Наставление по диагностике респираторного микоплазмоза птиц

(утв. Минсельхозом СССР 28.12.1969)

Респираторный микоплазмоз птиц — болезнь кур и индеек, вызываемая микроорганизмом из группы плевропневмониеподобных (ППЛО) — Mycoplasma gallisepticum, протекающая часто в ассоциации с другими бактериальными и вирусными болезнями (колисептицемия, гемофилез, пастереллез, инфекционный ларинготрахеит, инфекционный бронхит, псевдочума, оспа).

Клиническими признаками являются: ринит, синусит, ларингит, кашель, затрудненное дыхание, хрипы, понижение аппетита. Кроме того, у молодняка — отставание в росте и развитии, а у взрослых — потеря в весе и снижение яйценоскости. У взрослой птицы заболевание микоплазмозом может протекать бессимптомно.

Эпизоотической особенностью болезни является медленное ее распространение в стаде, хроническое течение, повышенная смертность эмбрионов в последние дни инкубации (13 — 21-й день) и цыплят в первые дни жизни. Лабораторные животные (кролики, морские свинки и белые мыши) к заболеванию невосприимчивы. С целью диагностики респираторного микоплазмоза проводят патологоанатомическое вскрытие, бактериологическое, биологическое и в сомнительных случаях гистологическое исследование.

1. При патологоанатомическом вскрытии — в начальной стадии отмечается катаральное воспаление слизистой оболочки носовой полости, подглазничных синусов, гортани и трахеи со скоплением в них серозно-слизистого экссудата. В дальнейшем обнаруживают катарально-фибринозное воспаление слизистых оболочек верхних дыхательных путей и помутнение стенок воздухоносных мешков; последние теряют прозрачность, утолщены и покрыты с внутренней поверхности желтовато-белыми, слизеподобной консистенции пленками, а иногда бледно-желтоватыми хлопьями фибрина. В выраженных случаях полость одного или нескольких воздухоносных мешков заполнена фибринозно-казеозными массами. В воздухоносных мешках, кроме того, нередко можно обнаружить мутноватую тягучую жидкость. Часто устанавливают катаральную или крупозно-некротизирующую пневмонию. Указанные патологоанатомические изменения не всегда полностью выражены и могут наблюдаться в различных сочетаниях.

2. Для бактериологического исследования от свежих трупов или убитых больных птиц используют соскобы со слизистых оболочек гортани, трахеи, головной мозг, а также стенки воздухоносных мешков, кусочки легких. При отсутствии патологоанатомических изменений у взрослой птицы исследованию подвергают желточный мешок, легкие, трахею эмбрионов последних дней инкубации и 1 — 2-суточных цыплят.

При необходимости пересылки патологического материала его подвергают замораживанию при минус 5 — 10 °C в течение часа. Перевозка производится в термосе со льдом.

Из патматериала готовят суспензию на МПБ (1:10), которую обезвреживают от банальной микрофлоры добавлением раствора уксуснокислого таллия (1 г на 400 мл дистиллированной воды) в количестве 0,2 — 0,3 мл и пенициллина 5 — 10 тыс. ЕД на 1 мл суспензии. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 40 мин, после чего производят посев.

Суспензию из патологического материала можно также освободить от посторонних бактерий фильтрацией через крупнопористые фильтры (Дроботько, мембранные № 3 — 4) или центрифугированием при 3,5 — 4 тыс. об/мин и течение 30 — 40 мин. Затем фильтрат или надосадочную жидкость обрабатывают пенициллином (3000 — 5000 ЕД на 1 мл жидкости). Посев подготовленного материала проводят на одну из питательных сред: Эдварда, Хоттингера, Мартена или из куриного мяса. Одновременно с помощью пастеровской пипетки проводят посевы из головного мозга без обработки материала ацетатом таллия и пенициллином.

Приготовление питательных сред.

А. Среда Эдварда. Основную жидкую среду готовят из отвара сердца крупного рогатого скота (в соотношении 1:2) с добавлением к нему 1% пептона. Полученный бульон готовят с pH 8,2 и выдерживают в термостате (37 °C) в течение 10 — 12 ч с целью осаждения избытка фосфатов. Основа среды должна храниться при температуре не выше 4 °C не более 3 мес со дня изготовления. Перед посевом к ней добавляют 20% стерильной инактивированной сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота и 10% экстракта хлебопекарских или пивных дрожжей.

