---
title: "\"Наставление по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных\""
number: "13-5-02/0050"
issuer: "Министерство сельского хозяйства Российской Федерации"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/nastavlenie-13-5-020050"
---
## "Наставление по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных"
# "Наставление по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных"
(утв. Минсельхозом России 05.04.2001 N 13-5-02/0050)
> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации (п. п. 53, 198, 311), разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).
> Взамен "[Наставления](https://bukva.ai/docs/instruktsiya-o-meropriyatiyah-po-profilaktike-i-minselhoz-sssr-ministerstvo-9#p100049) по диагностике паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота" (приложение N 1 к Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза), утв. ГУВ Минсельхоза СССР 18.08.1975, "Наставления по аллергической диагностике паратуберкулеза у овец", утв. ГУВ Минсельхоза СССР 11.08.1981, "Временного наставления по постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института", утв. ГУВ Минсельхоза СССР 31.05.1968.
> [!NOTE]
> ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
```mermaid
flowchart LR
n0["Инструкция по борьбе с паратуберкулезным... (от 10.01.1940)"]:::rst
click n0 "https://bukva.ai/docs/instruktsiya-po-borbe-s-paratuberkuleznym" "Инструкция по борьбе с паратуберкулезным энтеритом крупного рогатого скота (утв. Наркомземом СССР, Наркомсовхозов СССР 10.01.1940)"
n1["Инструкция о мероприятиях по профилактике... (от 18.08.1975)"]:::doc
click n1 "https://bukva.ai/docs/instruktsiya-o-meropriyatiyah-po-profilaktike-i-minselhoz-sssr-ministerstvo-9" "Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота (утв. Минсельхозом СССР 18.08.1975)"
n2["Наставление по диагностике паратуберкулеза... (от 05.04.2001 N 13-5-02/0050)"]:::doc
click n2 "https://bukva.ai/docs/nastavlenie-13-5-020050" "Наставление по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных (утв. Минсельхозом России 05.04.2001 N 13-5-02/0050)"
n1 --> n2
n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
```
Утверждаю
Заместитель руководителя
Департамента Ветеринарии
Е.А.НЕПОКЛОНОВ
5 апреля 2001 г. N 13-5-02/0050
НАСТАВЛЕНИЕ ПО ДИАГНОСТИКЕ ПАРАТУБЕРКУЛЕЗА
**(ПАРАТУБЕРКУЛЕЗНОГО ЭНТЕРИТА) ЖИВОТНЫХ**
## 1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
1.1. Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит, болезнь Johne) - инфекционная, хронически протекающая болезнь жвачных, преимущественно, крупного и мелкого рогатого скота, верблюдов, северных оленей, вызываемая Mycobacterium paratuberculosis и характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов.
Болезнь протекает, в основном, в латентной форме, при переходе в клиническую стадию сопровождается диареей, анемией, истощением и заканчивается, как правило, гибелью животных.
1.2. У зараженных животных развивается состояние повышенной чувствительности (сенсибилизация) к туберкулину для птиц и в крови появляются специфические антитела.
1.3. Исследование на паратуберкулез в благополучных хозяйствах проводят при обнаружении у животных признаков, вызывающих подозрение на заболевание, в неблагополучных хозяйствах - для выявления больных животных.
Диагноз на паратуберкулез устанавливают на основании результатов клинического осмотра животных, аллергического, серологического, бактериоскопического, патологоанатомического и гистологического методов исследования с учетом эпизоотологических данных.
#### 1.4 Диагноз на паратуберкулез считается установленным:
- при наличии у животных характерных клинических признаков болезни и получении одновременно положительных результатов бактериоскопического или гистологического исследования биоматериала от этих животных;
- при обнаружении характерных патологоанатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах животных с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением болезни, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков заболевания.
