., перегнанный.

Гексан-ацетон — смесь (2:1).

Натрий сернокислый, ч.д.а., безводный и 2-процентный водный раствор.

Алюминия окись, безводная или 11 степени активности, активированная в течение 4 часов при температуре 600 — 800 °C и деактивированная перед употреблением водой (5% воды от веса окиси алюминия) посредством растирания в ступке.

Диэтиловый эфир, х.ч.

Уксусная кислота ледяная.

Дифениламин — 1-процентный раствор в ацетоне.

Стандартные растворы: гамма-изомера ГХЦГ в гексане — 100 мкг/мл и 10 мкг/мл; фенотиазина в хлороформе — 100 мкг/мл и 10 мкг/мл.

Пластинки для хроматографии «Silufol», производство Чехословакии «Kavalier».

Приборы и посуда

Колбы для экстракции, емкостью 700 — 1000 мл.

Колбы Бунзена, емкостью 300 — 500 мл.

Воронки Бюхнера, диаметром 10 — 12 см.

Воронки делительные, емкостью 150, 500 мл.

Колбы круглодонные, емкостью 50, 150, 250 мл.

Колонка хроматографическая, стеклянная, размером 470 х 10 мм, заполненная следующим образом: в узкий конец колонки помещают ватный тампон и наливают взвесь 10 г деактивированной окиси алюминия в гексане. После осаждения адсорбента и его уплотнения с помощью разрежения, создаваемого вакуумным насосом, насыпают слой безводного сульфата натрия высотой 5 — 6 см и промывают колонку гексаном.

Устройство для удаления растворителей (ротационный испаритель, водоструйный насос и др.).

Пульверизатор стеклянный.

Аппарат для встряхивания.

Микропипетки.

Пипетки Мора.

Источник ультрафиолетового света, ртутно-кварцевая лампа ПРК-4 или ПРК-2.

Подготовка проб для анализа

Мясо (говяжье, куриное). Среднюю пробу весом 0,5 кг измельчают с помощью мясорубки, тщательно перемешивают и берут навеску в 25 г.

Яйцо куриное. Среднюю пробу яиц — 5 - 10 штук, в зависимости от величины партии, освобождают от скорлупы, помещают в химический стакан и тщательно взбалтывают до однородной массы, после чего берут для анализа часть смеси, соответствующую 1/2 яйца.

Подготовленные навески растирают в фарфоровой ступке с безводным сульфатом натрия до образования сыпучей массы. Затем количественно переносят их в колбы для экстракции, заливают 200 мл смеси гексана и ацетона (2:1) и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 30 минут. После этого жидкую фазу сливают и повторяют экстракцию со 100 мл смеси. Полученные экстракты объединяют.

Молоко. Среднюю пробу молока (0,5 л) тщательно перемешивают и аликвот объемом 25 мл помещают в колбу, туда же добавляют 50 мл ацетона, перемешивают и приливают 50 мл гексана. Пробу экстрагируют в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Затем смесь центрифугируют на центрифуге со скоростью 2500 — 4000 об./мин., в результате чего достигается хорошее разделение фаз: верхняя — гексановая, средняя — твердая, белковая и нижняя — водно-ацетоновая. Гексановую фазу с помощью пипетки Мора и резиновой груши осторожно переносят в колбу для удаления растворителя и отгоняют его до объема 5 — 10 мл.

Ход анализа

Объединенные экстракты (яиц и мяса) помещают на 1,5 — 2 часа в морозилку холодильника, а затем фильтруют в колбу Бунзена через воронку Бюхнера с двойным бумажным фильтром, используя водоструйный или вакуумный насос. Колбу дважды ополаскивают порциями охлажденной гексаново-ацетоновой смеси (2:1). Фильтрат количественно переносят в круглодонную колбу и удаляют растворитель до объема 5 — 10 мл.

Очистку экстрактов для всех объектов, включая молоко, проводят посредством жидкостного перераспределения в системе гексан-диметилформамид. Для этого объем экстракта доводят гексаном до 25 мл, переносят в делительную воронку и извлекают из него гамма-изомер ГХЦГ и фенотиазин посредством трехкратного встряхивания экстракта с 10 мл порциями диметилформамида, насыщенного гексаном. Гексановую фракцию отбрасывают и для более полного удаления жира промывают объединенный диметилформамидный экстракт 20 мл гексана, насыщенного диметилформамидом. Затем гексановый слой отбрасывают, а диметилформамидный переносят в другую делительную воронку (0,5 л) с 400 мл 20-процентного водного раствора сульфата натрия, добавляют 10 мл гексана, встряхивают и оставляют на 15 — 20 минут для расслоения. После этого отделяют слой гексана, а водный экстрагируют еще раз 10 мл гексана.

Объединенные гексановые экстракты отгоняют до объема 10 мл и переносят в хроматографическую колонку, заполненную в соответствии с прописью окисью алюминия в тот момент, когда слой гексана над сульфатом натрия имеет высоту не менее 1,0 см. Хроматографирование проводят на первом этапе самотеком. Элюируют гамма-изомер ГХЦГ и фенотиазин 90 мл гексана, который следует вносить в колонку, предварительно ополоснув им колбу, в которой находился экстракт, после того, как высота экстракта над сульфатом натрия не превышает 0,5 — 1,0 см. Для ускорения элюирования можно использовать небольшое разрежение, создаваемое водоструйным или вакуумным насосом. К этому приему следует прибегать не раньше, чем третья порция гексана после экстракции пройдет через колонку.

В дальнейшем ходе анализа из полученного элюата удаляют растворитель досуха. Растворяют сухой остаток в 0,5 мл гексана (используя градуированную пробирку) и наносят аликвот раствора (20, 40, 60, 100 мкл) с помощью микропипетки на пластинку «Silufol», рядом, как обычно, наносят различные количества стандартных растворов гамма-изомера ГХЦГ и фенотиазина.

Пластинку помещают в хроматографическую камеру со смесью гексана:диэтилового эфира:уксусной кислоты = 75:25:2. После поднятия фронта растворителя на 10 — 12 см пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для удаления подвижного растворителя, при этом фенотиазин проявляется в виде четких розовых пятен, которые становятся голубовато-зелеными после опрыскивания пластинки 1-процентным раствором дифениламина в ацетоне и облучения в ультрафиолетовом свете. Гамма-изомер ГХЦГ при этом проявляется в виде темно-синих или темно-серых пятен. Rf гамма-изомера ГХЦГ = 0,36, Rf фенотиазина = 0,18 (для ДДТ Rf = 0,53, для альфа-изомера ГХЦГ Rf = 0,43 при данных условиях).

Количественное определение проводят путем сравнения размера пятна пробы и стандартного раствора, а также по интенсивности окраски пятен. Для фенотиазина это можно сделать на двух этапах: после извлечения пластинки из камеры и после облучения УФ-светом. Для гамма-изомера ГХЦГ — только на конечном этапе, после облучения.

Расчет анализа производят по формуле:

                               А х 1000

Х = --------, В

где:

---