Наставление по применению набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) методом иммуноферментного анализа (ИФА)-Veri Test

(утв. Минсельхозом России 02.02.2004 № 13-5-02/0899)

Утверждено 2 февраля 2004 г. № 13-5-02/0899

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЛКРС) МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИФА)-VERI TEST

1. Общие положения.

1.1. Набор предназначен для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в сыворотке крови и в молоке крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа (ИФА).

1.2 Набор включает следующие компоненты:

• две полистироловые 96-луночные микропанели с адсорбированными в лунках специфическим антигеном gp51 ВЛКРС (нечетные ряды) и контрольным отрицательным антигеном (четные ряды);

положительные контроли:

• флакон № 1: специфическая сыворотка крови, содержащая антитела к gp51 ВЛКРС — прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета, 0,1 см3 — 1 флакон;
• флакон № 3: молоко, содержащее антитела к gp51 ВЛКРС, — жидкость белого цвета, 2,5 см3 — 1 флакон;

отрицательные контроли:

• флакон № 2: нормальная сыворотка крови — прозрачная жидкость соломенно-желтого цвета, 0,1 см3 — 1 флакон;
• флакон № 4: молоко, не содержащее антител к gp51 ВЛКРС, — жидкость белого цвета, 2,5 см3 — 1 флакон;
• флакон № 5: промывочный буфер (ФСБТ, фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,05% твина) — концентрированный 20-кратный раствор — бесцветная прозрачная жидкость, 25 см3 — 3 флакона; или таблетка, рассчитанная на 500 см3 буфера, — 4 шт.;
• флакон № 6: буфер для разведения образцов (БР) — бесцветная прозрачная жидкость, 20 см3 — 1 флакон;
• флакон № 7: конъюгат (моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой), лиофильно высушенный, — 2 флакона, каждый из которых содержит таблетку белого цвета;
• флакон № 8: субстрат — раствор тетраметилбензидина (ТМБ), содержащий перекись водорода, бесцветная прозрачная жидкость, 20 см3 — 1 флакон;
• флакон № 9: стоп-раствор, раствор для остановки реакции — бесцветная прозрачная жидкость, содержащая H2SO4, 10 см3 — 1 флакон.

1.3. На флаконах с компонентами должны быть этикетки с указанием предприятия-изготовителя и его товарного знака, наименования компонента, количества во флаконе, номера серии, даты изготовления (месяц, год).

1.4. Компоненты набора упаковывают в картонные коробки с наличием гнезд или перегородок, обеспечивающих целостность флаконов. На коробке должна быть этикетка с указанием наименования и товарного знака предприятия-изготовителя, полного названия набора, номера серии и контроля набора, срока годности, условий хранения и обозначения ТУ.

1.5 В каждую коробку вкладывают наставление по применению набора.

1.6. Набор рассчитан на анализ 44 испытуемых проб на каждой микропанели.

1.7. Срок годности компонентов набора — 12 мес. с даты изготовления при хранении их в защищенном от света месте при температуре от 2 до 8 °C. Не допускается замораживание компонентов!

1.8. Флаконы без этикеток, с нарушением целостности, изменением консистенции или цвета подлежат выбраковке.

2. Принцип метода.

2.1. Антиген gp51 ВЛКРС, иммобилизованный на поверхности лунок полистироловой микропанели с помощью специфических моноклональных антител, связывается с антителами, присутствующими в исследуемом материале, формируя при этом комплекс антиген — антитело. Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с антивидовым конъюгатом (моноклональные антитела к IgG крупного рогатого скота, меченные пероксидазой), фермент которого после добавления субстрата вызывает разложение субстрат-индикаторного раствора и образование окрашенного продукта. При этом интенсивность окраски в лунке микропанели пропорциональна содержанию ВЛКРС-специфических антител в исследуемой пробе.

3. Порядок применения.

3.1. Для исследования в лабораторию доставляют из хозяйств индивидуальные сыворотки крови крупного рогатого скота или пробы молока объемом 0,3...0,5 см3. Сыворотки можно хранить при температуре 4 °C не более 3 сут или при температуре -20 °C в течение 50...60 сут. Перед проведением ИФА молоко центрифугируют в течение 15 мин при 2000...3000 об/мин для удаления липидов.