#### 1.5 В неблагополучных по паратуберкулезу хозяйствах (стадах, фермах, дворах) больными считают животных:
Крупный рогатый скот:
- с выраженными клиническими признаками болезни независимо от результатов аллергического и серологического исследований;
- при слабо выраженных клинических признаках болезни и одновременно положительном результате серологического или бактериоскопического исследования;
- при отсутствии клинических признаков, но совпадающих положительных результатах аллергического и серологического исследований.
Овцы и козы:
- при наличии клинических признаков болезни, или при положительных результатах аллергического и серологического, или бактериоскопического исследования.
Верблюды:
- при наличии клинических признаков болезни и при положительном результате аллергического или бактериоскопического исследования.
Северные олени:
- при наличии клинических признаков болезни и положительном результате, бактериоскопического исследования.
## 2. КЛИНИЧЕСКИЙ ОСМОТР
2.1. У крупного рогатого скота клинические признаки болезни проявляются в возрасте не ранее 3 лет в виде диареи и истощения, у дойных коров наблюдается снижение молочной продуктивности.
По мере развития болезни резко снижается упитанность при сохранении аппетита, глаза западают в глазных впадинах, возникает диарея, в начале перемежающаяся, а затем все более стойкая и изнуряющая. Вследствие постоянных сильных потуг позвоночник изгибается, мышцы таза атрофируются ("шилозадость"). Фекалии жидкие, зеленовато-желтые или коричневые, с пузырьками газа и слизью, иногда с кровью, зловонного запаха. При параличе сфинктера прямой кишки дефекация происходит самопроизвольно, загрязняются хвост, вымя, тазовые конечности. Часто наблюдаются отеки в подчелюстном пространстве и в области подгрудка, взъерошенность волосяного покрова.
2.2. У овец и коз клинические признаки болезни развиваются медленно, основными из них являются сильное истощение при нормальном аппетите с возможным развитием перемежающейся диареи. При отсутствии диареи фекалии менее плотные и не формируются в шарики. Отмечаются подтянутость живота, бледность слизистых оболочек, отеки подчелюстного пространства, подгрудка и живота.
При выраженных клинических признаках животное погибает.
2.3. У верблюдов клинические признаки болезни проявляются, в основном, в возрасте 1 - 3 лет и характеризуются диареей, сильным истощением, синюшностью слизистых оболочек, тусклостью волосяного покрова, вздутием живота, увеличением печени. Кал зловонного запаха, темно-коричневого или землистого цвета, с пузырьками газа. Тазовые конечности и хвост испачканы жидкими каловыми массами, анус вывернут.
Повышения температуры тела не наблюдается. Больные животные стонут, часто ложатся.
2.4. У северных оленей клиническое проявление болезни начинается в возрасте 1,5 - 2,5 лет с постепенного исхудания. Больные животные подбирают задние ноги под живот, позднее появляется постоянная или перемежающаяся диарея.
## 3. АЛЛЕРГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
3.1. Аллергическое исследование животных на паратуберкулез проводят сухим очищенным (ППД) туберкулином для птиц.
Аллергическому исследованию подвергают крупный рогатый скот с 6 мес., овец и коз - с 3 мес., верблюдов - с годовалого возраста.
Не разрешается исследовать туберкулиновой пробой животных в течение трех недель после вакцинации.
3.2. Крупному рогатому скоту ППД-туберкулин применяют в дозе 2500 МЕ в 0,2 мл раствора. Для этого содержимое флакона с туберкулином (500 000 МЕ) растворяют в двух флаконах растворителя микобактериальных аллергенов.
В месте инъекции волос выстригают, кожу дезинфицируют 70% этиловым спиртом. Раствор туберкулина вводят животным (кроме быков) внутрикожно в середине шеи, быкам - в подхвостовую складку.
Для внутрикожного введения туберкулина используют безыгольные инъекторы или шприцы с бегунком вместимостью 1 - 2 мг и иглы для внутрикожных инъекций.
Учет и оценку реакции проводят через 72 часа, при этом у каждого животного прощупывают место введения туберкулина. При обнаружении припухлости измеряют кутиметром толщину кожной складки в месте инъекции и определяют величину ее утолщения в миллиметрах сравнением с толщиной складки неизмененной кожи вблизи от места введения туберкулина.
