Наставление по применению набора для диагностики токсоплазмоза животных в РСК
(утв. Минсельхозпродом России 04.12.1997 № 13-7-2/1107)
Примечание
Взамен «Наставления по применению набора для диагностики токсоплазмоза животных в РСК (РДСК)», утв. Главным управлением ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР 22.04.1986
Утверждаю Заместитель начальника Департамента ветеринарии В. В. Селиверстов
4 декабря 1997 г. № 13-7-2/1107
НАСТАВЛЕНИЕ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ТОКСОПЛАЗМОЗА ЖИВОТНЫХ В РСК
1.2 Набор для диагностики токсоплазмоза животных содержит:
- четыре ампулы (по 1 куб. см) токсоплазменного антигена (ТА);
- четыре ампулы (1 куб. см) токсоплазменной сыворотки крови,
- две ампулы (1 куб. см) нормальной сыворотки крови овец,
1.3. Антиген представляет собой мелкопористую массу белого цвета, сыворотки — пористую аморфную массу соломенно-желтого цвета, запаянные в ампулы, без посторонней примеси с содержанием влаги не более 3%.
1.4. На ампулы с антигеном и сыворотками наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование препарата, объем растворителя, номер серии, дату выпуска и титр.
1.5. На коробку с антигеном и сыворотками наклеивают этикетку, на которой указывают: наименование и товарный знак предприятия-изготовителя и его адрес, наименование препарата, количество ампул, количество растворителя, необходимого для растворения антигена в ампуле и получения его рабочего титра, разовая доза, количество доз в коробке, номер серии, дата выпуска (месяц, год), срок годности, условия хранения, номер контроля, обозначение ТУ.
1.6. Набор для диагностики токсоплазмоза животных хранят сухом темном помещении при температуре 4 — 8 °C.
Срок годности диагностикумов, входящих в набор — 24 месяца со дня изготовления.
1.7. При отсутствии маркировки (этикетки), нарушении целостности ампул, изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при неполном растворении компоненты бракуют.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО НАБОРА
2.1 Подготовка диагностического набора к работе:
- содержимое ампулы с антигеном растворяют физиологическим раствором в соответствии с указанием на этикетке рабочим титром;
- содержимое ампул с токсоплазменной и нормальной сыворотками растворяют физиологическим раствором в соответствии с указанием на этикетке рабочим титром.
Растворенные таким образом антиген и сыворотки используют в день проведения исследования. Оставшиеся неиспользованные антиген и сыворотки допускается применять для исследования в течение 15 дней при условии хранении в морозильной камере холодильника.
По истечении этого срока указанные компоненты реакции утилизируют.
2.3 Компоненты реакции:
- физиологический раствор, pH 7,4.
- эритроциты барана, трижды отмытые физиологическим раствором центрифугированием при 2000 — 3000 об, мин. В течение 15 — 20 мин. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 2,5 — 3% взвесь на физиологическом растворе;
- гемолитическая сыворотка. В реакцию гемолизин берут в утроенном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1:1200, в реакции используют сыворотку в разведении 1:400, для чего к 0,1 куб. см сыворотки прибавляют 39,9 куб. см физиологического раствора.
Перед работой 2,5 — 3% взвесь эритроцитов и разведенную по утроенному титру гемолитическую сыворотку смешивают в равных объемах и гемолитическую систему ставят в водяную баню при 37 — 38 гр. C на 20 мин. Для сенсибилизации эритроцитов;
Лучше всего использовать сухой комплемент, выпускаемый биопромышленностью. Для реакции используют комплемент в рабочем титре, который определяют в день ее постановки;
- токсоплазменный антиген в рабочем титре;
- исследуемые и контрольные сыворотки крови в разведении 1:5, инактивированные прогреванием в течение 30 мин. при температуре: для крупного рогатого скота, овец и свиней при 57 гр. C, для лошадей — 58 — 59 гр. C, для птиц, крыс, мышей — 60 гр. C, для ослов и мулов — 64 гр. C, для кроликов и зайцев, собак, кошек, лисиц — 65 гр, C.
2.4. Для титрования комплемента и контролей реакции используют нормальные и токсоплазменные сыворотки крови овец из набора, а также сыворотку крови из исследуемой партии.