Дрожжевой экстракт готовят путем добавления к 50 г сухих пивных дрожжей или к 100 г хлебопекарских 200 — 250 мл дистиллированной воды с последующим кипячением (30 — 40 мин) до прекращения пенообразования. Стерилизацию экстракта проводят фильтрованием через фильтр Зейтца. Дрожжевой экстракт пригоден к употреблению в течение двух-трех недель при условии хранения в холодильнике (при 2 — 4 °C).

Кроме жидкой среды, для культивирования микоплазм применяют плотный или полужидкий агар Эдварда. Для получения плотной среды к бульону добавляют 2%, а для полужидкой — 0,3% агар-агара.

Б. Среда Хоттингера. Приготовление основного перевара Хоттингера из сырого мясного фарша. На 1 кг говяжьего или конского фарша добавляют 1,5 л дистиллированной воды и 7 — 8 г двууглекислой соды, с тем чтобы pH смеси был 7,8 — 8,0. После этого на каждый кг фарша добавляют 150 — 170 г мелкоизмельченной и очищенной от жира поджелудочной железы или 18 — 20 г панкреатина и на каждый литр смеси — 10 мл х.ч. хлороформа.

В бутыли смесь разливают на 2/3 их объема, закрывают резиновой пробкой и тщательно перемешивают. Затем, открыв пробку, выпускают образовавшиеся пары хлороформа и бутыль снова закрывают. Бутыль помещают в термостат при 40 — 42 °C на 7 — 8 сут.

В процессе ферментативного переваривания в первые 12 ч бутыли взбалтывают каждый час с открыванием пробки. В последующие сутки взбалтывание производят через 2 — 3 ч. Через 7 — 8 сут мясной фарш переваривается, причем в нижней части бутыли образуется осадок, над которым при правильном переваривании верхний слой жидкости имеет соломенно-желтый цвет. Перевар подкисляют х.ч. соляной кислотой до pH 5,0 — 5,5 для прекращения процесса переваривания.

Химические показатели готового перевара Хоттингера должны быть следующими: общего азота 1200 — 1400 мг%, аминного азота 750 — 950 мг%, триптофана 200 — 300 мг%.

Приготовление основного перевара Хоттингера из вареного мясного фарша. Мясо крупного рогатого скота или лошади (средней упитанности) нарезают мелкими кусочками и опускают на 15 — 20 мин в кипящую воду из расчета 34,2 кг мяса на 54,4 л дистиллированной воды. После переваривания мясо отделяют от отвара и пропускают через мясорубку. Фарш смешивают с мясным отваром и к смеси прибавляют 10,8 кг очищенной от оболочек и жира поджелудочной железы или на 1 л перевариваемой массы 16 — 18 г панкреатина. К смеси прибавляют 600 г двууглекислой соды и разливают в 20-литровые баллоны на 2/3 объема. Затем в каждый баллон прибавляют 15 — 20 мл х.ч. хлороформа на каждый литр перевариваемой массы.

Бутыли плотно закрывают резиновой пробкой и помещают в термостат на 48 ч при температуре 41 °C, взбалтывая их 2 — 3 раза в сутки (при взбалтывании каждый раз необходимо открывать пробку). Через 48 ч в результате переваривания в бутылях образуется прозрачная жидкость желтого цвета с мелким красноватым осадком на дне, которую подкисляют х.ч. соляной кислотой до pH 5,0 — 5,5 для прекращения переваривания. Перевар можно хранить без стерилизации.

Готовый перевар должен иметь следующие показатели: общего азота 900 — 1000 мг%, аминного азота 600 — 750 мг%, триптофана 200 — 300 мг%.

Приготовление бульона из переваров Хоттингера, полученных из сырого и вареного мясного фарша. Для приготовления бульона используют основной перевар Хоттингера без осадка, который разводят в 3 — 4 частях горячей дистиллированной воды из расчета содержания аминного азота 185 — 200 мг%. Смесь подогревают до кипения, после чего в нее прибавляют 0,3% поваренной соли, 0,5% пептона, 0,5% двузамещенного фосфорнокислого натрия и кипятят в течение 15 мин. После этого 4%-ным раствором едкого натра устанавливают pH среды 8,0 — 8,2. Затем смесь вновь доводят до кипения, отстаивают 30 мин, фильтруют через плотный ватно-марлевый фильтр.