Реагирующими на туберкулин считают животных при образовании отечной болезненной припухлости и при утолщении кожной складки на 6 мм и более.
3.3. Овцам и козам ППД-туберкулин применяют в дозе 5 000 МЕ в 0,2 мл раствора. Для этого содержимое флакона с туберкулином (500 000 МЕ) растворяют в одном флаконе растворителя микобактериальных аллергенов.
Раствор туберкулина вводят только шприцем с бегунком вместимостью 1 - 2 мл и иглами для внутрикожных инъекций в толщу нижнего века, отступя от его края на 1,5 - 2 см. Место инъекции предварительно дезинфицируют 70% этиловым спиртом.
Учет и оценку реакции проводят через 48 часов, при этом у каждого животного прощупывают место введения туберкулина и сравнивают веки левого и правого глаза.
Реагирующими на туберкулин считают животных при образовании ощутимой припухлости в месте введения препарата.
3.4. Верблюдам ППД-туберкулин вводят, как овцам и козам, в дозе 5 000 МЕ в 0,2 мл раствора. Туберкулин вводят безыгольным инъектором или шприцем с бегунком вместимостью 1 - 2 мл и иглами для внутрикожных инъекций в кожу бесшерстного участка брюшной стенки в области паха на уровне горизонтальной линии седалищного бугра. Место инъекции предварительно дезинфицируют 70% этиловым спиртом.
Учет и оценку реакции проводят через 72 часа, при этом у каждого животного прощупывают место введения туберкулина. При обнаружении припухлости измеряют кутиметром толщину кожной складки и определяют величину ее утолщения в миллиметрах сравнением с толщиной складки неизмененной кожи вблизи от места инъекции препарата.
Реагирующими считают животных при образовании отечной болезненной припухлости и утолщении кожной складки на 7 мм и более.
## 4. СЕРОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Серологическую диагностику паратуберкулеза осуществляют у крупного и мелкого рогатого скота с помощью реакции связывания комплемента (РСК).
#### 4.1 Компоненты реакции:
- сыворотка крови обследуемых животных свежая или консервированная;
- антиген паратуберкулезный для РСК;
- сыворотка паратуберкулезная для РСК (позитивная);
- сыворотка крови здорового крупного или мелкого рогатого скота (негативная);
- комплемент сухой для РСК;
- сыворотка гемолитическая для РСК (гемолизин);
- эритроциты барана, 2,5% взвесь;
- раствор физиологический, pH 6,8 - 7,2 (физраствор).
4.1.1. Неконсервированная сыворотка крови пригодна для исследования в течение 5 суток со дня взятия крови с сохранением ее при температуре от 4 °C до 8 °C.
Сыворотка, консервированная кристаллами борной кислоты до насыщения, пригодна для исследования в течение 10 суток.
Мутные, проросшие, гемолизированные пробы сыворотки крови исследованию не подлежат.
Испытуемые пробы сыворотки крови, а также позитивную и негативную сыворотки, разводят физраствором 1:10 и инактивируют в течение 30 мин., крупного рогатого скота - при температуре 59 - 60 °C, овец и коз - при температуре 63 - 64 °C.
4.1.2. Антиген паратуберкулезный для РСК приготавливают к реакции в соответствии с наставлением по его применению и используют в рабочем разведении 1:100. Для получения рабочего разведения один объем антигена из ампулы переносят сухой мерной пипеткой на дно сухой колбы и добавляют по каплям 90 объемов физраствора при постоянном покачивании колбы. Растворенный антиген оставляют для созревания на 20 - 30 мин. при комнатной температуре. Затем по стенке колбы при постоянном перемешивании вносят 90 объемов физраствора.
4.1.3. Для получения взвеси эритроцитов дефибринированную или консервированную кровь барана центрифугируют в течение 10 мин при 2500 - 3000 об/мин и отмывают эритроциты физраствором с помощью двух-четырехкратного центрифугирования при таком же режиме до полного обесцвечивания надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость сливают, из осадка эритроцитов готовят 2,5% взвесь на физиологическом растворе.
