ОФС.1.7.2.0034.15. Общая фармакопейная статья. Определение подлинности аллергенов

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения подлинности (выявления специфических аллергенных компонентов) препаратов аллергенов, представляющих собой водно-солевые экстракты, с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

ОБЩАЯ ЧАСТЬ

Принцип твердофазного иммуноферментного метода анализа изложен в ОФС «Метод иммуноферментного анализа».

Исследуемый препарат сорбируют в лунках полистиролового планшета. На аллергосорбент наносят образцы специфических сывороток крови, содержащие специфические IgE-антитела к данному аллергену. В результате образуется комплекс антиген-антитело (АГ-АТ). К образовавшемуся в лунке планшета комплексу (АГ-АТ) добавляют конъюгат — моноклональные анти-IgE-антитела, меченные пероксидазой, и индикатор — тетраметилбензидин (ТМБ) в субстратном буфере. В лунках планшета с положительной реакцией проявляется цветное окрашивание.

Оптическую плотность растворов в лунках планшета оценивают фотометрическим методом.

Оценку уровня реакции осуществляют по показателям оптической плотности четырех разведений референс-сыворотки (1:1; 1:5; 1:25; 1:50, которые соответствуют 4, 3, 2 и 1 классу специфических IgE-антител.

Учет результатов реакции проводят с помощью референс-системы, состоящей из референс-аллергена (аллерген из пыльцы амброзии) и референс-сыворотки (сыворотка крови больных с содержанием IgE-антител к аллергену из пыльцы амброзии на уровне не менее 4 класса).

АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКИЕ СЫВОРОТКИ (получение и оценка уровня IgE-антител)

Венозную кровь для получения аллергенспецифических сывороток получают от больных, страдающих аллергическими заболеваниями, с положительными кожными пробами, специфичность которых подтверждена. Пробы крови от каждого больного в количестве 10 — 15 мл отбирают в стерильные химические пробирки и помещают на 1 ч в термостат при температуре (36 +/- 1) °C, а затем на 16 — 18 ч в холодильник при температуре от 2 до 8 °C.

Образовавшийся сгусток крови отделяют от стенок пробирок стеклянной палочкой. Сыворотку осторожно отделяют от сгустка. Если в сыворотке присутствуют примеси форменных элементов крови, их удаляют центрифугированием. Полученную сыворотку хранят при температуре от 2 до 8 °C в течение 5 дней или при температуре минус 40 °C до 1 года.

Уровень специфических IgE-антител оценивают с помощью набора реагентов для количественного определения специфических IgE-антител согласно инструкции по применению набора.

Для оценки подлинности препаратов применяют только сыворотки крови, содержащие аллергенспецифические антитела к исследуемым аллергенам на уровне 3 — 4 класса, которые далее используют в качестве положительного контроля.

Примечания

МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ

1. Испытуемый препарат — лекарственная форма аллергена или аллергоида.

2. Референс-аллерген — стандартный образец аллергена из пыльцы амброзии.

3. Референс-сыворотка — сыворотка крови от пациентов с амброзийным поллинозом, имеющая уровень специфических IgE-антител, соответствующий 4 классу.

4. Положительный контроль — аллергенспецифические сыворотки от пациентов с аллергическими заболеваниями, имеющие уровень специфических IgE-антител к исследуемому аллергену, соответствующий 3 — 4 классам.

5. Отрицательный контроль — сыворотка крови, не содержащая аллергенспецифических IgE-антител; также используется для разведения референс-сыворотки.

6. 0,05 М буферный раствор натрия карбоната — буферный раствор для сорбции.

7. Система тетраметилбензидин (ТМБ) — субстрат пероксидазы.

8. Конъюгат — мышиные моноклональные антитела к IgE человека, меченные пероксидазой, концентрированные.

9. Разводящий и промывающий раствор — фосфатно-солевой буферный раствор с твином 20 концентрированный (pH 7,1 — 7,3).

10. Стоп-реагент — 10% раствор серной кислоты.

11. Вода очищенная.

ОБОРУДОВАНИЕ

1. Многоканальный фотометр вертикального сканирования для 96-луночных планшетов с длиной волны 450 нм.

2. Термостат (37 +/- 1) °C.

