---
title: "\"Наставление по диагностике сапа\""
number: "13-7-2/537"
issuer: "Министерство сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/nastavlenie-13-7-2537"
---

## "Наставление по диагностике сапа"

# "Наставление по диагностике сапа"

(утв. Минсельхозпродом России 26.02.1996)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации (п. п. 46, 207, 302), разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).
> Взамен "Методических указаний по лабораторной диагностике сапа", утв. ГУВ Минсельхоза СССР 24.07.85, "Наставления по постановке пластинчатой реакции агглютинации с сапным цветным антигеном", утв. ГУВ Минсельхозпрода СССР 19.10.90, "Наставления по применению маллеина для диагностики сапа", утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 28.04.95.


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждаю<br>
Заместитель начальника<br>
Департамента ветеринарии<br>
**В.В.СЕЛИВЕРСТОВ**

</div>

<div align="center">

26 февраля 1996 года

</div>


<a id="p100002"></a>**НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ САПА**

<a id="p100003"></a>Разработан сотрудниками Всероссийского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института (г. Казань), специалистами Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России.
<a id="p100004"></a>Наставление предназначено для ветеринарных специалистов.
<a id="p100005"></a>В издание включены требования по предупреждению заноса и распространения сапа в Российской Федерации, мероприятия по диагностике и ликвидации этой особо опасной болезни непарнокопытных семейства лошадиных.
<a id="p100006"></a>Издается по заказу Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России.


## 1. <a id="p100007"></a>Клинический осмотр


<a id="p100008"></a>1.1. При клиническом осмотре обращают внимание на состояние кожного покрова, поверхностных лимфатических узлов и сосудов, слизистой оболочки носовой полости, общее состояние здоровья животного.
<a id="p100009"></a>По внешнему проявлению болезни различают сап носовой, кожный и легочной. Иногда все три клинические формы могут быть выражены одновременно.
<a id="p100010"></a>1.1.1. При носовом сапе на слизистой оболочке носовой полости появляются мелкие желтоватые узелки, окруженные красным ободком. На их месте образуются характерные язвы и звездчатые рубцы.
<a id="p100011"></a>Развитие язв сопровождается гнойным истечением из носа, иногда с примесью крови, а также припуханием подчелюстных лимфатических узлов.
<a id="p100012"></a>1.1.2. При сапных, поверхностных поражениях кожи наблюдают пустулу, язву с гнойным содержимым или заполненную грануляционной тканью или рубец.
<a id="p100013"></a>При глубоких поражениях в толще кожи обнаруживают плотные узлы с гнойно-некротическим содержимым на разрезе, язвы или рубцы, которые могут быть расположены по ходу лимфатических сосудов.
<a id="p100014"></a>1.1.3. При поражении легких наблюдаются слабый глухой кашель, быстрая утомляемость животного, периодические подъемы температуры тела выше 38,5 °С.


## 2. <a id="p100015"></a>Аллергическое исследование


<a id="p100016"></a>Для аллергического исследования на сап применяют маллеин, представляющий собой стерильный культуральный фильтрат возбудителя сапа, выращенного на жидкой питательной среде.
<a id="p100017"></a>При диагностике болезни применяют двукратную глазную и подкожную маллеиновые пробы.

#### <a id="p100018"></a>2.1 Глазная маллеиновая проба.

<a id="p100019"></a>2.1.1. Перед проведением исследования лошади (ослы, мулы) должны быть в течение суток освобождены от физической нагрузки и содержаться на привязи. Обследование животных, имеющих конъюнктивиты и другие заболевания глаз, глазной пробой не проводят.
<a id="p100020"></a>Обследуемым животным наносят 3...4 капли маллеина с помощью глазной пипетки на конъюнктиву одного глаза при оттянутом нижнем веке.
<a id="p100021"></a>Реакцию учитывают через 3, 6, 9, 12 и 24 ч путем осмотра слизистой оболочки глаза.
<a id="p100022"></a>Положительная реакция характеризуется длительной или кратковременной гиперемией и опуханием конъюнктивы разной степени с гнойным истечением из внутреннего угла глаза или скоплением гноя в конъюнктивальном мешке.
<a id="p100023"></a>Реакцию считают отрицательной при отсутствии каких-либо изменений или при слабом покраснении конъюнктивы и слезотечении.
<a id="p100024"></a>2.1.2. Животным, не реагировавшим на первую аппликацию аллергена, препарат через 5...6 суток наносят повторно в той же дозе на конъюнктиву того же глаза.
<a id="p100025"></a>Реакцию учитывают, как указано в [п. 2.1.1](#p100019).

