ОФС.1.2.2.2.0031. Общая фармакопейная статья. Примеси N-нитрозаминов

Министерство здравоохранения Российской Федерации · № ОФС.1.2.2.2.0031Действующий акт

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XV издание)»

Примечание

Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте https://minzdrav.gov.ru/ по состоянию на 15.08.2023. В соответствии с Приказом Минздрава России от 20.07.2023 № 377 данный документ введен в действие с 01.09.2023.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Примеси N-нитрозаминов	ОФС.1.2.2.2.0031
	Вводится впервые

Методики определения примесей N-нитрозаминов в фармацевтических субстанциях синтетического происхождения группы сартана основаны на использовании масс-спектрометрии.

N-нитрозамины — это класс органических веществ, молекулы которых содержат алкилнитрозаминогруппу:

рис. 1

Соединения N-нитрозаминов классифицируются как вероятные канцерогены для человека. В силу потенциальной токсичности этих примесей рекомендуется применять меры по контролю и ограничению их присутствия в фармацевтических субстанциях.

Целесообразность определения примесей N-нитрозаминов в лекарственных препаратах устанавливается на этапе фармацевтической разработки.

Особое значение имеют соединения, приведенные в таблице 1.

Химическое название	Брутто-формула	Молекулярная масса
N-нитрозо-диметиламин	C₂H₆N₂O	74,082
N-нитрозо-диэтиламин	C₄H₁₀N₂O	102,135
N-нитрозо-дибутиламин	C₈H₁₈N₂O	158,241
N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановая кислота	C₅H₁₀N₂O	143,145
N-нитрозо-диизопропиламин	C₆H₁₄N₂O	130,188
N-нитрозо-этил-изопропиламин	C₅H₁₂N₂O	116,162
N-нитрозо-дипропиламин	C₆H₁₄N₂O	130,188
N-нитрозо-метил-фениламин	C₇H₈N₂O	136,151

Нормы содержания примесей N-нитрозаминов должны быть приведены в фармакопейной статье. В случае их отсутствия нормы содержания должны быть рассчитаны с использованием значений максимально допустимой суточной дозы примесей указанных веществ (табл. 2).

Таблица 2

Максимально допустимая суточная доза примесей N-нитрозаминов

Наименование примеси	Допустимая суточная доза, нг/сут
N-нитрозо-диметиламин (НДМА)	не более 96,0
N-нитрозо-диэтиламин (НДЭА)	не более 26,5
N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановая кислота (НМАК)	не более 96,0
N-нитрозо-диизопропиламин (НДИПА)	не более 26,5
N-нитрозо-этил-изопропиламин (НЭИПА)	не более 26,5

К наиболее вероятным причинам образования примесей N-нитрозаминов в лекарственных средствах относятся:

использование натрия нитрита или других нитрозирующих соединений в синтезе фармацевтической субстанции.

Например:

рис. 10

использование загрязненных сырьевых материалов (растворителей, реагентов и катализаторов) в синтезе фармацевтической субстанции;
регенерация растворителей, реагентов и катализаторов в процессе синтеза;
использование контаминированных исходных материалов;
контаминация от перекрестно протекающих процессов синтеза;
деградация исходных материалов, промежуточных продуктов или лекарственных веществ, в том числе при хранении;
использование определенных видов упаковки (например, возможна контаминация лекарственного препарата в его первичной упаковке; в контурной ячейковой упаковке (блистере), так как покрывающая фольга, содержащая нитроцеллюлозный праймер, способна реагировать с аминами в чернилах с образованием нитрозаминов, которые могут быть перенесены в препарат при определенных условиях упаковки).

Определение N-нитрозаминов проводят приведенными ниже методиками или иными методиками, указанными в фармакопейной статье.

Методика 1

Методика распространяется на определение семи примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА), N-нитрозо-дибутиламина (НДБА), N-нитрозо-метил-фениламина (НМФА) и N-нитрозо-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»).

