ОФС.1.2.1.0028.18. Общая фармакопейная статья. Молекулярно-массовое распределение декстранов

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том I»)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Молекулярно-массовое распределение декстранов	ОФС.1.2.1.0028.18 Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод изучения молекулярно-массового распределения и определения средней молекулярной массы декстранов 40, 60 и 70. Определение проводят методом гель-фильтрационной хроматографии в соответствии с ОФС «Эксклюзионная хроматография» и согласно условиям, описанным ниже.

Методика

Испытуемый раствор. Раствор испытуемого декстрана в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Маркерный раствор для определения рабочего объема колонки. 5 мг глюкозы и 2 мг CO высокомолекулярного декстрана (Mw ~= 2000 кДа) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Калибровочные растворы. Из отдельных навесок CO декстранов для калибровки с различными молекулярными массами готовят серию калибровочных растворов в подвижной фазе (концентрация декстрана 20 мг/мл), соответствующих калибровочному диапазону для среднемассовой молекулярной массы от 4 до 250 — 270 кДа. Серия калибровочных растворов должна включать в себя не менее 5 растворов, приготовленных с использованием узкодисперсных CO декстранов для калибровки, охарактеризованных по значениям среднемассовой молекулярной массы (Mw) и массы, соответствующей максимуму хроматографического пика (Mмакс., Mp).

Раствор для проверки пригодности системы. Раствор CO декстрана 40 для проверки пригодности системы, или CO декстрана 60/70 для проверки пригодности системы, или CO декстрана 70 для проверки пригодности системы (в соответствии с испытуемым декстраном) в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Условия хроматографического анализа.

Подвижная фаза: 7,1 г/л (50 мМ) раствор натрия сульфата безводного в воде с добавкой 0,2 г/л (0,02%) натрия азида.

Детектирование: дифференциальное рефрактометрическое.

Температура оптического блока детектора: 40 °C.

Хроматографические колонки: три последовательно соединенные хроматографические колонки (длина 300 мм, внутренний диаметр 7,5 — 8 мм), заполненные частицами гидроксилированного полиметакрилата (7 — 17 мкм): две колонки, заполненные частицами диаметром 10 — 17 мкм (размер пор 1000Е ; предел эксклюзии, определенный по декстрану, ~= 2500 — 4000 кДа), одна колонка, заполненная частицами диаметром 7 — 17 мкм (размер пор 200Е ; предел эксклюзии, определенный по декстрану, ~= 60 — 100 кДа).

Скорость потока подвижной фазы: 0,5 — 1,0 мл/мин.

Температура колонок: 25 °C.

Объем вводимой пробы: 50 — 100 мкл.

Время хроматографирования: в 1,1 раза больше времени удерживания пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки.

Калибровка системы

Хроматографируют маркерный раствор для определения рабочего объема колонки, получая не менее 3 последовательных хроматограмм. На хроматограмме должны присутствовать два основных пика: первый пик соответствует высокомолекулярному декстрану, второй пик соответствует глюкозе. Объем элюирования пика высокомолекулярного декстрана (определенный в вершине пика) соответствует «мертвому» объему колонки (V0), а объем элюирования пика глюкозы соответствует полному объему элюента в колонке (Vt).

Хроматографируют каждый из калибровочных растворов. На каждой полученной хроматограмме аккуратно интегрируют пик декстрана. Каждый пик декстрана, а также пик глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки, делят равноудаленными перпендикулярами на p частей (p >= 60), соответствующих равным объемам элюирования. Разбиение пиков на части и все последующие расчеты молекулярно-массового распределения, согласно представленному ниже алгоритму, выполняют, используя специализированное программное обеспечение в автоматическом режиме.

Для каждой i-ой части пика (i \in [1,p]) , соответствующей объему элюирования Vi, измеряют высоту (yi) от базовой линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения (Ki) по формуле (1):

K_{i} = \frac{V_{i} - V_{0}}{V_{t} - V_{0}} , (1)

где V0 — «мертвый» объем (предел эксклюзии) колонки, определенный по пику высокомолекулярного декстрана на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

Vt — полный объем элюента в колонке, определенный по пику глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

Vi — объем элюирования i-ой части пика декстрана на хроматограммах каждого из калибровочных растворов (или i-ой части пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки).