#### <a id="p100026"></a>2.2 Подкожная маллеиновая проба.

<a id="p100027"></a>2.2.1. Подкожную маллеиновую пробу применяют не ранее 1,5 месяца после предыдущей подкожной пробы. Перед ее проведением животных выдерживают на привязи не менее суток и поят подогретой водой.
<a id="p100028"></a>2.2.2. У лошадей (ослов, мулов) измеряют температуру тела в 7...8, 14...15 и 21...22 ч.
<a id="p100029"></a>Обследование животных с кратковременным или длительным повышением температуры до 39 °С и выше подкожной маллеиновой пробой не проводят.
<a id="p100030"></a>2.2.3. Маллеин животным вводят подкожно в область подгрудка в количестве 1 куб. см.
<a id="p100031"></a>Общую температурную реакцию тела и местную реакцию в области введения аллергена учитывают через 6...8, 10... 12, 1...16, 20...24 и 30...36 ч.
<a id="p100032"></a>Положительная реакция характеризуется постепенным подъемом температуры до 39,6 °С и выше и медленным ее спадом с возможным слабым вторичным подъемом через 30...36 ч, а также образованием в месте введения маллеина воспалительной припухлости разной степени выраженности.
<a id="p100033"></a>Реакцию считают отрицательной при нормальной температуре тела или кратковременном подъеме ее не более 39,5 °С и отсутствии изменений в месте введения маллеина.


## 3. <a id="p100034"></a>Серологическое исследование


<a id="p100035"></a>3.1. Пластинчатая реакция агглютинации с сапным цветным антигеном (РА).

##### <a id="p100036"></a>3.1.1 Компоненты реакции.

<a id="p100037"></a>3.1.1.1. Антиген сапной цветной для пластинчатой РА представляет собой гомогенную взвесь в буферном растворе инактивированной окрашенной культуры возбудителя сапа. При хранении допускается образование осадка, переходящего в гомогенную взвесь при встряхивании. Перед употреблением флакон с антигеном выдерживают в течение 15...20 мин. при температуре 18...30 °С и встряхивают.
<a id="p100038"></a>3.1.1.2. Испытуемая сыворотка крови лошадей нативная или консервированная.
<a id="p100039"></a>Консервирование сыворотки крови проводят кристаллами борной кислоты (2...4% к объему сыворотки) до получения насыщенного раствора или путем однократного замораживания.
<a id="p100040"></a>Неконсервированная сыворотка крови пригодна для исследования в течение 5 суток со дня взятия крови с сохранением ее при температуре 4...8 °С.
<a id="p100041"></a>Сыворотка, консервированная борной кислотой, пригодна для исследования в течение 10 суток, замороженная сыворотка - в течение 3 суток после однократного оттаивания.
<a id="p100042"></a>Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки крови исследованию на сап не подлежат.
<a id="p100043"></a>3.1.1.3. Сыворотка сапная для РА и РСК (позитивная сыворотка) изготавливается на биопредприятии.
<a id="p100044"></a>3.1.1.4. Сыворотка крови лошадей неспецифическая неконсервированная (негативная сыворотка) изготавливается на биопредприятии.
<a id="p100045"></a>3.1.1.5. Физиологический раствор - 0,85%-ный раствор хлорида натрия pH 6,8 - 7,2. Коррекцию рН проводят 10%-ным раствором соляной кислоты или 10%-ным раствором гидроокиси натрия.