Подвижная фаза А (ПФА). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл воды и доводят объем раствора водой до метки.

Подвижная фаза Б (ПФБ). В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 10 мл муравьиной кислоты безводной, прибавляют 500 мл метанола и доводят объем раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 5 мл помещают 0,1 г (точная навеска) субстанции, прибавляют 4 мл метанола, интенсивно перемешивают до растворения, доводят объем раствора метанолом до метки и фильтруют через шприцевой мембранный фильтр из поливинилиденфторида с размером пор 0,22 мкм, отбрасывая первый 1 мл фильтрата.

Стандартный раствор примесей N-нитрозамина. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в метаноле с концентрацией по 6 нг/мл.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, НМФА в метаноле с концентрацией по 1 нг/мл.

Хроматографические условия

Колонка	100 x 4,6 мм, силикагель пентафторфенилпропильный, эндкепированный, для хроматографии, 2,6 мкм;
Температура колонки	40 °C;
Температура образца	4 °C;
Скорость потока	0,6 мл/мин;
Объем пробы	3 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0 — 1,5	90	10
1,5 — 7,0	90 \rightarrow 45	10 \rightarrow 55
7,0 — 17,0	45	55
17,0 — 17,1	45 \rightarrow 10	55 \rightarrow 90
17,1 — 21,0	10	90
21,0 — 21,1	10 \rightarrow 90	90 \rightarrow 10
21,1 — 25,0	90	10

Условия детектирования

Источник ионизации				электронная ионизация
Примесь	НДМА	НМАК	НДЭА		НЭИПА	НДИПА	НМФА	НДБА
Режим сканирования	SIM	SIM	PRM		SIM	SIM	SIM	PRM
Полярность	+	-	+		+	+	+	+
Начало-окончание сканирования, мин	1,0 — 3,5	3,5 — 5,5	5,5 — 7,0		7,0 — 8,5	8,5 — 10	8,5 — 10	13,0 — 15,5
Величина m/z (PRM)	-	-	103,0866		-	-	-	159,1492
Нормализованная энергия столкновения	-	-	25		-	-	-	20
Диапазон сканирования	m/z	m/z	m/z		m/z	m/z	m/z	m/z
Диапазон сканирования	74,3 — 75,8	144,3 — 145,8	50,0 — 114,0		116,4 — 117,9	130,4 — 131,9	136,3 — 137,8	50,0 — 170,0
Микросканирования	3	3	3		3	3	3	3
Разрешение	30000	60000	30000		60000	60000	60000	60000
Автоматический контроль усиления (%)	250	250	250		250	250	250	250

Хроматографируют раствор для проверки чувствительности хроматографической системы, стандартный раствор и испытуемый раствор.

Относительное время удерживания соединений: НДБА — 1,0 (около 14,2 мин); НДМА — около 0,20; НМАК — около 0,31, НДЭА — около 0,46; НЭИПА — около 0,57; НДИПА — около 0,66; НМФА — около 0,67.

Пригодность ВЭЖХ-МС системы

На хроматограмме стандартного раствора относительное стандартное отклонение площади каждого из пиков примесей N-нитрозаминов должно быть не более 20,0% (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей N-нитрозаминов должно быть не менее 10.

Обработка результатов

Для количественного определения используются площади пиков целевых ионов с допуском m/z 15 ppm. Ниже перечислены целевые значения m/z:

Примесь	НДМА	НМАК	НДЭА	НЭИПА	НДИПА	НМФА	НДБА
Целевое значение m/z	75,0553	145,0619	75,0553, 103,0866	117,1022	131,1179	137,0709	57,0704, 103,0872, 159,1492