4.1.4. Сыворотку гемолитическую для РСК используют в реакции в удвоенном титре (при титре гемолизина 1:1500 готовят разведение 1:750, при титре 1:1750 - разведение 1:875 и т.д.).
4.1.5. Из полученной 2,5% взвеси эритроцитов и раствора гемолизина в удвоенном титре готовят гемолитическую систему путем смешивания этих компонентов в равных объемах. Для этого в колбу со взвесью эритроцитов медленно вливают раствор гемолизина при постоянном перемешивании содержимого, затем гемосистему выдерживают в водяной бане при 37 - 38 °C в течение 20 мин.
##### 4.1.6 Приготовление рабочего раствора комплемента.
Титрование комплемента проводят в гемолитической системе перед каждой постановкой реакции. Отбирают необходимое для данного объема количество ампул (флаконов) с комплементом (из примерного расчета одна ампула или флакон комплемента на 250 пробирок реакции объемом 1,0 мл), растворяют препарат в физрастворе, количество которого указано на ампуле (флаконе), сливают в одну емкость и осторожно перемешивают. Таким образом получают основной раствор комплемента, который хранят при температуре от 4 °C до 8 °C до постановки реакции.
Для титрования из основного раствора комплемента готовят разведение 1:20, для чего берут 0,1 мл раствора и разводят его 1,9 мл физраствора.
Комплемент в разведении 1:20 разливают в ряд пробирок дозами от 0,02 до 0,20 мл, увеличивая дозу в каждой следующей пробирке на 0,02 мл в соответствии с [таблицей](#p100071).
Схема титрования комплемента
| N п/п | Компоненты реакции | Номера пробирок, дозы компонентов, мл |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 1. | Комплемент в разведении 1:20 | 0,02 | 0,04 | 0,06 | 0,08 | 0,10 | 0,12 | 0,14 | 0,16 | 0,18 | 0,20 |
| 2. | Физраствор | 0,58 | 0,56 | 0,54 | 0,52 | 0,50 | 0,48 | 0,46 | 0,44 | 0,42 | 0,40 |
| 3. | Гемолитическая система | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 | 0,40 |
| Водяная баня 37 - 38 °C на 10 мин. |
| Примерный результат | ЧГ | ЧГ | ЧГ | ЧГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ | ПГ |
Обозначения: ЧГ - частичный гемолиз, ПГ - полный гемолиз.
Затем в пробирки добавляют физраствор до 0,60 мл общего объема жидкости, после чего в каждую пробирку вносят по 0,40 мл гемолитической системы.
Штатив с пробирками встряхивают и помещают в водяную баню при температуре 37 - 38 °C на 10 мин.
Штатив с пробирками извлекают из бани и немедленно проводят учет результатов реакции в проходящем свете.
*Примечание.* Для удобства в работе и получения более точной дозировки вначале можно приготовить необходимые разведения комплемента в десятикратных объемах. Для этого в дополнительный ряд пробирок вносят комплемент, разведенный 1:20, в дозах 0,2; 0,4; 0,6 и т.д. до 2,0 мл и добавляют в каждую пробирку недостающее до 2,0 мл количество физраствора, то есть соответственно 1,8; 1,6; 1,4 мл и т.д. Из каждой пробирки дополнительного ряда переносят по 0,2 мл жидкости в соответствующую пробирку ряда для титрования (из первой пробирки - в первую, из второй - во вторую и т.д.). Данный перенос жидкости можно выполнять аппаратом Флоринского.
Затем в пробирки добавляют физраствор по 0,4 мл и далее продолжают работу как описано выше.
Титром комплемента считают наименьшее его количество (наибольшее разведение), при котором в течение 10 мин. при температуре 37 - 38 °C наступает полный гемолиз 0,2 мл 23% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,2 мг гемолитической сыворотки в общем объеме жидкости 1,0 мл. В примере, представленном в [таблице](#p100071), титр комплемента равен 0,10.