##### <a id="p100046"></a>3.1.2 Постановка РА.

<a id="p100047"></a>Реакцию проводят на чистых сухих металлических эмалированных пластинках с лунками при температуре 18...30 °С. На бортиках пластинки против каждой лунки записывают номер исследуемой сыворотки крови.
<a id="p100048"></a>В начале работы ставят контроль антигена с позитивной сапной сывороткой и с негативной сывороткой крови лошадей, а также контроль антигена на спонтанную агглютинацию (к 0,03 куб. см антигена добавляют 0,03 куб. см сыворотки или физиологического раствора).
<a id="p100049"></a>Исследуемые сыворотки крови в дозе 0,03 куб. см вносят на дно лунки при помощи шприца-полуавтомата или микропипетки.
<a id="p100050"></a>После внесения каждой сыворотки шприц-полуавтомат (микропипетку) трижды промывают физиологическим раствором и подсушивают фильтровальной бумагой.
<a id="p100051"></a>В каждую лунку рядом с сывороткой при помощи шприца-полуавтомата или микропипетки вносят 0,03 куб. см антигена. Затем антиген в каждой лунке тщательно смешивают с сывороткой ручным смесителем до получения однородной смеси, распределяя ее по всей поверхности лунки.
<a id="p100052"></a>Пластинку с сыворотками и антигеном покачивают в течение 4 мин. осторожными вращательными движениями вручную или при помощи аппарата для покачивания диагностических пластинок.
<a id="p100053"></a>3.1.3. Учет результатов реакции проводят визуально через 4 мин. после смешивания сыворотки крови с антигеном при слегка наклонном положении пластинки.
<a id="p100054"></a>Реакцию считают положительной при наличии отчетливо выраженной агглютинации окрашенных сапных бактерий антигена в виде мелких или крупных хлопьев при 75 - 100%-ном просветлении жидкости (3 - 4 креста).
<a id="p100055"></a>Реакцию считают отрицательной при оценке менее 3 - 4 крестов.
<a id="p100056"></a>Реакцию оценивают в крестах по схеме:
<a id="p100057"></a>++++ (4 креста) - выраженная агглютинация в виде крупных хлопьев розового цвета с полным просветлением жидкости;
<a id="p100058"></a>+++ (3 креста) - менее крупные хлопья с неполным (75%-ным) просветлением жидкости;
<a id="p100059"></a>++ (2 креста) - агглютинат в виде мелких хлопьев, 50%-ное просветление жидкости;
<a id="p100060"></a>+ (1 крест) - мелкозернистый агглютинат, незначительное (25%-ное) просветление жидкости;
- <a id="p100061"></a>(минус) - отсутствие агглютинации, смесь гомогенная, равномерно окрашена.
<a id="p100062"></a>3.1.4. После учета реакции пластинки и смеситель дезинфицируют погружением их на 5 мин. в 1%-ный раствор хлорамина, затем моют водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и используют повторно. Для проведения дезинфекции и сушки пластинок используют кассеты и штативы-сушилки.

#### <a id="p100063"></a>3.2 Реакция связывания комплемента.


##### <a id="p100064"></a>3.2.1 Компоненты реакции.


###### <a id="p100065"></a>3.2.1.1 Антиген сапной для РСК, изготавливается на биопредприятии.

<a id="p100066"></a>3.2.1.2. Испытуемая сыворотка крови лошадей, нативная или консервированная (по [п. 3.1.1.2](#p100038)).
<a id="p100067"></a>3.2.1.3. Сыворотка сапная для РА и РСК (позитивная сыворотка), изготавливается на биопредприятии.
<a id="p100068"></a>3.2.1.4. Сыворотка крови лошадей неспецифическая неконсервированная (негативная сыворотка), изготавливается на биопредприятии.
<a id="p100069"></a>3.2.1.5. Сыворотка гемолитическая для РСК, изготавливается на биопредприятии.

###### <a id="p100070"></a>3.2.1.6 Комплемент сухой для РСК, изготавливается на биопредприятии.


###### <a id="p100071"></a>3.2.1.7 Физиологический раствор (по [п. 3.1.1.5](#p100045)).

<a id="p100072"></a>3.2.1.8. 2,5%-ная взвесь эритроцитов барана в физиологическом растворе. Кровь у барана берут утром, до кормления, из яремной вены во флакон со стеклянными или металлическими бусами, встряхивают в течение 7 - 10 мин. и затем фильтруют через марлю. Эритроциты 3 - 4 раза отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500 - 3000 об./мин. до полного обесцвечивания промывной жидкости. Из осадка эритроцитов готовят 2,5%-ную взвесь в физиологическом растворе.

##### <a id="p100073"></a>3.2.2 Титрование гемолитической сыворотки (гемолизина).

<a id="p100074"></a>Титрование гемолизина проводят при использовании каждой новой серии и в дальнейшем ежегодно.
<a id="p100075"></a>Из основного разведения гемолизина 1:100 (0,1 куб. см гемолизина и 9,9 куб. см физиологического раствора) готовят последующие разведения.