К охлажденному до 40 — 50 °C бульону добавляют 20% стерильной сыворотки лошади или свиньи (предварительно инактивированной при 56 °C в течение 30 мин) и 0,5% глюкозы. Готовую жидкую среду стерилизуют фильтрацией через стерилизующие фильтры и в течение 48 ч выдерживают в термостате для проверки на стерильность.

Для приготовления плотной питательной среды к жидкой (до прибавления сыворотки и других компонентов) добавляют 2% агар-агара. Агаровую основу стерилизуют в автоклаве при 127 °C 60 мин. После стерилизации к плотной среде, предварительно охлажденной до 50 — 60 °C, прибавляют 20% стерильной сыворотки крови лошади или свиньи и 0,5% глюкозы (20 мл стерильного 25%-ного раствора на 1 л среды). Питательную среду (до застывания) стерильно разливают в пробирки по 4 — 5 мл и скашивают.

В. Среда Мартена из свиных желудков.

Для приготовления гидролизата из свиных желудков фарш желудков, очищенных от жира, разбавляют водопроводной водой в соотношении 300 г фарша на 1 л воды. На каждый литр смеси добавляют 100 мл х.ч. соляной кислоты (уд. вес 1,174 — 1,188). Переваривание производят в бутылях. Смесью фарша и воды заполняют 2/3 объема сосуда. Бутыли помещают в термостат при 50 °C на 24 ч. В процессе переваривания бутыли взбалтывают каждый час. Через 24 ч фарш переваривается, причем в нижней части бутыли образуется осадок, над которым при правильном переваривании верхний слой жидкости имеет светло-соломенный цвет. Готовый гидролизат стерилизуют текучим паром и течение 60 мин. В профильтрованной пробе гидролизата определяют содержание общего и аминного азота.

Готовый препарат должен содержать 650 — 800 мг% общего азота и 140 — 175 мг% аминного азота.

Гидролизат отстаивают 7 дн., отделяют от осадка, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и приступают к изготовлению бульона.

К гидролизату прибавляют 10% дистиллированной воды (на выкипание), подогревают до 80 °C и нейтрализуют 20%-ным раствором едкого натра, доводя pH до 8,0 — 8,2. Затем бульон кипятят в течение 1 ч, отстаивают 30 мин, фильтруют через плотный ватно-марлевый фильтр.

Изготовление плотной и жидкой питательных сред из бульона производят аналогично среде Хоттингера.

Г. Приготовление сред из куриного мяса. Жидкую среду готовят из мяса (без жира и кожи) с использованием печени и сердца от этих же тушек кур. Мясо пропускают через мясорубку. Кровь от убитой птицы собирают отдельно в сосуд и замораживают. К 500 г фарша добавляют 1000 мл дистиллированной воды и помещают на ночь в холодильник, после чего кипятят 30 мин на водяной бане или обрабатывают текучим паром. Мясо отжимают через марлю, а мясную воду отфильтровывают через вату. К мясной воде добавляют 0,5% поваренной соли, около 10% едкого натра до pH 7,8 и 5% куриной крови из замороженного сгустка (сгусток оттаивают и измельчают ножом). Бульон вторично варят 30 мин на водяной бане или текучим паром в автоклаве, фильтруют до полной прозрачности через фильтровальную бумагу, проверяют pH (7,8), разливают во флаконы и дробно стерилизуют. Перед употреблением к бульону добавляют 20% инактивированной в течение 30 мин при 56 °C сыворотки крови лошади или крупного рогатого скота или свиней, разливают в стерильные пробирки и выдерживают не менее суток в термостате (проверка на стерильность).

Дробную стерилизацию бульона после добавления сыворотки можно заменить фильтрованием через фильтр Зейтца (СФ).

Плотная питательная среда. Агаровую среду готовят 2%-ной концентрации из куриного бульона и стерилизуют автоклавированием 25 мин при 0,5 атм. Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 50 — 60 °C и добавляют 20% сыворотки крови, после чего разливают в пробирки или чашки Петри. Сыворотку стерилизуют фильтрованием через фильтр Зейтца (СФ).

