Наставление по лабораторной диагностике орнитоза (хламидиоза) птиц
(утв. Минсельхозпродом России 26.04.1999 № 13-7-2/1573)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации (п. п. 92, 212), разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Утверждаю
Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
В. В. Селиверстов
26 апреля 1999 г. № 13-7-2/1573
1.1 Лабораторные исследования на хламидиоз птиц включают:
- выявление специфических антител в сыворотке крови больных птиц в РСК (РНСК) или ИФА;
- обнаружение хламидий или антигенов хламидий в патологическом материале методом световой или люминесцентной микроскопии;
- выделение хламидий на куриных эмбрионах или лабораторных животных с последующей их идентификацией;
- выявление ДНК хламидий в патологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
1.2. Работа с возбудителем хламидиоза птиц допускается в лабораториях, имеющих условия для работы с особо опасными инфекциями и разрешение СЭС на работу с возбудителями 1 — 2 групп; исследования на хламидиоз проводят в отдельном боксе или отдельной комнате с настольным боксом.
Работа с возбудителем орнитоза также может проводиться в ПЦР-лаборатории с предварительно инактивированным материалом, прогретым при 70 — 80 °C в течение 10 мин. или залитым 0,5%-ным раствором фенола или гуанидин тиоционатом в концентрации 5,3 моль/л.
1.3. Диагноз на хламидиоз птиц устанавливают на основании анализа эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений с учетом результатов лабораторных исследований.
В лабораторию для исследования направляют сыворотку крови, патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), павших или вынужденно убитых птиц или патологический материал от них (кусочки печени, селезенки, экссудат брюшной полости).
Патологический материал (соскобы с конъюнктивы и клоаки, помет), для исследования необходимо брать в количестве не менее трех образцов от одной и той же особи в течение 5 суток в связи с непостоянным выделением возбудителя у инфицированной птицы.
Сыворотку крови для серологического исследования берут на 5 — 12 день заболевания и направляют в лабораторию в количестве 1 — 2 куб. см. Сыворотки хранят при температуре минус (18 — 20) °C и исследуют одномоментно. Сыворотки гемолизированные или контаминированные бактериальной и грибковой флорой не пригодны.
Патологический материал берут только одноразовыми или стерильными инструментами в одноразовые пластиковые пробирки с крышками или в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками, упаковывают в отдельные пакеты с номерами или надписями и доставляют в лабораторию в емкости со льдом в течение 24 часов. Хранить материал можно не более 7 суток при 4 °C и 10 — 12 мес. при температуре минус (18 — 20) °C.
Патологический материал отбирают не позднее 2 ч. после гибели или убоя птицы с соблюдением правил асептики, помещают его в стерильные пробирки (флаконы) с резиновыми пробками и затем в термос со льдом.
Трупы птиц заворачивают в несколько слоев марли или ткани, смоченной 5%-ным раствором хлорамина, и помещают во влагонепроницаемую тару, опечатывают и в тот же день (не позднее 24 часов после взятия) доставляют в лабораторию с соблюдением мер, исключающих рассеивание возбудителя. В лаборатории вскрытие трупов птиц с подозрением на хламидиоз проводят в отдельном боксе с соблюдением правил работы с особо опасным материалом.
2. Выявление комплементсвязывающих антител.
2.1 Специфические антитела к хламидиям можно выявить в крови птиц, начиная с 5 — 12 дней после их заболевания, в реакции связывания комплемента (РСК), или реакции непрямого связывания комплемента (РНСК) или иммуноферментным анализом (ИФА). В отличие от РСК и ИФА, РНСК выявляет «неполные» антитела, образующиеся в крови некоторых видов птиц.
2.2 Постановка РСК.
2.2.1 Компоненты реакций и их подготовка к работе:
- комплементсвязывающий группоспецифический и контрольный антигены, иммунную и отрицательные сыворотки, применяют в рабочих титрах, указанных на этикетках:
- стандартную гемолитическую сыворотку (гемолизин) используют в утроенном титре (например, титр гемолизина 1:1500, а в реакцию берут в разведении 1:500:
- эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500 — 3000 об/мин в течение 10 — 15 мин до полного просветления надосадочной жидкости и готовят 3%-ную взвесь из осадка на физиологическом растворе;
- комплемент (свежая, консервированная и лиофильно высушенная сыворотка морской свинки) в рабочем титре, установленном в день постановки реакции;
- физиологический раствор (0,85%) химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде pH 7,2 — 7,4;
- испытуемые сыворотки (свежие или консервированные) разводят 1:8 физраствором и инактивируют в водяной бане при 58 — 60 °C 30 мин.