Примечание - Примеси НМАК и НЭИПА существуют как синконформационный и антиконформационный изомеры из-за ограниченного вращения связи N-N. Эти изомеры в условиях метода разделяются частично. Пик НМАК наблюдается как дублет, для расчета концентрации НМАК интегрируют оба пика и используют суммарную площадь. Пик НЭИПА может быть как дублетом, так и одиночным пиком с хвостовым плечом. Если конформеры разделяются, для расчета концентрации НЭИПА интегрируют оба пика и суммируют их площади, если же конформеры разделены не полностью (наблюдается полупик), для расчета концентрации НЭИПА интегрируют основной пик и полупик как единый.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{1} \cdot C_{0} \cdot P}{S_{0} \cdot C_{1}} ,

где S1 — площадь пика каждой из примесей N-нитрозаминов на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - площадь пика соответствующей примеси N-нитрозаминов на хроматограмме стандартного раствора;

C1 — концентрация субстанции в испытуемом растворе, нг/мл;

C0 — концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДБА, НМАК, НДИПА, НЭИПА и НМФА в стандартном растворе, нг/мл;

P — содержание основного вещества в стандартном образце соответствующей примеси, %.

Методика 2

Методика распространяется на определение четырех примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане, лозартане калия, олмесартане медоксомиле, кандесартане цилексетиле и телмисартане: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА) и N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА).

Определение проводят методом ГХ (парофазный анализ, ОФС «Газовая хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»).

Раствор внутреннего стандарта А. Готовят раствор N-нитрозо-диметиламина-d6 в метаноле с концентрацией 0,4 мкг/мл.

Раствор внутреннего стандарта Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Испытуемый раствор. В хроматографический флакон для парофазного анализа помещают 0,2 г (точная навеска) субстанции, 0,1 г имидазола, 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Стандартный раствор А. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в метаноле с концентрацией по 0,4 мкг/мл.

Стандартный раствор Б. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 2,0 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор В. Помещают 1,0 мл стандартного раствора Б во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы А. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,5 мл стандартного раствора А и 2,0 мл раствора внутреннего стандарта А и доводят объем раствора метанолом до метки.

Раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б. Во флакон для парофазного анализа, содержащий 0,1 г имидазола и 1,0 мл ацетонитрила, помещают 1,0 мл раствора для проверки чувствительности хроматографической системы А. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Контрольный раствор. В хроматографический флакон помещают около 0,1 г (точная навеска) имидазола, прибавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта Б и 1,0 мл ацетонитрила. Укупоривают пробкой, закрывают крышкой и плотно прижимают их обкаткой.

Хроматографические условия

Колонка	кварцевая капиллярная 30 м x 0,32 мм, покрытая слоем макрогола 20 000, 1,0 мкм;
Детектор	масс-спектрометрический;
Газ-носитель	гелий для хроматографии;
Деление потока	1:1 или 1:3;
Скорость потока	1,8 мл/мин;
Температура	колонка	0 — 3 мин	45 °C
		3 — 10 мин	45 \rightarrow 130^{\circ}C
		10 мин	190 \rightarrow 240^{\circ}C

Условия парофазного анализа

Температура уравновешивания	95 — 110 °C;
Время уравновешивания	10 мин;
Температура петли	150 °C;
Температура линии переноса	160 °C.

Условия детектирования

Источник ионизации	электронная ионизация (EI);
Режим детектирования	мониторинг реакций заданных ионов (MRM).

Переходы сканирования масс и энергии столкновений

Наименование примеси	Относительное время удерживания	Переходы сканирования масс	Энергия столкновений, эВ
НДМА	около 0,8	74 \rightarrow 44	4
НДМА	около 0,8	74 \rightarrow 42	15
НДМА-d6	около 0,8	80 \rightarrow 50	5
НДЭА	около 0,9	102 \rightarrow 85,1	6
НДЭА	около 0,9	102 \rightarrow 56,1	15
НЭИПА	около 0,96	116 \rightarrow 99,1	6
НЭИПА	около 0,96	99 \rightarrow 44,1	9
НДИПА	1 (около 14 мин)	130 \rightarrow 42	10
НДИПА	1 (около 14 мин)	130 \rightarrow 43,1	18

Хроматографируют контрольный раствор, стандартный раствор В, раствор для проверки чувствительности хроматографической системы Б и испытуемый раствор.