2.5 Титрование комплемента.
2.5.1. В день постановки реакции производят титрование комплемента, для чего его разводят физиологическим раствором 1:20.
Комплемент титруют по нормальной и заведомо положительной сывороткам в присутствии антигена и без него, а также по 2 — 3 исследуемым сывороткам в безантигенном ряду для определения их антикомплементарных свойств и правильного выбора титра комплемента.
В безантигенные ряды пробирок вместо антигена вносят по 0,2 куб. см физиологического раствора.
Схема титрования комплемента дана в таблице 1.
2.5.2. После выдерживания пробирок в водяной бане при 37 — 38 гр. C производят учет результатов титрации комплемента.
Схема определения титра комплемента приведена в таблице 2.
2.5.3. Титром комплемента является наименьшая его доза, которая дает полный гемолиз взвеси эритроцитов. В приведенной схеме (табл. 2) титр комплемента в разведении 1:20 равен 0,06, так как в 1, 2, 4, 5 рядах в пробирках с 3 по 10 отмечается полный гемолиз эритроцитов, при соответствующей задержке гемолиза во всех пробирках 3 ряда (положительная сыворотка + антиген).
2.5.4. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена в основной опыт комплемент берется с надбавкой к найденному титру (в нашем примере он равен 0,06). Для токсоплазменного антигена делают надбавку 10 — 20% для РСК. Тогда в объеме 0,2 куб. см (разовой дозы комплемента) рабочий титр комплемента в разведении 1:20 будет составлять для РСК 0,06 + 10 — 20% и равняться 0,066 — 0,072.
Если в основной опыт взят рабочий титр 0,072, то для получения разовой дозы комплемента (0,02 куб. см) к нему нужно добавить 0,128 куб. см Физиологического раствора (0,072 + 0,128). Из полученного Соотношения комплемента и физиологического раствора определяют общее Количество комплемента в рабочем титре, необходимое для постановки основного опыта. Например, если в опыте будет использовано 100 пробирок, то для постановки реакции потребуется 20 куб. см комплемента (0,2 куб. см 100). Это количество получают путем добавления к 7,2 куб. см разведенного 1:20 комплемента 12,8 куб. см физиологического раствора (0,072 + 0,128 * 100 = 20 куб. см).
2.6 Постановка основной реакции.
2.6.1. Реакция связывания комплемента ставится в объеме 1 куб. см; антиген, сыворотку и комплемент берут в дозе 0,2 куб. см, а гемолитическую систему — 0,4 куб. см.
2.6.2. В основную реакцию наряду с испытуемыми сыворотками берут в качестве контроля заведомо положительные и отрицательные сыворотки, с которыми реакция ставится так же как с испытуемыми.
2.6.3. Для постановки основной реакции берут два ряда пробирок: 1-й опытный и 2-й ряд — контрольный (контроль на антикомплементарность сывороток). Каждую сыворотку в разведении 1:5 вносят по 0,2 куб. в опытную и контрольную пробирки. Антиген в рабочем титре добавляют по 0,2 куб. см только в пробирки 1-го ряда, во второй контрольный ряд вместо антигена вносят по 0,2 куб. см физиологического раствора. После этого во все пробирки вносят по 0,2 куб. см комплемента в рабочем разведении. Одновременно ставят контроли: антикомплементарности антигена (0,2 куб. см антигена + 0,2 куб. см комплемента + 0,2 куб. см физиологического раствора), его гемотоксичности (0,2 куб. см антигена + 0,4 куб. см физиологического раствора) и стабильности гемолитической системы (0,6 куб. см физиологического раствора).
2.6.4. Все пробирки хорошо встряхивают для смешивания ингредиентов и ставят в водяную баню при 37 — 38 гр. C на 20 мин.
2.6.5. После выдерживания в водяной бане в пробирки добавляют по 0,4 куб. см гемолитической системы, затем их встряхивают и ставят в водяную баню при 37 — 38 гр. C на 20 мин.
2.6.6. Результаты реакции учитывают сразу после выдержки в водяной бане и на следующий день при условии хранения реакции в холодильнике при +2 +8 гр. C.