3. Холодильник (8 +/- 1) °C.

4. Автоматические или электронные дозаторы с переменным объемом (от 50 до 5000 мкл).

5. Прозрачные разборные 96-луночные планшеты с высокими сорбционными свойствами.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ

1. 0,01 М буферный раствор натрия карбоната (pH 9,5). Смешивают 2 мл 0,05 М раствора натрия карбоната с 8 мл воды очищенной. Полученный раствор используют на один планшет для ИФА. Хранят при температуре (8 +/- 1) °C в течение 1 сут.

2. Раствор тетраметилбензидина (ТМБ). Смешивают 2,5 мл ТМБ пероксидазы субстрата с 2,5 мл раствора B пероксидазы субстрата (расходуют на один планшет для ИФА). Раствор готовят за 10 мин до внесения в планшет (хранению не подлежит).

3. Приготовление рабочих растворов реагентов (растворы NN 1 — 2, растворы референс-сыворотки) — приведено в табл. 1.

МЕТОДИКА ОЦЕНКИ ПОДЛИННОСТИ ПРЕПАРАТОВ АЛЛЕРГЕНОВ

Подготовка аллергенов к сорбции. Испытуемый препарат и референс-аллерген амброзии с помощью буферного раствора для сорбции разводят до концентрации белкового азота, равной 1000 +/- 250 PNU/мл.

Сорбция препаратов. Референс-аллерген в объеме 100 мкл вносят в первые два вертикальных ряда планшета. Во все лунки с 3 по 12 вертикальных рядов (стрипов) вносят растворы тестируемых аллергенов (или аллергоидов) в объеме 100 мкл (по 1 стрипу на одну тестируемую серию препарата).

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 16 — 18 ч при температуре (8 +/- 1) °C.

После инкубации содержимое лунок планшета удаляют и промывают 3 раза промывающим и разводящим раствором (по 200 мкл на лунку).

Примечание

Аллергоид тестируется параллельно на одном планшете с одноименным аллергеном. Количество стрипов с аллергеном и аллергоидом должно быть одинаковым. Микст-аллерген/аллергоид тестируется параллельно не менее чем с 3 аллергенами, входящими в его состав.

Методика проведения твердофазного ИФА

1. Во все лунки 1 вертикального ряда (контроль конъюгата) вносят по 100 мкл раствора № 1, в оставшиеся лунки остальных рядов — по 50 мкл этого же раствора.

2. Во 2 ряд вносят по 50 мкл растворов референс-сыворотки: в лунки A, B — раствор A; в лунки C, D — раствор B; в лунки E, F — раствор C; в лунки G, H — раствор D.

3. В оставшиеся ряды вносят по 50 мкл положительного и отрицательного контролей: в лунки A — F - одноименные положительные сыворотки к тестируемому препарату, в лунки G, H — сыворотку крови, не содержащую аллергенспецифических IgE-антител (отрицательный контроль).

4. Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 1 ч.

5. После инкубации жидкость из лунок удаляют и в каждую лунку вносят по 200 мкл рабочего раствора № 1 (промывающий и разводящий раствор) на 2 — 3 мин, после чего жидкость вновь удаляют. Процедуру отмывки повторяют не менее 3 раз.

6. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора № 2 (конъюгат) и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 1 ч.

8. Во все лунки планшета вносят по 50 мкл раствора ТМБ. Планшет помещают в темное место и выдерживают в течение 15 — 20 мин при температуре (23 +/- 2) °C.

9. Реакцию останавливают добавлением по 25 мкл стоп-реагента во все лунки и проводят учет результатов. В лунках, где прошла реакция, появится окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого ряда (контроль конъюгата) должны оставаться неокрашенными.

УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов проводят фотометрически при длине волны 450 нм в в течение 10 мин после остановки реакции. Вычисляют средние арифметические показателей оптической плотности (ОП) одноименных лунок.

Критерии приемлемости результатов:

• среднее значение показателей ОП в лунках с контролем конъюгата (КК) не превышает 0,10 (визуально окрашивания лунок не видно);
• среднее значение показателей ОП в лунках с референс-сывороткой без разведения (A) больше 1,0, но меньше 2,5;
• соотношение средних показателей ОП с разведениями референс-сыворотки (растворы A, B, C, D) следующие: ОП раствора A > ОП раствора B > ОП раствора C > ОП раствора D;
• среднее значение показателей ОП раствора D в 1,5 — 2,0 раза больше среднего значения показателей ОП отрицательного контроля.