Для постановки ИФА необходимы одно- и многоканальные автоматические микропипетки разных объемов со сменными наконечниками, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода, спектрофотометр (ридер) с фильтром на 450 нм.

Перед началом работы микропанели и все компоненты набора выдерживают 20...30 мин при комнатной температуре (18...25 °C). Неиспользованные реагенты убирают в холодильник (2...8 °C) сразу же после проведения исследования.

3.2 Приготовление рабочих растворов реагентов.

3.2.1. ФСБТ. Концентрированный раствор буфера (флакон № 5) разводят в 20 раз дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для этого содержимое одного флакона концентрата (25 см3) переносят в мерную колбу и добавляют в нее 475 см3 воды. Если в концентрате присутствуют кристаллы, то его перед разведением нагревают и тщательно взбалтывают.

3.2.2. Конъюгат. Во флакон № 7 осторожно добавляют 10,5 см3 рабочего раствора ФСБТ, выдерживают 1 мин и тщательно перемешивают, сильно не взбалтывая. Готовят непосредственно перед использованием.

Все остальные компоненты набора готовы к употреблению.

3.3 Постановка реакции.

3.3.1. Во все используемые лунки микропанели вносят по 100 мкл БР (флакон № 6), затем в эти лунки вносят контрольные и испытуемые пробы, используя для каждого образца новый наконечник.

а) Для исследования сывороток крови крупного рогатого скота берут по 4 мкл положительной, отрицательной и испытуемых сывороток и вносят их в соответствующие лунки, сенсибилизированные специфическим антигеном gp51 ВЛКРС (нечетные ряды) и контрольным отрицательным антигеном (четные ряды);

б) для исследования молока крупного рогатого скота берут по 100 мкл положительной, отрицательной и испытуемых проб молока и вносят их в соответствующие лунки, сенсибилизированные специфическим антигеном gp51 ВЛКРС (нечетные ряды) и контрольным отрицательным антигеном (четные ряды).

После внесения проб содержимое лунок тщательно перемешивают, микропанель помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и инкубируют 1 ч при 37 °C или 4 ч при комнатной температуре (18...25 °C).

3.3.2. После инкубации лунки освобождают от содержимого резким встряхиванием и трижды промывают ФСБТ, каждый раз полностью заполняя лунки буфером и вытряхивая содержимое. Затем микропанель подсушивают постукиванием по сложенной в несколько слоев фильтровальной бумаге.

3.3.3. Во все используемые лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора конъюгата (п. 3.2.2), микропанель помещают в пластиковый пакет или накрывают крышкой и выдерживают 1 ч при 37 °C.

3.3.4. После инкубации проводят процедуру промывания лунок по п. 3.3.2.

3.3.5. Во все используемые лунки микропанели вносят по 100 мкл раствора субстрата (флакон № 8) и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.

3.3.6. Реакцию останавливают добавлением в каждую используемую лунку по 50 мкл стоп-раствора (флакон № 9).

4. Учет и интерпретация результатов реакции.

4.1 Визуальный учет.

4.1.1. Все лунки с адсорбированным контрольным отрицательным антигеном (четные ряды) должны оставаться бесцветными (до и после остановки реакции).

4.1.2 Реакция в лунках с адсорбированным специфическим антигеном gp51 ВЛКРС (нечетные ряды) должна быть следующей:

• лунки с внесенным положительным контролем должны иметь сине-голубое окрашивание до остановки реакции (желтое после остановки реакции);
• лунки с внесенным отрицательным контролем должны оставаться бесцветными (до и после остановки реакции);
• лунки с исследуемыми образцами, в которых присутствуют специфические антитела, должны иметь сине-голубое окрашивание до остановки реакции (желтое после остановки реакции) различной интенсивности в зависимости от уровня антител.

Реакцию считают положительной, когда заметна четкая разница в интенсивности окрашивания лунок с исследуемыми образцами и лунок с отрицательным контролем.