<div align="center">

<a id="p100076"></a>**СХЕМА РАЗВЕДЕНИЯ ГЕМОЛИЗИНА**

</div>



| Основное разведение гемолизина 1:100, куб. см | Физиологический раствор, куб. см | Полученное разведение гемолизина |
| --- | --- | --- |
| 0,2 | 0,8 | 1:500 |
| 0,1 | 0,9 | 1:1000 |
| 0,1 | 1,4 | 1:1500 |
| 0,1 | 1,9 | 1:2000 |
| 0,1 | 2,4 | 1:2500 |
| 0,1 | 2,9 | 1:3000 |


<a id="p100084"></a>Затем по 0,2 куб. см каждого разведения переносят в ряд пробирок, в каждую пробирку добавляют по 0,2 куб. см комплемента в разведении 1:20, 0,2 куб. см 2,5%-ной взвеси эритроцитов и 0,4 куб. см физиологического раствора. Штатив с пробирками встряхивают и помещают в водяную баню на 10 мин. при температуре 37 - 38 °С.
<a id="p100085"></a>Титром гемолизина считают наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный гемолиз эритроцитов.

##### <a id="p100086"></a>3.2.3 Приготовление гемолитической системы.

<a id="p100087"></a>Гемолитическую систему готовят смешиванием в равных объемах 2,5%-ной взвеси эритроцитов барана в физиологическом растворе и раствора гемолитической сыворотки, взятой в удвоенном титре (например, при титре гемолизина 1:1000 берут 2:1000, т.е. для приготовления 100 куб. см гемолизина берут 0,2 куб. см гемолизина из ампулы и разводят в 99,8 куб. см физиологического раствора). Полученные 100 куб. см раствора гемолизина приливают при постоянном помешивании к 100 куб. см взвеси эритроцитов. Гемолитическую систему помещают в водяную баню при температуре 37 - 38 °С на 20 мин. для сенсибилизации эритроцитов.

##### <a id="p100088"></a>3.2.4 Титрование комплемента.

<a id="p100089"></a>Титрование комплемента проводят перед каждой постановкой реакции. Отбирают необходимое для данного объема исследований количество ампул (флаконов) с комплементом (из расчета 1 ампула или флакон на 100 пробирок реакции), растворяют препарат в физиологическом растворе, количество которого указано на ампуле (флаконе), сливают в одну емкость и перемешивают. Таким образом получают основной раствор комплемента, который хранят в холодильнике на протяжении постановки реакции. Из этого раствора готовят разведение 1:20 для титрования.
<a id="p100090"></a>Комплемент титруют в бактериолитической системе, для чего позитивную, негативную и 1 - 2 сыворотки из опыта разводят физиологическим раствором 1:10, инактивируют при температуре 60 - 62 °С в течение 30 мин. и разливают по 0,2 куб. см каждую в два ряда пробирок.
<a id="p100091"></a>Внесение остальных ингредиентов и условия титрования показаны в табл. 1 на примере негативной сыворотки, при этом во вторые ряды сывороток вместо антигена вносят 0,2 куб. см физиологического раствора.

<div align="right">

<a id="p100092"></a>Таблица 1

</div>


<div align="center">

<a id="p100093"></a>**СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА В БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКОЙ СИСТЕМЕ**<br>
**(ПО ПЕРВОМУ РЯДУ ПРОБИРОК)**