Пригодность ГХ-МС системы

На хроматограмме стандартного раствора В относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА к площади пика НДМА-d6 должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме раствора для проверки чувствительности отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА НЭИПА и НДИПА должно быть не менее 10.

Содержание каждой из примесей N-нитрозаминов в субстанции в процентах (X) вычисляют по формуле:

X = \frac{B_{1} \cdot C_{0} \cdot P}{B_{0} \cdot C_{1}} ,

где B1 — отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозо-диметиламина-d6 на хроматограмме испытуемого раствора;

B₀ - отношение площади пика каждой из примесей N-нитрозаминов к площади пика N-нитрозо-диметиламина-d₆ на хроматограмме стандартного раствора В;

C1 — концентрация субстанции в испытуемом растворе, нг/мл;

C0 — концентрация каждой из примеси НДМА, НДЭА, НДИПА и НЭИП в стандартном растворе В, нг/мл;

P — содержание основного вещества в соответствующем образце примеси, %.

Методика 3

Методика распространяется на определение пяти примесей N-нитрозаминов в валсартане, ирбесартане и лозартане калия, кандесартане цилексетиле и олмесартане медоксомиле: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА) и N-нитро-N-метил-4-аминобутановой кислоты (НМАК).

Определение проводят методом ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»)

Подвижная фаза А (ПФА). Муравьиной кислоты раствор 0,1%.

Подвижная фаза Б (ПФБ). Метанол.

Раствор внутреннего стандарта. Готовят раствор НДЭА-d10 в метаноле с концентрацией 9,0 нг/мл.

Испытуемый раствор. Суспендируют 0,150 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл метанола, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора метанолом до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора метанолом до метки.

Стандартный раствор А. Суспендируют около 0,15 г (точная навеска) субстанции в 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, прибавляют 0,5 мл раствора внутреннего стандарта и тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Стандартный раствор Б. Смешивают 0,5 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов и 0,5 мл раствора внутреннего стандарта, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры, прибавляют 4,0 мл воды, тщательно перемешивают в течение 5 мин, выдерживают на ультразвуковой бане в течение 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 g, фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм.

Хроматографические условия

Колонка	150 x 4,6 мм, силикагель октадецилсилильный, эндкепированный для хроматографии, 3,0 мкм;
Температура колонки	40 °C;
Температура образца	5 °C;
Скорость потока	0,5 мл/мин;
Объем пробы	20 мкл.

Режим хроматографирования

Время, мин	ПФА, %	ПФБ, %
0 — 1,0	80	20
1,0 — 6,0	80 \rightarrow 55	20 \rightarrow 45
6,0 — 14,0	55	45
14,0 — 16,0	55 \rightarrow 5	45 \rightarrow 95
16,0 — 35,0	5	95

Детектирование: трехквадрупольный масс-спектрометр в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Следующие настройки были признаны подходящими и приведены в качестве примера; настройки могут быть скорректированы таким образом, чтобы выполнялись требования пригодности системы.

Условия МС/МС

Режим ионизации	APCI-положительный;
Температура нагревателя	350 °C;
Давление в распылителе	310 кПа;
Температура газа:	300 °C;
Расход осушающего газа	5 л/мин;
Ток в короне	6 мкА;
Время выдержки	200 мс;
Напряжение в капилляре (Vкап):	1,5 кВ;
Напряжение ускорения ячейки:	3 В.