В реакцию берут комплемент в дозе, большей его титра на один интервал (например, при титре 0,10 берут 0,12).
Количество комплемента для постановки реакции определяют по формуле:
$\text{Х } = \frac{\text{Д } \times \text{п}}{20}$ , где
X - количество основного раствора комплемента, необходимое для постановки реакции, мл;
Д - доза комплемента, большая его титра на один интервал, мл;
П - количество пробирок в реакции;
20 - кратность разведения комплемента при титрации.
Например: в реакции должно быть 200 пробирок, титр комплемента (по [табл](#p100071).) равен 0,10. Следовательно, количество основного раствора комплемента для постановки реакции равно:
$\text{Х } = \frac{(0,10 + 0,20) \times 200}{20} = 1,2\text{мл}$
Необходимое количество рабочего раствора комплемента для постановки реакции равно 40 мл (по 0,2 мл рабочего раствора в каждую из 200 пробирок), отсюда - к 1,2 мл основного раствора комплемента следует добавить 38,8 мл физраствора.
#### 4.2 Постановка реакции
Каждую пробу инактивированной сыворотки крови в разведении 1:10 исследуют в двух рядах пробирок с антигеном и без антигена. Для этого в первый и второй ряд пробирок штатива вносят по 0,02 мл испытуемой сыворотки и добавляют по 0,18 мл физраствора, затем в пробирки первого ряда вносят по 0,2 мл рабочего раствора антигена, в пробирки второго ряда - по 0,2 мл физраствора.
Одновременно ставят следующие контроли: позитивная и негативная сыворотки в разведении 1:10 с антигеном и без антигена, антиген без сыворотки, антиген без сыворотки и комплемента, гемсистема с физраствором. Штатив с пробирками встряхивают, и во все пробирки, за исключением пробирки контроля без комплемента, вносят по 0,2 мл рабочего раствора комплемента. Штатив встряхивают и помещают в водяную баню при температуре 37 - 38 °C на 20 мин.
Затем во все пробирки вносят по 0,4 мл гемсистемы, встряхивают и вновь помещают в водяную баню при той же температуре на 20 мин.
Штатив с пробирками извлекают из бани и оставляют при температуре 4 - 8 °C на 14 - 16 час.
#### 4.3 Учет и оценка результатов реакции
Реакцию учитывают по степени гемолиза эритроцитов в крестах, определяемых по шкале гемолиза эритроцитов:
"++++" - полная задержка гемолиза эритроцитов (0% гемолиза);
"+++" - гемолиз 25% эритроцитов;
"++" - гемолиз 50% эритроцитов;
"+" - гемолиз 75% эритроцитов;
"-" - полный гемолиз эритроцитов (100%).
Учитывают результаты РСК проб сыворотки крови в пробирках без антигена. При любой степени задержки гемолиза в пробирке без антигена проба сыворотки крови не учитывается и подлежит повторному исследованию.
Реакцию считают положительной при задержке гемолиза в "+++" или "++++", и сомнительной при реакции в "++". Реакция считается отрицательной при задержке гемолиза в "+" или полном гемолизе эритроцитов. Кровь от животных с сомнительной реакцией исследуют повторно через 2 - 3 недели. При этом животных неблагополучных по паратуберкулезу хозяйств, с сывороткой крови которых получен дважды сомнительный результат РСК, считают положительно реагирующими, а благополучных - отрицательно.
Результаты РСК отмечают в ведомости проб сыворотки крови словами: положительная, отрицательная или сомнительная. В случае получения положительного результата РСК дальнейшие мероприятия проводятся в соответствии с п. 3.3, 5.1.1 и 5.2.1 Правил по профилактике и ликвидации паратуберкулеза животных.
## 5. ПАТОЛОГОАНАТОМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Патологоанатомические изменения при паратуберкулезе обнаруживаются преимущественно в заднем участке тонкого отдела кишечника, реже в толстых кишках, а также в мезентериальных лимфатических узлах.