</div>



<table>
<colgroup><col width="32%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Комплементы</td><td colspan="10">Номера пробирок</td></tr>
<tr><td>1</td><td>2</td><td>3</td><td>4</td><td>5</td><td>6</td><td>7</td><td>8</td><td>9</td><td>10</td></tr>
<tr><td>Негативная сыворотка в разведении 1:1</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td></tr>
<tr><td>Антиген в рабочем разведении</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td><td>0,2</td></tr>
<tr><td>Комплемент 1:20</td><td>0,02</td><td>0,04</td><td>0,06</td><td>0,08</td><td>0,2</td><td>0,12</td><td>0,14</td><td>0,16</td><td>0,18</td><td>0,20</td></tr>
<tr><td>Физиологический раствор</td><td>0,18</td><td>0,16</td><td>0,14</td><td>0,12</td><td>0,1</td><td>0,08</td><td>0,06</td><td>0,04</td><td>0,02</td><td>0,00</td></tr>
<tr><td colspan="11">Водяная баня 20 мин. при 37 - 38 °С</td></tr>
<tr><td>Гемолитическая система</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td><td>0,4</td></tr>
<tr><td colspan="11">Водяная баня 20 мин. при 37 - 38 °С</td></tr>
<tr><td>Примерный результат</td><td>ЧГ</td><td>ЧГ</td><td>ЧГ</td><td>ЧГ</td><td>ПГ</td><td>ПГ</td><td>ПГ</td><td>ПГ</td><td>ПГ</td><td>ПГ</td></tr>
<tr><td colspan="11">Дополнительный ряд пробирок для предварительного разведения комплекта</td></tr>
<tr><td>Комплемент 1:20</td><td>0,2</td><td>0,4</td><td>0,6</td><td>0,8</td><td>1,0</td><td>1,2</td><td>1,4</td><td>1,6</td><td>1,8</td><td>2,0</td></tr>
<tr><td>Физиологический раствор</td><td>1,8</td><td>1,6</td><td>1,4</td><td>1,2</td><td>1,0</td><td>0,8</td><td>0,6</td><td>0,4</td><td>0,2</td><td>0,0</td></tr>
</table>


<a id="p100106"></a>При работе с аппаратом Флоринского для разведения комплемента берут дополнительный ряд пробирок, в которых делают те же разведения комплемента, но объем увеличивают в 10 раз. Затем разливателем Флоринского переносят по 0,2 куб. см разведенного комплемента во все пробирки каждого ряда и вносят остальные ингредиенты, как указано в [табл. 1](#p100093).
<a id="p100107"></a>Титром комплемента в бактериолитической системе считают минимальное количество его, необходимое для полного гемолиза эритроцитов барана в пробирках с негативной сывороткой и сыворотками из опыта с антигеном и без антигена, а также в пробирках с сапной сывороткой без антигена при полной задержке гемолиза в пробирках с сапной сывороткой и антигеном.

##### <a id="p100108"></a>3.2.5 Приготовление комплемента.

<a id="p100109"></a>Количество комплемента для главного опыта определяют по формуле:

                                     Т х П
<a id="p100110"></a>                                 Х = -----,
                                       20

<a id="p100111"></a>где:
<a id="p100112"></a>Х - количество комплемента, необходимое для главного опыта;
<a id="p100113"></a>Т - титр комплемента в бактериолитической системе;
<a id="p100114"></a>П - количество пробирок в реакции;
<a id="p100115"></a>20 - кратность разведения комплемента при титровании.
<a id="p100116"></a>Например, в опыте 200 пробирок, титр комплемента (по [табл. 1](#p100093)) - 0,1. Следовательно, количество его для проведения опыта:

                          0,1 х 200
<a id="p100117"></a>                          --------- = 1,0 куб. см.
                              20

<a id="p100118"></a>Необходимое количество разведенного комплемента для главного опыта равно 40 куб. см (т.е. 0,2 куб. см х 200). Следовательно, к 1,0 куб. см основного раствора комплемента добавляют 39,0 куб. см физиологического раствора.