Аналогичным образом для пиков каждого из калибровочных декстранов и глюкозы по формуле (1) рассчитывают коэффициент распределения Kмакс., соответствующий вершине пика. Используя подходящее программное обеспечение строят зависимость полученных значений Kмакс. (ось абсцисс) от заявленной молекулярной массы в максимуме пика (Mмакс.) каждого из декстранов, использованных для калибровки, и глюкозы (ось ординат). Полученную зависимость аппроксимируют уравнением вида (2). Используя значения Ki, рассчитанные по уравнению (1) для соответствующих частей пиков калибровочных декстранов и глюкозы, вычисляют значения Mi, а затем, значения Mw по уравнениям (2) и (3).

M_{i} = b_{5} + e^{(b_{4} + b_{1}K_{i} + b_{2}K_{i}^{2} + b_{3}K_{i}^{3})} , (2)

\overline{M_{w}} = \frac{\sum_{i} {}_{= 1}^{p}y_{i}M_{i}}{\sum_{i} {}_{= 1}^{p}y_{i}} , (3)

где p — число частей, на которые поделен хроматографический пик;

yi — высота i-ой части пика над базовой линией;

Mi — молекулярная масса i-ой части пика;

\overline{M_{w}} — расчетное значение среднемассовой молекулярной массы.

Рассчитанные значения \overline{M_{w}} для калибровочных декстранов и глюкозы сравнивают с паспортными значениями. При необходимости, используя подходящие программное обеспечение и алгоритм аппроксимации калибровочной кривой нелинейным методом наименьших квадратов (например, методом Гаусса-Ньютона), выполняют итерационный подбор коэффициентов b1 — b5 в уравнении (2), добиваясь выполнения условий пригодности калибровки (см. раздел «Проверка пригодности системы и калибровки»).

Проверка пригодности системы и калибровки

Хроматографируют раствор для проверки пригодности системы и рассчитывают значение среднемассовой молекулярной массы декстрана по уравнениям (2) и (3), как описано выше.

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% высокомолекулярной фракции декстрана по уравнению (4):

\overline{M_{w}} = \frac{\sum_{i}^{n} {}_{= 1}y_{i}M_{i}}{\sum_{i}^{n} {}_{= 1}y_{i}} , где (4)

n определяется из выражений (5) и (6):

\sum_{i = 1}^{n} y_{i} \leq 0.1 \sum_{i = 1}^{p} y_{i} , (5)

\sum_{i = 1}^{n + 1} y_{i}>0.1 \sum_{i = 1}^{p} y_{i} , (6)

где p — число частей, на которые поделен хроматографический пик;

yi — высота i части пика над базовой линией;

Mi — молекулярная масса i части пика.

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% низкомолекулярной фракции декстрана по уравнению (7):

\overline{M_{w}} = \frac{\sum_{i} {}_{= m}^{p}y_{i}M_{i}}{\sum_{i} {}_{= m}^{p}y_{i}} , где (7)

n определяется из выражений (8) и (9):

\sum_{i = m}^{p} y_{i} \leq 0.1 \sum_{i = 1}^{p} y_{i} , (8)

\sum_{i = m - 1}^{p} y_{i}>0.1 \sum_{i = 1}^{p} y_{i} , (9)

где p — число частей, на которые поделен хроматографический пик;

yi — высота i части пика над базовой линией;

Mi — молекулярная масса i части пика.

Хроматографическая система и калибровка считаются пригодными, если:

• относительное стандартное отклонение для значений V0, Vt и отношения , рассчитанное по серии последовательных хроматограмм (n >= 3) раствора для определения рабочего объема колонки не превышает 1%;
• фактор асимметрии, рассчитанный для пика глюкозы, не превышает 1,3;
• рассчитанные значения \overline{M_{w}} отличаются от соответствующих сертифицированных значений Mw в пределах +/- 5% для каждого стандартного образца декстрана, а расчетное значение Mw глюкозы составляет 180 +/- 2 Да. При этом среднее значение отклонения \overline{M_{w}} декстранов, рассчитанное из модулей индивидуальных отклонений, не должно превышать 3%;
• полученное значение среднемассовой молекулярной массы декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 39000 до 47000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 67000 до 75000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 65000 до 74000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;
• полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% высокомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 110000 до 135000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 190000 до 230000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 180000 до 240000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;
• полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% низкомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 6000 до 9000 Да в случае CO декстрана 40 для проверки пригодности; от 7000 до 11000 Да в случае CO декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 7000 до 11000 Да в случае CO декстрана 70 для проверки пригодности;

Молекулярно-массовое распределение испытуемого декстрана

Хроматографируют испытуемый раствор, определяют значение среднемассовой молекулярной массы (Mw) по уравнениям (2) и (3) и значения Mw для 10% высокомолекулярной и 10% низкомолекулярной фракций декстрана по уравнениям (4) - (6) и (7) - (9) соответственно.

---