Гемолитическую систему — смесь равных объемов 3% взвеси эритроцитов и рабочего разведения гемолизина — выдерживают 30 мин. при 37 °C для сенсибилизации.
2.2.2 Титрование комплемента.
За рабочее разведение принимают разведение комплемента через одну влево от последней пробирки с полным гемолизом. В данном примере полный гемолиз получен при разведении комплемента 1:40, рабочее разведение его 1:20
Определение рабочего разведения комплемента проводят по следующей схеме:
ПГ — полный гемолиз, ЧГ — частичный гемолиз, ЗГ — задержка гемолиза
Комплемент в рабочем разведении титруют на специфической, негативной и испытуемой сыворотках в присутствии специфического антигена по следующей схеме:
Титром комплемента считают минимальное его количество, вызывающее полный гемолиз эритроцитов в пробирках с негативной и испытуемой сыворотками в присутствии антигена при задержке гемолиза в аналогичной пробирке со специфической сывороткой.
Рабочей дозой является доза комплемента на один интервал вправо.
В случае инкубации ингредиентов 16 — 18 ч. при 4 — 6 °C за рабочую дозу принимают удвоенный титр комплемента
Расчет количества чистого комплемента для главного опыта делают по формуле:
\frac{\text{К } \times \text{П}}{\text{Р}}
где К — комплемент в рабочей дозе; П — количество пробирок в опыте; Р — рабочее разведение комплемента.
2.2.3 Постановка главного опыта РСК.
Реакцию ставят в объеме 0,5 куб. см в пробирках Флоринского. Разведенные и инактивированные сыворотки исследуют со специфическим, контрольным антигенами и без антигена (контроль на антикомплементарность).
Одновременно с главным опытом ставят контроли: позитивной сыворотки до ее предельного титра и негативной в том же разведении, как испытуемые, со специфическим антигеном; специфического и контрольного антигена — на антикомплементарность.
Главный опыт и контроли ставят по схеме:
2.2.4 Учет и оценка результатов реакции.
Реакцию учитывают через 30 мин. после извлечения штативов из водяной бани. Результаты реакции считают действительными при следующих показаниях контролей:
- задержка гемолиза в пробирках со специфическим антигеном и сывороткой до ее предельного титра;
- полный гемолиз во всех пробирках с негативной сывороткой, со специфической сывороткой без антигена и с контрольным антигеном; в контролях антигенов на антикомплементарность.
Оценку результатов реакции проводят по степени задержки гемолиза эритроцитов и выражают по четырехкрестовой системе:
Реакцию считают положительной при задержке гемолиза на 2 — 4 креста в пробирке с испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и специфическим антигеном. Сомнительной при задержке гемолиза на 1 крест, отрицательной — при полном гемолизе эритроцитов.
2.3 Постановка РНСК.
2.3.1. Постановку реакции до главного опыта проводят по той же схеме, что и РСК, но в объеме 0,6 куб. см (путем добавления 0,1 куб. см физиологического раствора).
2.3.2 Главный опыт РНСК проводят в три этапа:
1 этап — испытуемые сыворотки со специфическим и контрольным антигенами выдерживают 1 ч. при 37 — 38 °C.
2 этап — во все пробирки вносят иммунную сыворотку, разведенную до предельного титра и комплемент в рабочей дозе по 0,1 куб. см, смесь инкубируют 1 ч. при 37 — 38 °C или 16 — 18 ч. при 4 °C.
3 этап — добавляют гемолитическую систему по 0,2 куб. см и выдерживают 30 мин. при 37 — 38 °C.
2.3.3 Учет и оценка реакции.