Рассчитывают уровень специфических IgE-антител в аллергенспецифических сыворотках (положительный контроль) (табл. 2).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Аллерген следует считать подлинным (выявлены специфические аллергенные компоненты), если уровень IgE-антител в специфической сыворотке (положительный контроль) будет не менее 2 класса.

Аллергоид (модифицированный аллерген) следует считать подлинным (выявлены специфические аллергенные компоненты), если уровень IgE-антител в специфической сыворотке (положительный контроль) будет не менее 1 класса.

Пример: оценка подлинности аллергена из пыльцы полыни горькой и аллергоида пыльцевого полыни горькой.

Тестируемые препараты:

• аллерген из пыльцы полыни горькой (10000 PNU/мл);
• аллергоид пыльцевой полыни горькой (10000 PNU/мл).

Контрольные сыворотки:

• положительный контроль — сыворотка крови, содержащая специфические IgE-антитела к аллергену из пыльцы полыни горькой (уровень антител 3 класс);
• отрицательный контроль — сыворотка крови, не содержащая специфических IgE-антител к пыльце растений.

Последовательность проведения анализа

Приготовление рабочих растворов (раздел «Приготовление растворов»).

Аллерген из пыльцы полыни, аллергоид пыльцевой полыни горькой и референс-аллерген амброзии с помощью буферного раствора для сорбции разводят до концентрации белкового азота, равной 1000 +/- 250 PNU/мл.

Референс-аллерген в объеме 100 мкл вносят в первые два вертикальных ряда планшета. В лунки вертикального ряда 3 вносят раствор аллергена из пыльцы полыни в объеме 100 мкл, ряда 4 вносят раствор аллергоида пыльцевого полыни в объеме 100 мкл (схема заполнения планшета приведена в табл. 3).

Таблица 3

Примечание: 1, 2, 3, 4 — ряды лунок планшета;

КК — контроль конъюгата — «холостая» проба;

A, B, C, D — растворы референс-сыворотки;

АС — аллергенспецифическая сыворотка (положительный контроль);

ОС — отрицательная сыворотка (отрицательный контроль).

Планшет закрывают крышкой и инкубируют 16 — 18 ч при температуре (8 +/- 1) °C в холодильнике.

Во все лунки 1 вертикального ряда (контроль конъюгата) вносят по 100 мкл раствора № 1, в оставшиеся лунки остальных рядов — по 50 мкл этого же раствора.

Во 2 ряд вносят по 50 мкл растворов референс-сыворотки: в лунки A, B — раствор A; в лунки C, D — раствор B; в лунки E, F — раствор C; в лунки G, H — раствор D.

В ряды 3 и 4 вносят по 50 мкл положительного и отрицательного контроля: в лунки A — F - аллергенспецифическая сыворотка (АС), содержащая 3 класс IgE-антител к аллергену полыни, в лунки G, H — не содержащую IgE-антител сыворотку.

Планшет закрывают крышкой и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 1 ч.

По истечении времени инкубации жидкость из лунок удаляют в емкость с дезинфицирующим раствором. В каждую лунку вносят по 200 мкл раствора № 1 на 2 — 3 мин, после чего жидкость вновь удаляют. Процедуру отмывки повторяют не менее 3 раз.

В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего раствора № 2 (конъюгат) и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C на 1 ч.

Отмывку планшета проводят согласно п. 6, повторив процедуру не менее 5 раз.

Во все лунки планшета вносят по 50 мкл раствора ТМБ. Планшет помещают в темное место и выдерживают в течение 15 — 20 мин при температуре (23 +/- 2) °C.

Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента по 25 мкл во все лунки и проводят учет результатов. Время между остановкой реакции и учетом результатов не должно превышать 10 мин.

В лунках, в которых прошла реакция, должно появиться окрашивание разной степени интенсивности. Лунки первого ряда (контроль конъюгата) должны оставаться неокрашенными.

Результаты анализа