Наставление по применению набора компонентов для диагностики вирусной диареи — болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа

(утв. Минсельхозпродом России 15.07.1997 № 13-7-2/1012)

Утверждено 15 июля 1997 г. № 13-7-2/1012

1.1. Набор для иммуноферментной диагностики вирусной диареи крупного рогатого скота применяют для обнаружения антигена вируса диареи — болезни слизистых в исследуемом материале.

1.2 Набор рассчитан на исследование 168 проб материала и содержит следующие компоненты:

• антиген специфический лиофилизированный 0,2 мл, 1 ампула (N 1);
• антиген отрицательный лиофилизированный 0,2 мл, 1 ампула (N 2);
• иммуноглобулины антивирусные, лиофилизированные 1,0 мл, 2 ампулы (N 3);
• конъюгат иммуноферментный лиофилизированный 1,0 мл, 2 ампулы (N 4);
• 5-аминосалициловая кислота лиофилизированная 1,0 мл, 2 ампулы (N 5);
• гидроперит 1,0 мл, 2 ампулы (N 6);
• детергент (твин-80 или твин-20) 1,0 мл, 1 ампула (флакон) (N 7);
• фосфатно-буферный раствор 0,01 М 20 мл, 1 флакон (N 8);
• натрий хлористый 11,6 г., 1 флакон (N 9);
• плашки полистироловые, 2 шт.

1.3. Биологические компоненты набора представляют собой сухую гомогенную аморфную массу, белого с сероватым оттенком цвета. При добавлении в ампулы дистиллированной воды в объеме, равном объему до высушивания, содержимое должно раствориться в течение 1...2 мин и представлять собой прозрачную и слегка опалесцирующую жидкость.

Химические компоненты набора. 5-аминосалициловая кислота должна представлять собой сухую гомогенную аморфную массу фиолетово-коричневого цвета; фосфатно-буферный раствор — прозрачная бесцветная жидкость: гидроперит и хлористый натрий должны представлять собой сыпучий неоднородный порошок, содержащий гранулы разных размеров белого цвета; твин-80 или твин-20 — вязкая тягучая маслянистая жидкость соломенно-желтого цвета.

1.4. На ампуле и флаконе с каждым компонентом должна быть этикетка с указанием краткого названия компонента и его номера, количества препарата, номера серии и даты изготовления.

1.5. Этикетированные ампулы и флаконы укладывают в коробки по ГОСТ 12301, представляющие собой наборы компонентов для обнаружения антигена вируса диареи-БС крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа. В каждую коробку с набором вкладывают наставление по применению.

1.6. На каждую коробку с набором компонентов для диагностики ВД-БС наклеивают этикетку, на которой указывают наименование предприятия-изготовителя, полное название набора, перечень компонентов, входящих в набор, количество ампул (флаконов) каждого компонента, количество препарата в каждой ампуле (флаконе), номер серии набора, номер контроля, дату изготовления (месяц, год), срок годности, условия хранения и обозначение настоящих ТУ.

1.7. Срок годности набора компонентов — 12 мес. при соблюдении условий хранения в сухом темном месте при температуре 4...8 °C. Допускается хранение при минусовой температуре.

1.8. При отсутствии маркировки этикетки, нарушении целостности ампул (флаконов), изменении цвета и консистенции содержимого, наличии хлопьев и посторонних примесей при растворении, а также при неполном растворении компоненты бракуют.

2. Взятие и подготовка материала.

2.1. В качестве испытуемого материала используют слизистую носовой перегородки, миндалины, трахею, пораженные (изъязвления, воспаления) участки слизистой оболочки носа, толстого и тонкого кишечника. От больных в острой стадии заболевания животных берут пробы носовой слизи при ринитах и фекалии при поносах.

2.2. Для получения 25...50%-ной суспензии кусочки материала тщательно измельчают ножницами и растирают в фарфоровой ступке до образования кашицеобразной однородной массы. Полученную суспензию промораживают в течение 18...20 ч при -20 °C, оттаивают и осветляют центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость сливают в стерильную посуду, добавляют антибиотики (пенициллин, стрептомицин по 1000 ЕД/мл), инкубируют при 4 °C в течение 2...3 ч и используют для исследования. Допускается хранение проб в замороженном состоянии.