Учет реакции проводят через 30 мин после изъятия штативов из водяной бани; степень гемолиза, как и в РСК, выражают по четырехкрестовой системе, но оценивают в обратном порядке:
| ++++ | (4 креста) — реакция отрицательная; |
|---|---|
| +++ | (3 креста) — реакция отрицательная; |
| ++ | (2 креста) — реакция отрицательная; |
| + | (1 крест) — реакция положительная; |
| - | (минус) — реакция положительная. |
3.1. ИФА применяют для ретроспективной диагностики орнитоза (пситтакоза) птиц и эпизоотологического обследования особей путем выявления специфических антител в сыворотках крови.
3.2. Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызвать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.
3.3 Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:
3.3.1 В состав набора входят:
1 — специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный — 1 амп.;
2 — специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная — 1 амп.;
3 — отрицательная сыворотка, лиофилизированная — 1 амп.;
4 — пероксидазный антивидовой конъюгат, лиофилизированный — 1 амп.
Химический набор, в состав которого входят:
8 — Твин-20 (-40. -80, Тритон Х-100) — 1 амп.;
9 — лимонная кислота — 1 амп.:
11 — 0-фенилендиамин — 2 амп.;
13 — две 96-луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;
3.3.2 Оборудование:
1 — одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 куб. см до 1 куб. см;
2 — стеклянные пипетки на 1 — 2 куб. см;
4 — спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.
3.4 Приготовление рабочих растворов:
- Буфер № 1 — (0,01М калий фосфатный, pH 7,2 — 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5, 6, 7 растворяют в 2500 куб. см дистиллированной воды, фильтруют, проверяют pH. При необходимости pH корректируют 0,1 n KOH или HCl.
- Буфер № 2 — предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 куб. см буфера № 1 добавляют содержимое ампулы № 8.
- Буфер № 3 — (фосфатно-цитратный) предназначен для приготовления субстрата (pH 5,0 — 5,2). Состоит из двух компонентов: растворов А и Б.
А — содержимое ампулы № 9 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе.
Б — содержимое ампулы № 10 растворить в 50 куб. см дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 куб. см раствора А добавить 25,7 куб. см раствора Б и 50 куб. см дистиллированной воды, проверить pH. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) компоненты буфера до установления требуемого pH. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.
Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы № 11 растворить в 2 куб. см спирта-ректификата и добавить 48 куб. см буфера № 3, внести 0,8 куб. см перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки № 12 в 10 куб. см дистиллированной воды.
Буферные растворы хранят при температуре 4 — 6 гр. C не более 3 мес.
3.4.2 Подготовка биологических компонентов реакции:
Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 куб. см буфера № 1.
Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 куб. см буфера № 2.
Положительную и отрицательную сыворотки растворяют в 5 куб. см буфера № 2, получая разведение 1:200.
Растворенный антиген, сыворотки, антивидовой конъюгат хранят при 4 — 6 °C в течение 3 — 4 дней.
3.5 Постановка иммуноферментной реакции.
Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.
3 5.1. Сорбция антигена на микропанели.
3.5.2 Промывание микропанели.
Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером № 2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4 — 5 раз.
Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.
3.5.3 Разведение сывороток.
В три лунки микропанели вертикального ряда A1, B1, C1 вносят по 0,1 куб. см специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки d1, E1, f1 вносят по 0,1 куб. см отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п. 3.4.2. В лунки g1, H1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 куб. см буфера № 2. В горизонтальные ряды A, E вносят, начиная с лунок A2 и E2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п. 3.4.3 и проводят раститровку по вертикальным рядам. начиная с разведения 1:200 до 1:6000.
Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37 °C в термостате в течение часа.
3.5.4 Внесение конъюгата.
Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.
Во все лунки вносят по 0,1 куб. см рабочего раствора иммуноферментного конъюгата, подготовленного согласно п. 3.4.2, и инкубируют в термостате при 37 °C в течение 1 часа.
3.5.5 Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.
Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4 1.
Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 куб. см субстратно-индикаторного раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30 — 40 мин.
В каждую лунку вносят по 100 мкл стоп-раствора.
3.6 Учет результатов реакции.
Результаты учитывают в течение 30 — 40 мин. после внесения стоп-раствора.
3.6.1 Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле
Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.
3.6.2. Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП 490)
Положительными считаются пробы, ОП 490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.
Сомнительные пробы — ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150 — 0,199 оптических единиц.
Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствует об отрицательной реакции.
3.7 Интерпретация результатов ИФА.
Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2 — 4 раза.
Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.
3.8. Птиц, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.