Степень патологических изменений не всегда соответствует тяжести клинического проявления болезни, а при наличии изменений возбудитель не всегда обнаруживается при бактериоскопическом исследовании материала. Возможны резко выраженные патологические изменения у животных, не имеющих клинических признаков болезни.
5.1. У крупного рогатого скота патологические изменения находят, главным образом, в заднем отрезке тощей и подвздошной кишках. Стенки кишок плотные, утолщены, просвет сужен, на разрезе выступает выраженная продольная и поперечная складчатость слизистой оболочки, отдельные складки гиперемированы, на других поверхность может быть бугристая, покрыта вязкой слизью. В кишках содержится небольшое количество желтоватой жидкости, пищевых масс почти нет. Илеоцекальная заслонка набухшая, темно-вишневого или багрово-красного цвета. В слепой кишке изменения выражены слабее, ободочная кишка поражается редко, в прямой кишке изменений нет. Мезентериальные лимфатические узлы и лимфатические узлы области илеоцекального соединения увеличены, набухшие, на разрезе влажные. Поверхность разреза бело-желтая. Иногда наблюдаются отеки серозной оболочки кишечника и брыжейки. Лимфатические сосуды утолщены.
5.2. У овец и коз в тощей и подвздошной кишках утолщение стенки и складчатость слизистой оболочки отмечается непостоянно, изменения могут быть выражены очень слабо. Серозные оболочки кишечника и брыжейки могут быть отечны, а лимфатические сосуды плотные, в виде тяжей. Мезентериальные лимфатические узлы увеличены, на разрезе сочные, белого или желтовато-белого цвета. В лимфатических узлах могут быть инкапсулированные очаги, иногда обызвествленные.
5.3. У верблюдов изменения сходны с таковыми у крупного рогатого скота, но могут быть более распространенными и тяжелыми. Наблюдается атрофия тонкого отдела кишечника, особенно двенадцатиперстной кишки, стенка которой сильно истончена. Вместе с тем, отмечаются очаговые утолщения стенки тонких кишок и диффузное утолщение стенки всего толстого отдела кишечника. В патологический процесс вовлекаются сычуг и сетка.
Мезентериальные лимфатические узлы сильно увеличены (до размера кулака взрослого человека). У отдельных животных обнаруживают изменения на слизистой оболочке глоточного кольца и гортани, на слизистой сетки в виде плотных узелков. Подчелюстные, заглоточные и паховые лимфатические узлы могут быть также сильно увеличены. В селезенке под капсулой и в толще паренхимы обнаруживают большое количество плотных узелков серо-белого цвета. Печень несколько увеличена, глинистого цвета. Селезенка и печень могут быть пронизаны тяжами.
## 6. БАКТЕРИОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
6.1. Для прижизненного бактериоскопического исследования готовят по 4 - 6 мазков из комочков слизи и обрывков слизистой оболочки кишечника, обнаруживаемых в фекалиях животных, подозреваемых в заболевании.
От убитых или павших животных готовят по 4 - 6 мазков из участков кишечника или мезентериальных лимфоузлов, имеющих изменения, сходные с паратуберкулезными.
6.2. Мазки подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают по методу Циля-Нильсена. Микобактерии паратуберкулеза в мазках представляют собой мелкие тонкие палочки красного цвета, располагающиеся кучками, частоколами по три и более.
6.3. При обнаружении хотя бы в одном из мазков красных палочек характерного строения и расположения, результаты бактериоскопии считают положительными.
В случае отсутствия в мазках красных палочек, или при обнаружении единичных, отдельно лежащих палочек, результаты бактериоскопии считают отрицательными.
## 7. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Лабораторный диагноз на паратуберкулез ставят на основании положительных результатов бактериоскопического и гистологического исследования. При необходимости проводят бактериологическое исследование.