3. Подготовка компонентов набора для постановки реакции.

3.1. Растворение и разведение иммуноглобулинов и других компонентов реакции проводят на 0,01 М калий-фосфатном буфере (pH 7,2...7,4), для приготовления которого содержимое флаконов № 8 (0,01 М калий-фосфатный буфер) и № 9 (натрий хлористый) растворяют в 2 л дистиллированной воды и хранят при 4...8 °C в течение месяца (ФБР).

3.2 Содержимое ампулы с иммуноглобулинами растворяют в 10 мл ФБР.

3.3. Содержимое ампул со специфическим и отрицательным антигенами растворяют в 0,2 мл ФБР каждую, разливают по 0,1 мл и хранят в замороженном состоянии до использования в реакции.

3.4. Для промывания плашек и разведения компонентов при постановке реакции готовят ТФБР: к 1 л ФБР добавляют 0,5 мл твина-20 или твина-80 (флакон № 7) и перемешивают до полного растворения.

3.5. Содержимое ампулы с иммуноферментным конъюгатом растворяют в 10 мл ФБР.

3.6. Субстратную смесь готовят непосредственно перед использованием в реакции следующим образом. Содержимое ампулы с 5-аминосалициловой кислотой (N 5) растворяют в 10 мл подогретой до 30...40 °C дистиллированной воды, охлаждают и вносят в полученный раствор содержимое ампулы с гидроперитом (N 6).

4. Постановка реакции.

4.1. На первом этапе реакции разведенные иммуноглобулины (п. 3.2) вносят по 0,1 мл в лунки полистироловой плашки, закрывают крышкой, инкубируют в течение 2 ч при 36...37 °C и затем 18 ч при 4 °C. Удаляют раствор иммуноглобулинов и 3...4 раза отмывают лунки ТФБР.

4.2. На втором этапе реакции во все лунки плашки вносят по 0,1 мл ТФБР. При качественной реакции (ответ «да» или «нет») в первую лунку первого ряда вносят 0,1 мл испытуемой пробы, пипетируют и 0,1 мл раствора удаляют и т.д. В одну из лунок вносят 0,1 мл специфического антигена, пипетируют и 0,1 мл смеси удаляют. Таким же образом вносят отрицательный антиген. Плашки инкубируют в термостате 1,5...2 ч при 36...37 °C и затем отмывают лунки плашки от несвязавшихся антигенов.

4.3. Иммуноферментный конъюгат вносят по 0,1 мл в отмытые лунки плашек, инкубируют в термостате при 36...37 °C 1,5...2 ч и вновь трижды отмывают раствором ТФБР.

4.4. Затем в лунки вносят по 0,1 мл субстратной смеси, которую готовят непосредственно перед использованием в реакции.

4.5. Результат реакции учитывают через 40...60 мин по изменению окраски образовавшегося реакционного продукта.

5. Учет результатов.

5.1. Результаты реакции учитывают через 40...60 мин визуально по появлению окраски образовавшегося реакционного продукта от коричневого до светло-коричневого цвета.

5.2 Оценку достоверности присутствия специфического антигена проводят по схеме:

• интенсивное коричневое окрашивание, коричневое окрашивание — положительный результат;
• светло-коричневое окрашивание — сомнительный результат;
• окрашивание отсутствует или находится на уровне отрицательного контроля — отрицательный результат.

6. Порядок предъявления рекламаций.

6.1. В случае несоответствия препарата предъявляемым требованиям, снижения активности и специфичности применение данной серии прекращают и, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии Минсельхоза России от 8 мая 1992 г. № 22-7/28 «О порядке предъявления рекламаций на ветпрепараты отечественного производства и закупаемых по импорту», сообщают об этом предприятию-изготовителю, Всероссийскому государственному научно-исследовательскому институту контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5) и ЦНПВЛ.

При наличии невскрытых наборов одновременно с этим в институт направляют нарочным 1 набор. Образцы препарата транспортируют с соблюдением условий хранения препарата.

С утверждением настоящего Наставления не действует Временное наставление по применению «Набора компонентов для диагностики вирусной диареи — болезни слизистых крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа» за № 22-7/81, утвержденное Главным управлением ветеринарии 20 августа 1992 г.

---