#### <a id="p100119"></a>3.3 Постановка главного опыта.

<a id="p100120"></a>Каждую сыворотку крови, предварительно проинактивированную, как указано в [п. 3.2.4](#p100088), исследуют в трех пробирках: без антигена в разведении 1:5 (контроль сыворотки) и с антигеном в разведениях 1:5 и 1:10.
<a id="p100121"></a>Для этого в первую и третью пробирку разливают физиологический раствор в количестве 0,4 куб. см и 0,1 куб. см соответственно. Затем в первую вносят 0,1 куб. см испытуемой сыворотки, смешивают и переносят 0,2 куб. см во вторую и 0,1 куб. см - в третью пробирки.
<a id="p100122"></a>В опытные пробирки вносят по 0,2 куб. см сапного антигена в рабочем разведении, в контрольные - по 0,2 куб. см физиологического раствора, во все пробирки - по 0,2 куб. см комплемента в установленном титре. Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при температуре 37...38 °С.
<a id="p100123"></a>Затем во все пробирки вносят по 0,4 куб. см гомолитической системы, встряхивают и вновь помещают в водяную баню на 20 мин. при температуре 37...38 °С.
<a id="p100124"></a>Одновременно ставят следующие контроли:
<a id="p100125"></a>позитивная и негативная сыворотки в тех же разведениях, что и испытуемые с антигеном и без антигена;
<a id="p100126"></a>антиген без сыворотки (на антикомплементарность);
<a id="p100127"></a>антиген без сыворотки и комплемента (на гемотоксичность);
<a id="p100128"></a>гемсистема с физраствором.
<a id="p100129"></a>При массовых исследованиях допускается постановка реакции в одной пробирке с разведением сыворотки 1:10 (0,02 куб. см сыворотки и 0,18 куб. см физиологического раствора). При работе с аппаратом Флоринского к 0,02 куб. см сыворотки добавляют 0,2 куб. см физиологического раствора. Сыворотки с задержкой гемолиза исследуют повторно, как указано выше.
<a id="p100130"></a>3.4. Учет результатов реакции проводят дважды: непосредственно после последнего прогревания пробирок в водяной бане и на следующие сутки после хранения пробирок при температуре 4...8 °С.
<a id="p100131"></a>Сначала учитывают результаты контролей. Если в пробирках с позитивной сывороткой и антигеном, с антигеном без сыворотки и комплемента, с гемолитической системой и физиологическим раствором будет полная задержка гемолиза, а в пробирках с негативной сывороткой и антигеном, с сапной и негативной сыворотками без антигена и с антигеном без сыворотки - полный гемолиз, постановку реакции считают правильной, и проводят учет результатов.
<a id="p100132"></a>Реакцию учитывают по степени задержки гемолиза эритроцитов, которую определяют по шкале, приготовленной перед учетом реакции. Для этого содержимое трех - пяти пробирок с полным гемолизом сливают в одну, затем гемолизированную жидкость и физиологический раствор разливают в пробирки по следующей схеме:


<table>
<colgroup><col width="55%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="8%"><col width="9%"><col width="9%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Комплементы</td><td colspan="5">Номера пробирок</td></tr>
<tr><td>1</td><td>2</td><td>3</td><td>4</td><td>5</td></tr>
<tr><td>Гемолизированная жидкость (куб. см) Физиологический раствор (куб. см) Процент гемолиза</td><td>1,0 - 100</td><td>0,75 0,25 75</td><td>0,5 0,5 50</td><td>0,25 0,75 25</td><td>- 1,0 0</td></tr>
</table>


<a id="p100137"></a>В соответствии с этой шкалой устанавливают степень задержки гемолиза эритроцитов в каждой пробирке.

#### <a id="p100138"></a>3.5 Реакцию оценивают в крестах в зависимости от процента гемолизированных эритроцитов:

<a id="p100139"></a>++++ (4 креста) - полное отсутствие гемолиза;
<a id="p100140"></a>+++ (3 креста) - гемолиз 25% эритроцитов;
<a id="p100141"></a>++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;
<a id="p100142"></a>+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;
- <a id="p100143"></a>(минус) - полный гемолиз.
<a id="p100144"></a>3.6. Диагностическим титром сыворотки считают разведение ее 1:10. При задержке гемолиза эритроцитов в этом разведении сыворотки на ++++ и +++ реакцию считают положительной независимо от результатов реакции с сывороткой в разведении 1:5. При задержке на ++ и + реакция считают сомнительной, если задержка гемолиза в разведении сыворотки 1:5 соответствует ++++ или +++.
<a id="p100145"></a>Во всех других случаях реакцию считают отрицательной.