Параметры режима MRM

Наименование примеси	Относительное время удерживания	Переходы MRM (m/z)	Энергия столкновений, В	Напряжение фрагментора, В
НДМА	около 0,6	74 \rightarrow 58	11	20
НДМА	около 0,6	(75 \rightarrow 43)	15	15
НМАК	около 0,7	147 \rightarrow 117	2	41
НМАК	около 0,7	(147 \rightarrow 87)	6	46
НДЭА	около 1	103 \rightarrow 75	9	25
НДЭА	около 1	(103 \rightarrow 47)	17	20
НЭИПА	около 1,3	117 \rightarrow 75	7	54
НЭИПА	около 1,3	(117 \rightarrow 47)	15	59
НДИПА	около 1,6	131 \rightarrow 89	2	20
НДИПА	около 1,6	(131 \rightarrow 47)	10	25
НДЭА-d10	1	113 \rightarrow 81	6	76
НДЭА-d10	(около 8,6 мин)	(117 \rightarrow 75)	14	81

Хроматографируют стандартный раствор Б, стандартный раствор А, испытуемый раствор.

Пригодность хроматографической системы

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА и НЭИПА к площади пика НДЭА-d10 должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме стандартного раствора А:

отношение сигнал/шум (S/N) для пика НДМА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 5;
отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;
отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НМАК, НДИПА, НЭИПА, соответствующего переходу классификатора, должно быть не менее 3.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (B1).

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора А (B0).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение B₁/B₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20% от того же соотношения, рассчитанного для стандартного раствора А.

Методика 4

Методика распространяется на определение шести примесей N-нитрозаминов: N-нитрозо-диметиламина (НДМА), N-нитрозо-диэтиламина (НДЭА), N-нитрозо-этил-изопропиламина (НЭИПА), N-нитрозо-диизопропиламина (НДИПА), N-нитрозо-дибутиламина (НДБА) и N-нитрозо-дипропиламина (НДПА).

Определение проводят методом ГХ (ОФС «Газовая хроматография») с использованием масс-спектрометрии (ОФС «Масс-спектрометрия»).

Раствор внутреннего стандарта. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 5 мг (точная навеска) НЭМА (N-нитрозо-этилметиламина, 10595-95-6), растворяют в метаноле и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,5 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.

Раствор для экстракции. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 40,0 мг натрия гидроксида, растворяют в 500 мл воды, прибавляют 100 мкл раствора внутреннего стандарта и 50 мл ацетонитрила и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор. В мерную колбу вместимостью 10 мл помещают 0,25 г (точная навеска) субстанции, суспендируют в растворе для экстракции и доводят объем раствора тем же растворителем до метки, встряхивают в течение 5 мин, экстрагируют 2 мл метиленхлорида, встряхивая в течение 5 мин и центрифугируя в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор примесей N-нитрозаминов. Готовят раствор фармакопейных стандартных образцов НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА в метаноле с концентрацией по 500 мкг/мл. В мерную колбу 10 мл помещают 100 мкл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 20 мл помещают 0,3 мл полученного раствора и доводят объем раствора водой до метки.

Испытуемый раствор с добавками. Суспендируют 0,25 г субстанции в 10 мл раствора для экстракции, прибавляют 0,1 мл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют с помощью 2 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор А. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 50 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор Б. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 100 мкл стандартный раствор примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Стандартный раствор В. К 10 мл раствора для экстракции прибавляют 200 мкл стандартного раствора примесей N-нитрозаминов, интенсивно перемешивают в течение 5 мин, экстрагируют 2,0 мл метиленхлорида и встряхивают в течение 5 мин, центрифугируют в течение 5 мин при 10 000 g. Для анализа используют нижний слой (органический).

Хроматографические условия

Колонка	кварцевая капиллярная 30 м x 0,25 мм, покрытая слоем поли(цианопропилфенил)(6)(метил)(94)силоксана, 1,4 мкм;
Детектор	масс-спектрометрический;
Газ-носитель	гелий для хроматографии;
Скорость потока	1,3 мл/мин;
Объем пробы	3 мкл;
Температура	колонка	0 — 0,5 мин	40 °C
		0,5 — 2,2 мин	40 \rightarrow 140^{\circ}C
		2,2 — 4,2 мин	140 °C
		4,2 — 6,2 мин	140 \rightarrow 180^{\circ}C
		6,2 — 6,7 мин	180 °C
		6,7 — 8,7 мин	180 \rightarrow 240^{\circ}C
		8,7 — 10,5	240 °C
		10,5 — 11,5	240 \rightarrow 280^{\circ}C
		11,5 — 14,0	280 °C
	Инжектор		250 °C
	Линия переноса		240