7.1. Кусочки лимфатических узлов и отдельно соскобы (ткань) слизистой оболочки и подслизистого слоя кишечника в количестве 4 - 5 г измельчают ножницами на кусочки по 2 - 3 мм, помещают в разные стерильные ступки, покрытые стерильной, пергаментной бумагой. Лимфатические узлы заливают 3% раствором серной кислоты в соотношении 1:10, а слизистую оболочку кишечника 6% раствором этой же кислоты и выдерживают 10 - 15 минут. Затем раствор кислоты сливают, а материал заливают в зависимости от концентрации серной кислоты на 5 или 10 минут соответственно стерильным физиологическим раствором в таком же объеме. Физиологический раствор сливают, кусочки материала растирают и суспендируют в небольшом количестве стерильного физиологического раствора.
Материал высевают на одну из следующих питательных сред с добавлением 2% фактора роста (экстракта из M. phlei): модифицированную казеиновую среду Дюбо-Смита, яичные среды Петраньяни, Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-ЗЛ. Посевы выдерживают в термостате при 38 +/- 0,5 °C в течение 3 мес.
При сильном обсеменении тканей M. paratuberculosis рост возбудителя появляется через 18 - 20 суток, при слабом - через 45 - 90. Культуры вырастают в виде мельчайших плоских колоний светло-кремового или светло-желтого цвета с неровными краями. В дальнейшем они увеличиваются и принимают бугристый вид.
Для идентификации выделенную культуру высевают на вышеуказанные среды с фактором роста и без него. Возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста.
Микобактерии паратуберкулеза не патогенны для лабораторных животных.
#### 7.2 Питательные среды для бактериологического исследования.
Приготовление спиртового экстракта M. phlei по методу Смита (модификация ВГНКИ)
M. phlei выращивают на синтетической питательной среде Сотона или 2А в течение 10 - 14 суток до получения пышного роста на поверхности среды. Затем культуру отделяют от жидкой части среды путем пропускания через двойной бумажный фильтр, промывают 2 - 3 раза стерильной дистиллированной водой, отжимают фильтровальной бумагой, обрабатывают в аппарате Коха 30 мин. при 80 °C и подсушивают в термостате и течение 10 - 12 часов.
Высушенную культуру микобактерий в количестве 20 г помещают в стерильную ступку и тщательно растирают, затем приливают 150 мл этилового спирта. Полученную смесь переливают в круглодонную колбу и проводят спиртовую экстракцию фактора роста (микобактина) кипячением на водяной бане с обратным холодильником. Полученный экстракт (примерно 100 - 130 мл) ярко-желтого цвета сливают в сборную колбу, а к биомассе дважды приливают по 150 мл спирта и отгонку повторяют. Полученный экстракт (300 - 350 мл) оставляют на ночь для осаждения, на следующий день надосадочную жидкость пропускают через бумажный фильтр и сливают в колбу. Затем проводят отгонку спирта из экстракта путем кипячения в водяной бане с прямым холодильником. Полученную вязкую красновато-оранжевую жидкость (объемом примерно 3 - 6 мл) смешивают с 50% раствором глицерина из расчета: к 2 мл "концентрата" приливают 40 мл глицерина. Устанавливают pH - 7,6, жидкость прогревают в кипящей водяной бане 10 мин., затем горячий раствор переливают в делительную воронку и оставляют на ночь.
На следующий день из делительной воронки сливают нижнюю светлую часть жидкости (pH - 7,0), разливают в ампулы и стерилизуют при 120 °C в течение 20 мин. Экстракт (микобактин) хранится длительное время.
Синтетическая среда Сотона (ингредиенты и приготовление)
Аспарагин - 5 г
Аммоний лимоннокислый двузамещенный - 2 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 5 г
Магний сернокислый - 0,5 г
Железо сернокислое закисное - 0,05 г
Глицерин - 50 мл
Лимонная кислота - 4 г
Цинк сернокислый - 0,1 г
Дистиллированная вода - до 1 л
В дистиллированной воде, подогретой до 70 - 80 °C, последовательно растворяют аспарагин, аммоний лимоннокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, сернокислый магний, железо сернокислое закисное, глицерин. Затем добавляют водный 25% раствор аммиака до pH - 7,0 и кипятят 1 час, после чего добавляют лимонную кислоту и сернокислый цинк, аммиаком устанавливают pH 7,2 - 7,3. Питательную среду охлаждают до 50 °C, пропускают через бумажный фильтр, разливают в 0,5 литровые флаконы и стерилизуют при 120 °C в течение 30 мин.