2.7 Учет результатов реакции.
2.7.1 Учет результатов реакции начинают с контролей:
- контроль сывороток (2-й ряд) — во всех пробирках должен быть полный гемолиз. При задержке гемолиза результаты по данной сыворотке не учитывают и проводят ее переисследование;
- заведомо отрицательные сыворотки должны дать полный гемолиз;
- заведомо положительные сыворотки должны дать задержку гемолиза;
- контроль антигена на антикомплементарность — должен быть полный гемолиз; на гемотоксичность — задержка гемолиза;
- контроль стабильности гемолитической системы — должна быть задержка гемолиза.
2.7.2. Результаты реакции учитывают визуально и оценивают в крестах или в % задержки гемолиза эритроцитов.
Отмечают результаты реакции крестами: положительная реакция ++++ или +++; сомнительная реакция ++ или +; отрицательная реакция -.
Степень задержки гемолиза, выраженная крестами, соответствует следующим процентам гемолиза эритроцитов: ++++ гемолиз эритроцитов от 0 до 10%, +++ от 10 до 40; ++ от 40 до 70; + от 70 до 90; — от 90 до 100%.
Результаты исследования обозначают: положительная, сомнительная, отрицательная с указанием крестов.
Для внесения объективности в определении результатов реакции крестами рекомендуется оценку проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают пять пробирок с полным гемолизом и жидкость сливают в одну пробирку. В этой жидкости 100% гемолиза. Из нее готовят разведение с различным процентом гемолизом (от 10 до 90%) по следующей схеме:
| номер пробирки | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| Гемолизированная жидкость | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | 1,2 | 1,4 | 1,6 | 1,8 |
| Физиологический раствор | 1,8 | 1,6 | 1,4 | 1,2 | 1,0 | 0,8 | 0,6 | 0,4 | 0,2 |
| Процент гемолиза | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 60 | 70 | 80 | 90 |
«Стандартные» пробирки готовят перед учетом реакции. Степень гемолиза в каждой пробирке с исследуемой сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в «стандартных» пробирках, и процент сравнения со степенью гемолиза в «стандартных» пробирках, и процент гемолиза выражают в крестах.
2.7.3. Результаты реакции считают положительными при задержке гемолиза эритроцитов не менее чем на +++ в разведении 1:5.
Сыворотки крови от животных, которые дают сомнительную реакцию, Подлежат повторному исследованию в РСК через 30 дней после первого Исследования. Двукратную сомнительную реакцию считают положительной.
2.7.4. В случае необходимости проводят титрацию выявленных положительных сывороток в разведениях 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 и т.д. (см табл. 3). Титром испытуемой сыворотки считают ее наибольшее разведение, дающее задержку гемолиза эритроцитов. В приведенном примере таблицы 3). Титром испытуемой сыворотки считают ее наибольшее разведение, дающее задержку гемолиза эритроцитов. В приведенном примере таблицы 3 титр исследуемой сыворотки равен 1:40.
СХЕМА ТИТРОВАНИЯ ПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ СЫВОРОТКИ
2.7.5. Животных, положительно реагирующих в РСК на токсоплазмоз считают подозрительными по заболеванию.
Диагноз на токсоплазмоз устанавливают в соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диагностике токсоплазмоза животных», утвержденными ГУВ МСХ СССР 21 января 1985 года.
2.7.6. При появлении неспецифической реакции или установлении слабой активности антигена или сывороток применение набора данной серии прекращают и в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (Минсельхоза России) от 8 мая 192 г. № 22-7/28 «О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемые по импорту» сообщают об этом Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5), ЦНПВЛ (116622, Москва, ул. Оранжерейная, 23) и предприятию-изготовителю.
Одновременно в адрес института при наличие невскрытых наборов данной серии один набор направляют с нарочным.
С утверждением настоящего Наставления на территории Российской Федерации не действует «Наставление по применению набора для диагностики токсоплазмоза животных в РСК (РДСК)», утвержденное Главным управлением ветеринарии Государственного агропромышленного комитета СССР 22 апреля 1986 г.
Рекомендовано к регистрации Советом по ветеринарным препаратам 10 октября 1996 г., протокол № 5, ПВР 1.05.0333-96.