Рост возбудителя микоплазмоза на жидких и полужидких средах характеризуется едва заметной опалесценцией или нежным помутнением. Часто при наличии роста возбудителя жидкая среда остается прозрачной. На плотных средах микоплазма образует мелкие круглые бесцветные колонии с гладкой или пуговчатой поверхностью, хорошо различимые, при малом увеличении микроскопа.

Для стимулирования роста микоплазм производят не менее 5 слепых пассажей на указанных средах с промежутками между посевами в 5 дн. Посевы помещают в термостат (37 — 38 °C).

Для поддержания культур микоплазм используют полужидкие питательные среды.

Приготовление и окраска мазков из культур микоплазм. Для приготовления мазков 3 — 5-суточную культуру микоплазм на жидкой питательной среде центрифугируют 30 мин при 3 — 6 тыс. об/мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок для освобождения от балластных веществ 2 — 3 раза отмывают физиологическим раствором при 30-минутном центрифугировании с указанным числом оборотов. Из осадка готовят мазки, фиксируют метиловым спиртом (20 мин) и окрашивают методом Романовского — Гимзы 4 — 7 ч.

В мазках микоплазмы представляют собой множественные мельчайшие полиморфные коккобактерии фиолетового или голубоватого цвета, беспорядочно расположенные по всему полю зрения.

Постановка реакции гемагглютинации с культурами микоплазм. Патогенные культуры микоплазм дают положительную реакцию гемагглютинации (РГА). Для постановки РГА проводят ряд двукратновозрастающих (от 1:2 до 1:64) разведений на физиологическом растворе 3 — 5-суточной культуры микоплазм на жидкой среде. К полученным разведениям добавляют равный объем 1%-ной взвеси отмытых (по общепринятой методике) эритроцитов кур. Пробирки встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 45 — 60 мин для учета результатов реакции.

При постановке РГА ставят два контроля: контроль среды (0,5 мл жидкой среды и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов) и контроль эритроцитов (0,5 мл 1%-ной взвеси и 0,5 мл физиологического раствора поваренной соли). В контролях РГА должна быть отрицательной.

3. Биологическую пробу для определения патогенности выделенных культур микоплазм проводят путем заражения куриных или индюшиных эмбрионов 9-дневного возраста в хорионаллантоисную полость. Доза культуры на жидкой питательной среде — 0,2 мл. Используют не менее 15 эмбрионов, 10 из которых заражают, 5 оставляет для контроля. Яйца инкубируют при температуре 38 — 40 °C и ежедневно овоскопируют.

При вскрытии эмбрионов, погибших через 48 ч и позднее (павших через 24 ч — не исследуют), обнаруживают диспропорцию в развитии зародыша, артриты, резко выраженные отеки и кровоизлияния на коже головы, теле, лапках, застойных и дегенеративные изменения в паренхиматозных органах, отек и кровоизлияния в околоплодных оболочках, аэросакулиты и пневмонию. Наличие возбудителя устанавливают посевами на специальные питательные среды.

Биопроба считается положительной при условии гибели не менее 50% зараженных эмбрионов при выживании контрольных.

4. Для гистологического исследования от трупов или убитых больных птиц и павших эмбрионов берут стенки подглазничных синусов, носовой полости, воздухоносных мешков, гортань, трахею, кусочки легких и паренхиматозных органов.

Патологический материал фиксируют 10%-ным раствором формалина. Кусочки органов после фиксации (в течение 24 — 48 ч) заливают в целлоидин или парафин. Срезы окрашивают гематоксилин-эозином. При необходимости используют дополнительные методы окраски (на соединительную ткань — пикрофуксином, на жир — Суданом III и др.). Также используют метод ускоренной целлоидиновой проводки.

Гистологический диагноз на респираторный микоплазмоз ставят на основании следующего комплекса изменений, обнаруживаемых в различных отделах органов дыхания исследуемых птиц:

а) пролиферации респираторного эпителия слизистых оболочек верхних дыхательных путей и бронхов, развивающейся из фоне катарального, реже фибринозного воспаления с преобладанием в инфильтрате лимфоидных и плазматических клеток; образования и гиперплазии фолликулов, трубчатого удлинения слизистых желез, а также образования выростов слизистой оболочки, напоминающих папилломы;

б) катаральной или крупозной пневмонии с очаговыми некрозами, окруженными гигантскими клетками; образования и гиперплазии лимфатических фолликулов, реже с гигантоклеточными гранулемами и инкапсулированными секвестрами;

в) катарально-фибринозного аэроваскулита, протекающего в части случаев с некротизацией внутренней части сильно измененной и утолщенной стенки, а также с формированием в толще ее очагов некроза, редко гигантоклеточных гранулем и инкапсулированных секвестров.