## 4. <a id="p100146"></a>Патолого-анатомическое исследование


<a id="p100147"></a>4.1. Болезнь протекает с образованием гранулем в легких, на слизистой оболочке носовой полости, гортани, трахеи, на коже, в других органах и тканях с поражением лимфатических узлов. Гранулемы могут подвергаться распаду с образованием рубцующихся язв.
<a id="p100148"></a>4.2. При исследовании вначале осматривают кожный покров животного, разрезают обнаруженные узлы. Затем труп вскрывают без снятия кожи, осматривают слизистые оболочки органов дыхания, обследуют легкие, печень, селезенку, лимфатические узлы головы и других органов.
<a id="p100149"></a>4.2.1. На слизистых оболочках обнаруживают узелки, язвы с красным ободком или рубцы, в паренхиматозных органах - светло-серые узелки разной величины, при этом часто изменения наблюдают одновременно и в регионарных лимфатических узлах.
<a id="p100150"></a>4.2.2. Поражения в легких могут быть в виде милиарных узелков, а также в форме мелких и крупных очагов (ацинозная, ацинозно-нодозная лобулярная или лобарная пневмония), иногда с кавернами. Обнаруживаются также саловидные участки склероза ткани.
<a id="p100151"></a>Пораженные лимфатические узлы резко увеличены, плотны, могут содержать обызвествленные инкапсулированные узелки или быть на разрезе однородными, без рисунка, серо-белого цвета. Нередко наблюдается воспаление окружающей узел клетчатки (периаденит) с образованием общего плотного фиброзного узла.


## 5. <a id="p100152"></a>Бактериологическое исследование


<a id="p100153"></a>5.1. Бактериологическая диагностика включает культуральное и биологическое исследования биоматериала. Для исследования используют подчелюстные, заглоточные, бронхиальные, средостенные лимфатические узлы, носовую перегородку, гортань, глотку, трахею, а также измененные участки легкого, печени, селезенки, кожи с подкожной клетчаткой.

#### <a id="p100154"></a>5.2 Культуральные исследование.

<a id="p100155"></a>Из биоматериала делают высев с помощью пастеровской пипетки с грушей или шприца с длинной тонкой иглой (отдельного для каждого органа) в МПБ и на МПА с 2...4% глицерина (МПГБ, МПГА), pH 6,8...7,0.
<a id="p100156"></a>Посевы инкубируют при температуре 37...38 °С. Рост обычно появляется на 2...4 сутки.
<a id="p100157"></a>При росте возбудителя бульон мутнеет, на дне появляется слизистый серо-белый осадок, поднимающийся штопором при встряхивании пробирки; некоторые штаммы образуют пристеночное кольцо или пленку на поверхности бульона.
<a id="p100158"></a>На агаре возбудитель сапа растет в виде гладких полупрозрачных колоний серовато-белого цвета с перламутровым оттенком, сливающихся затем в слизистый налет на поверхности среды.
<a id="p100159"></a>Для идентификации возбудителя выделенную культуру микроскопируют, мазки окрашивают по Граму синькой Леффлера (старой) или по Романовскому - Гимзе, пересевают на картофельную среду Павловского, обезжиренное молоко, определяют подвижность в висячей капле, а также исследуют в реакции агглютинации на стекле с сапной сывороткой, взятой в разведении 1:10.
<a id="p100160"></a>Возбудитель сапа представляет собой тонкие зернистые грамотрицательные палочки с закругленными концами, расположенные одиночно или короткими цепочками. При окраске по Романовскому - Гимзе и синькой Леффлера отмечают хорошо выраженную зернистость.
<a id="p100161"></a>При выращивании на картофельной среде Павловского через 2...3 суток появляются мелкие полупрозрачные с желтоватым оттенком колонии, которые затем сливаются, образуя слизистый "медовый" налет. Цвет налета меняется от янтарно-желтого в первые 3 суток роста до буро-коричневого и красноватого к 6...8 суткам.
<a id="p100162"></a>Возбудитель сапа медленно (на 8...14 суток) свертывает молоко, неподвижен. Следует отметить значительно выраженное броуновское движение клеток возбудителя в висячей капле.
<a id="p100163"></a>Большинство штаммов агглютинируется сапной сывороткой.
<a id="p100164"></a>Выделенную культуру исследуют на биологические свойства (по п. 5.3).