4. Обнаружение хламидий в патологическом материале.
Из патологического материала готовят мазки или мазки-отпечатки (с висцеральной поверхности внутренних органов: сердца, печени, селезенки; при гидроперикардите — из перикардной жидкости) для световой и люминесцентной микроскопии.
4.1. Метод световой микроскопии. При исследовании материала методом световой микроскопии мазки или мазки-отпечатки окрашивают по Романовскому-Гимзе.
При окраске по Романовскому-Гимзе подсушенные на воздухе препараты фиксируют метиловым спиртом в течение 1 мин. или спирт-эфиром в течение 15 — 20 мин. и окрашивают краской Романовского-Гимзе, разведенной в соотношении 1:10 фосфатным буфером (pH 7,2 — 7,6) в течение 1,5 часов, после чего их промывают дистиллированной водой и высушивают фильтровальной бумагой.
Окрашенные и высушенные препараты просматривают в световом микроскопе под иммерсионным объективом. Цитоплазматические включения представляют компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определяются вблизи ядра, нередко смещают его к периферии клетки, имеют разнообразную правильную или неправильную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со средним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имеют сине-фиолетовый цвет, крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры возбудителя имеют розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявляются включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма, обнаруживается содержащая их вакуоль.
4.2 Метод прямой и непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).
Для исследования методом прямой и непрямой ИФ мазки готовят непосредственно после взятия материала с конъюнктивы и клоаки у птиц, используя одноразовый зонд, имеющий ватный тампон с повышенной адсорбцией. Материал отбирают вращательным движением тампона и переносят на лунку предметного стекла. Предметное стекло заранее маркируют, указывая номер и дату взятия пробы. Приготовленный мазок высушивают на воздухе. Высушенный мазок фиксируют в 96% этаноле в течение 5 мин. или наносят на мазок 2 — 3 капли ацетона до полного его испарения. Стекло с фиксированным препаратом может храниться при температуре (18 — 20) °C в течение 5 сут.
4.2.1 Для проведения прямой ИФ используют набор, в состав которого входят:
- компонент № 1 — лиофилизированные моноклональные антитела, меченные флюоресцеин-изотиацианатом (ФИТЦ) и содержащие краситель Эванса; сухая гомогенная аморфная масса синевато-сиреневого цвета — 1 флакон, 0,1 куб. см;
- компонент № 2 — растворитель для лиофилизированных иммуноглобулинов, прозрачная бесцветная жидкость — 1 флакон, 3,0 куб. см;
- компонент № 3 — жидкость для «заключения» препарата, вязкая прозрачная маслянистая жидкость — 1 флакон, 2,0 куб. см.
- люминесцентный микроскоп;
- термостат на 37 °C;
- чашки Петри;
- предметные стекла с лункой;
- фильтровальная бумага;
- микропипетки на 30 мкл;
- наконечники в штативе.
4.2.2. При исследовании прямым методом ИФ на специальную лунку предметного стекла с фиксированным материалом с помощью микропипетки вносят 30 мкл меченных ФИТЦ моноклональных антител. С помощью наконечника пипетки или запаянной пастеровской пипетки равномерно распределяют реагент по всей поверхности лунки с материалом.
4.2.3. Инкубация мазков-отпечатков. Мазки с нанесенным на них реагентом инкубируют во влажной камере (в чашке Петри) при температуре 37 +/- 0.5 °C в течение 30 мин, периодически проверяя их состояние во избежание высыхания реагента на препарате, что может привести к ложноположительным результатам при диагностике, поэтому высохшие препараты бракуются.
4.2.4 Промывание предметных стекол. По истечении срока инкубации предметные стекла тщательно промывают дистиллированной водой в течение 10 с, остатки воды удаляют с краев стекла фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.
4.2.5. Микроскопирование мазков. На мазок наносят 20 мкл жидкости для «заключения» препарата (компонент № 3), покрывают обезжиренным покровным стеклом и просматривают препарат в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров СЗ 24-3, ФС 1-2, БС 8-3 при использовании окуляра X 10 и объектива с масляной иммерсией X 90, с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла. Препарат рекомендуется просматривать сразу же после приготовления. Смонтированные препараты можно хранить при температуре 2 — 8 °C не более 24 ч.