В случае ассоциированных инфекций, где одним из возбудителей является M. gallisepticum, а другим один из вирусов (инфекционного бронхита, инфекционного ларинготрахеита, псевдочумы, оспы), кроме патологии, характерной для респираторного микоплазмоза, обнаруживают также изменения, свойственные вирусным инфекциям.

5. При установлении диагноза на респираторный микоплазмоз птиц необходимо дифференцировать колисептицемию, гемофилез, хронический пастереллез, аспергиллез, инфекционный ларинготрахеит, инфекционный бронхит, оспу, авитаминоз A.

Лабораторная дифференциальная диагностика бактериальных болезней проводится согласно существующим наставлениям.

Для исключения вирусных инфекций проводят заражение 9 — 10-дневных куриных эмбрионов суспензией исходного патматериала, обработанного антибиотиками или профильтрованного по общепринятой методике. Суспензию в дозе 0,2 мл инокулируют 10 эмбрионам в хорионаллантоисную полость и 10 эмбрионам на хорионаллантоисную оболочку. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют в термостате и по мере их гибели проводят бактериологическое исследование, серологические реакции (гемагглютинации, задержки гемагглютинации, нейтрализации), а также ставят биопробу на птице.

Инфекционный ларинготрахеит. Вирус ИЛТ на 4 — 5-й день культивирования в куриных эмбрионах образует поражения на хорионаллантоисной оболочке. Иногда требуется провести 2 — 3 пассажа на эмбрионах. Некоторые штаммы вируса обладают гемагглютинирующими свойствами.

Цыплята в возрасте 2 — 4 мес, зараженные суспензией из пораженной хорионаллантоисной оболочки путем нанесения материала на скарифицированную слизистую трахеи, заболевают через 2 — 12 дн. Кожнофолликулярная реакция — отрицательная.

У павших и убитых цыплят обнаруживают казеозные пробки и сгустки крови в гортани, трахее, резкую десквамацию эпителия слизистой оболочки этих органов и бронхов, своеобразные гигантские клетки, образованные из эпителиальных, с наличием патогномоничных ацидофильных внутриядерных включений (через 2 — 4 дня после заражения).

Инфекционный бронхит. Вирус инфекционного бронхита при культивировании на куриных эмбрионах вызывает их гибель на 3 — 5-й день или отставание в росте — карликовость; не обладает гемагглютинирующими свойствами. Для выделения вируса необходимо проведение 5 — 8 слепых пассажей на куриных эмбрионах.

Интратрахеальное заражение цыплят 30 — 45-дневного возраста вируссодержащей эмбриональной жидкостью вызывает через 18 — 36 ч заболевание, проявляющееся насморком, хрипами, кашлем.

Патоморфологические изменения характеризуются отеком собственно слизистой оболочки трахеи и бронхов и мононуклеарно-клеточной инфильтрацией, протекающей без нарушения целостности эпителиального пласта.

Оспа птиц. Вирус оспы птиц при заражении куриных эмбрионов вызывает через 5 — 6 дн. узелковые поражения хорионаллантоиса.

При втирании вируссодержащего материала (суспензия тканей из мест поражения от больной птицы или измененной хорионаллантоисной оболочки) в перьевые фолликулы голени невакцинированных против оспы кур возникает оспенный фолликулит.

В гистосрезах слизистой оболочки ротовой полости, глотки, гортани, при дифтеритическом поражении последних обнаруживают патогномоничные суданофильные внутрипротоплазматические включения (тельца Боллингера), импрегнирующиеся серебром по методике Морозова в модификации Апатенко.

Авитаминоз A. Характеризуется изменениями эпителия слизистой пищевода, гортани и трахеи, а также отсутствием инфекционности материала при постановке биопробы.

Эпизоотические, клинические и патоморфологические данные, а также положительный результат бактериологического исследования и биологической пробы являются основанием для установления диагноза на респираторный микоплазмоз.

---