#### <a id="p100165"></a>5.3 Биологическое исследование.

<a id="p100166"></a>Из отобранных участков биоматериала [(п. 5.1)](#p100153) одновременно с посевом готовят суспензию путем растирания тканей с физиологическим раствором в ступке с соблюдением условий стерильности и вводят подкожно в области шеи трем хомячкам-самцам в дозе 1 куб. см или трем морским свинкам-самцам в дозе 3 куб. см.
<a id="p100167"></a>Выделенную из биоматериала культуру [(п. 5.2)](#p100154) вводят двум хомячкам или двум свинкам в тех же дозах.
<a id="p100168"></a>Срок наблюдения за зараженными хомячками - 12 суток, морскими свинками - 25 суток.
<a id="p100169"></a>При наличии в биоматериале возбудителя сапа в месте подкожного введения через 3...4 суток образуется язва с уплотненными краями. Больные животные малоподвижны, у них развиваются ринит, конъюнктивит, орхит.
<a id="p100170"></a>Гибель хомячков при достаточной дозе и вирулентности возбудителя наступает через 5...7 суток, морских свинок - через 8...15 суток. У морских свинок заболевание может перейти в хроническую форму.
<a id="p100171"></a>Животных с клиническими признаками болезни усыпляют эфиром, вскрывают и проводят высев из сердца, селезенки, печени, семенников на питательные среды, затем исследуют выделенную культуру, как указано в [п. 5.2](#p100154). Аналогично поступают с павшими зараженными животными.
<a id="p100172"></a>При вскрытии у больных и павших животных на селезенке, печени, в легких, семенниках обнаруживают геморрагические и некротические узелки.


## 6. <a id="p100173"></a>Гистологическое исследование


<a id="p100174"></a>Для гистологического исследования берут измененные кусочки органов и тканей, из которых после фиксации готовят срезы на замораживающем микротоме или после заливки целлоидином (парафином).
<a id="p100175"></a>Срезы окрашивают гематоксилин-эозином и просматривают сначала при малом увеличении (окуляр х7, объектив х10), затем при обнаружении узелков рассматривают их при большом увеличении (объектив х40 - х60).
<a id="p100176"></a>Типичной формой сапного изменения является инфекционная гранулема (узелок) специфического строения. В центре развивающегося узелка обнаруживают нейтрофильные лейкоциты, лимфоциты и эпителиоидные клетки. Дифференцирующим признаком является кариорексис (распад ядер) лейкоцитов.
<a id="p100177"></a>В стадии инкапсуляции центр узелка представлен глыбчато-зернистым распадом хроматина ядер лейкоцитов и окрашен в темно-синий цвет. Внутренний слой клеточной зоны состоит из эпителиоидных клеток бледно-розового цвета, а наружный, окрашенный темнее, - из лимфоидных клеток с фибробластами и коллагеновыми волокнами.
<a id="p100178"></a>Центральная часть обызвествленных узелков окрашена в темно-синий, а некротическая масса - в розовый цвета. Известь выступает в виде глыбок и зерен на общем розовом фоне необызвествленной некротической массы. За соединительнотканной капсулой располагаются лимфоидные клетки в виде синеватого ободка.
<a id="p100179"></a>Помимо узелков, сапные изменения могут проявляться в виде диффузного воспаления с экссудативным и продуктивным акцентом, которое характеризуется наличием очагов лейкоцитарных скоплений с явлениями кариорексиса или пролиферацией лимфоидных и эпителиоидных клеток.
<a id="p100180"></a>Изменения слизистой носовой полости могут представлять собой комбинацию узелков, первичных и вторичных язв и рубцов.


## 7. <a id="p100181"></a>Постановка диагноза


<a id="p100182"></a>7.1. При положительном результате хотя бы одного из следующих методов исследования: клинического осмотра, глазной маллеиновой пробы, исследования сыворотки крови в РА или РСК животных считают подозреваемыми в заболевании сапом.

#### <a id="p100183"></a>7.2 Диагноз на сап считают установленным в следующих случаях:


##### <a id="p100184"></a>7.2.1 Положительная маллеиновая проба, подтвержденная результатом патолого-анатомического исследования;


##### <a id="p100185"></a>7.2.2 Обнаружение характерных для сапа изменений во внутренних органах и тканях;


##### <a id="p100186"></a>7.2.3 Выделение культуры из патологического материала со свойствами, характерными для возбудителя сапа;

<a id="p100187"></a>7.2.4. Получение положительных результатов биологического исследования, даже если культуры возбудителя из исходного материала не выделены.

<a id="p100188"></a>С изданием настоящего Наставления на территории Российской Федерации не действуют "Методические указания по лабораторной диагностике сапа", утвержденные ГУВ Минсельхоза СССР 24 июля 1985 г., "Наставление по постановке пластинчатой реакции агглютинации с сапным цветным антигеном", утвержденное ГУВ Минсельхозпрода СССР 19 октября 1990 г., "Наставление по применению маллеина для диагностики сапа", утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 28 апреля 1995 г.



<a id="p100189"></a>

---