4.2 Инструментальный учет.

Для проведения инструментального учета сразу же после остановки реакции проводят измерение оптической плотности (ОП) продукта в каждой лунке на спектрофотометре (ридере) с вертикальным лучом света при длине волны 450 нм.

Далее проводят оценку результатов ИФА.

4.2.1. На первом этапе вычисляют окончательный показатель ОП каждой пробы (ОП пробы) по разнице между ОП пробы в лунках со специфическим и контрольным антигенами:

ОП пробы = ОП специфический антиген gp51 ВЛКРС -

• ОП контрольный отрицательный антиген.

Предварительно проводят оценку ОП отрицательного и положительного контролей, входящих в состав набора. Результаты реакции считаются достоверными и могут быть учтены, если контрольные показатели соответствуют следующим критериям:

• ОП отрицательного контроля < 0,1;
• ОП положительного контроля > 1,0.

Если полученные значения не соответствуют вышеуказанным критериям, результаты ИФА считаются недостоверными и реакцию повторяют.

Если \Delta\text{ОП} отрицательного и положительного контролей соответствуют вышеуказанным критериям, то далее проводят оценку результатов реакции в лунках с испытуемыми пробами, вычисляя \Delta\text{ОП} для каждой.

4.2.2. Относительное содержание антител к ВЛКРС в исследуемых образцах, выраженное в международных ИФА единицах (EU), определяют по отношению значения \Delta\text{ОП} испытуемой пробы к значению \Delta\text{ОП} положительного контроля по формуле

где 100 является EU положительного контроля.

Интерпретацию результатов ИФА проводят с использованием таблицы 14.

Таблица 14

Исследуемый материал	Значения EU	Интерпретация результата
Сыворотка крови	Менее 10	Отрицательная реакция
	>= 10	Положительная реакция
Молоко	Менее 6	Отрицательная реакция
	>= 6	Положительная реакция

Пример расчета содержания антител к ВЛКРС в испытуемых образцах:

Контрольные показатели \Delta\text{ОП} 450 нм: отрицательного контроля — 0,001; положительного контроля — 2,306. Все показатели соответствуют требуемым критериям. \Delta\text{ОП} 450 нм испытуемых сывороток: № 1 — 2,200 и № 2 — 0,010.

EU (1) = 2,200/2,306·100 = 95,4;

EU (2) = 0,010/2,306·100 = 0,4.

Таким образом, в исследуемой пробе сыворотки крови № 1 установлен высокий уровень антител к ВЛКРС (положительная реакция), в сыворотке крови № 2 специфических антител нет, что является отрицательным результатом ИФА.

При получении сомнительного результата (например, значение EU в сыворотке крови равно 9 или 11) рекомендуется повторить реакцию и провести исследование пробы в двух параллельных лунках.

5. Меры предосторожности.

5.1. Работу с химическими компонентами набора следует проводить с соблюдением правил техники безопасности. При попадании их на кожу или слизистые оболочки рекомендуется промывать пораженное место большим количеством водопроводной воды.

5.2. Использованные микропанели обеззараживают раствором хлорамина или другими сильными окислителями.

5.3. Запрещается прием пищи и воды, курение в помещении, где проводятся работы с компонентами набора.

5.4. Следует помнить, что ИФА является высокочувствительным методом, поэтому ошибки, связанные с внесением образцов, проведением инкубационного, температурного и промывочного режимов, могут быть причиной получения недостоверных результатов.

6. Порядок предъявления рекламаций.

6.1. Рекламации на качество компонентов набора в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии «О порядке предъявления рекламаций на ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по импорту» № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. направляют предприятию-изготовителю (123099, г. Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО «НАРВАК»), Всероссийскому государственному Центру качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ) и Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории (111622, Москва, ул. Оранжерейная, 23, ЦНМВЛ). При наличии невскрытых наборов данной серии один набор направляют в ВГНКИ.

Наставление по применению набора разработано НПО «НАРВАК».

Одобрено методической комиссией ФГУ ВГНКИ 27 января 2004 г., протокол № 1, ПВР-1-1.4/01326.

---