Условия детектирования

Источник ионизации	электронная ионизация;
Режим детектирования	мониторинг реакций заданных ионов (MRM);
Температура источников ионов	230 °C;
Температура квадруполя	150 °C;
Энергия электронов	40 эВ;
Задержка растворителя	4,5 мин;
Коэффициент усиления	15
Газ для соударений	азот;
Скорость потока газа для соударений	1,5 мл/мин;
Газ для охлаждения	гелий.

Переходы сканирования масс и энергии столкновений

Компонент	Относительное время удерживания	Переходы сканирования масс	Энергия столкновений, эВ
НДМА	около 0,9	74 \rightarrow 44	5
НДМА	около 0,9	(74 \rightarrow 42)	22
НЭМА	1 (около 5,50 мин)	88 \rightarrow 71	5
НДЭА	около 1,1	102 \rightarrow 75	3
НДЭА	около 1,1	(102 \rightarrow 56)	19
НЭИПА	около 1,3	116 \rightarrow 99	5
НЭИПА	около 1,3	(116 \rightarrow 44)	14
НДИПА	около 1,4	130 \rightarrow 88	5
НДИПА	около 1,4	(130 \rightarrow 71)	14
НДПА	около 1,5	130 \rightarrow 113	1
НДПА	около 1,5	(130 \rightarrow 88)	1
НДБА	около 1,8	158 \rightarrow 141	1
НДБА	около 1,8	(158 \rightarrow 99)	7

Хроматографируют стандартный раствор А, стандартный раствор Б, стандартный раствор В и испытуемый раствор.

Пригодность ГХ-МС системы

Пригодность хроматографической системы

На хроматограмме стандартного раствора Б относительное стандартное отклонение отношения площади каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА к площади пика внутреннего стандарта должно быть не более 20% (6 введений).

На хроматограмме испытуемого раствора с добавками:

отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;
отношение сигнал/шум (S/N) для каждого из пиков примесей НДМА, НДЭА, НДБА, НДПА, НДИПА и НЭИПА, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Для расчета содержания используют основные MRM-переходы.

Рассчитывают отношения площади пика каждой примеси N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора с добавками (B0).

Для каждой обнаруженной примеси N-нитрозамина отношение B₁/B₀ должно быть менее 0,50.

Испытание действительно, если соотношение между площадью пика, соответствующего основному переходу, и площадью пика, соответствующего квалификационному переходу, для испытуемого раствора отличается не более чем на 20% от того же соотношения, рассчитанного для раствора с добавками.

Для расчета содержания используют основные MRM-переходы.

Количественное определение примесей

Хроматографируют по 3 мкл раствора с добавками, испытуемого раствора и стандартных растворов А, Б и В.

Пригодность хроматографической системы

Для каждого N-нитрозамина:

относительное стандартное отклонение отношения площади пика каждого нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта на хроматограмме стандартного раствора Б не должно превышать 20% (6 введений);
отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего основному переходу, должно быть не менее 10;
отношение сигнал/шум (S/N) для пика, соответствующего переходу квалификатора, должно быть не менее 3.

Расчет: используют основные MRM-переходы.

Строят калибровочную кривую зависимости отношения площади пика каждого N-нитрозамина к площади пика внутреннего стандарта в зависимости от концентрации N-нитрозамина на хроматограммах стандартных растворов А, Б и В. По полученной калибровочной кривой определяют концентрацию N-нитрозамина в испытуемом растворе.

Пригодность системы:

отношение площади пика, соответствующего основному переходу, к площади пика, соответствующего переходу квалификатора, для испытуемого раствора не должно отличаться от того же отношения для раствора с добавками более чем на 20%;
рассчитанное извлечение для всех растворов с добавками должно составлять от 70 до 130%.