Среда 2А (ингредиенты и приготовление)
Аспарагин - 5 г
Сернокислая магнезия - 0,5 г
Калия фосфат двузамещенный - 1,5 г
Цитрат железа - 0,05 г
Цитрат натрия - 1,5 г
Глюкоза - 5 г
Глицерин - 50 г
Крахмал - 0,1 г
Нитрат аммония - 1,5 г
Дистиллированная вода - до 1000 мл
Вещества растворяют в дистиллированной воде, подогретой до температуры 60 - 70 °C, в произвольном порядке, устанавливают pH - 5,6 - 5,8, среду стерилизуют при 120 °C в течение 30 мин.
Модифицированная казеиновая питательная среда Дюбо-Смита
а) Состав среды:
Однозамещенный фосфорнокислый калий - 1 г
Двузамещенный фосфорнокислый натрий - 6,25 г
Сернокислый магний - 0,01 г
Хлористый калий - 0,0005 г
Сернокислый цинк - 0,0001 г
Сернокислая медь - 0,0001 г
Лимоннокислое аммонийное железо - 0,05 г
Аспарагин - 1 г
Гидролизат казеина - 80 мл
Спиртовый экстракт микобактерий тимофеевой травы - 20 мл
Дистиллированная вода - до 1000 мл
Агар Дифко - 1,5%
Стерильная инактивированная сыворотка крупного рогатого скота - 20%
Пенициллин - 50 ЕД/мл
б) Приготовление гидролизата казеина.
Нагревают до 28 °C 1 л водопроводной воды и добавляют 84 г казеина. Едким калием устанавливают pH раствора равный 8,0. Раствор подогревают на водяной бане при температуре 28 °C в течение 3 часов, снова доводят pH до 8,0, затем добавляют 2 г панкреатина и 2 мл хлороформа. Полученную смесь переливают в бутыль, закрывают резиновой пробкой и оставляют при комнатной температуре. Спустя 10 дней содержимое бутыли фильтруют через полотно, устанавливают pH 7,4, разливают по флаконам и стерилизуют при 120 °C в течение 30 мин. Гидролизат может храниться при комнатной температуре длительное время.
в) Приготовление солевых компонентов.
Взвешивают однозамещенный фосфорно-кислый калий, двузамещенный фосфорно-кислый натрий, сернокислый магний и растворяют в 100 - 250 мл дистиллированной воды в литровой колбе. В другой колбе, в таком же объеме воды при подогревании поочередно растворяют аспарагин и лимоннокислое аммиачное железо, этот раствор смешивают с раствором указанных выше солей, а затем прибавляют хлористый кальций, сернокислый цинк и сернокислую медь.
г) Порядок составления среды.
В колбу с растворами солей и аспарагина добавляют 80 мл гидролизата казеина, 20 мл микобактина, дистиллированной воды до 1 литра и полученный раствор пропускают через бумажный фильтр.
Устанавливают соляной кислотой pH - 6,5, разливают равномерно по флаконам, добавляют 1,5% агара и стерилизуют при 120 °C в течение 20 мин. Такой полуфабрикат длительно хранится при комнатной температуре.
Перед употреблением к расплавленному в водяной бане полуфабрикату добавляют 20% стерильной, инактивированной при 50 °C в течение часа сыворотки крови крупного рогатого скота и пенициллин.
Готовую среду разливают по пробиркам, скашивают и выдерживают при комнатной температуре в течение суток.
Яичные среды готовят только в стерильной посуде: добавление яичной массы, фильтрацию и разлив производят в боксе. Для приготовления яичных питательных сред используют только свежие куриные яйца со сроком хранения не более 5 суток. Яйца предварительно тщательно моют щеткой в теплой воде с мылом, смачивают спиртом и обжигают, затем разбивают стерильным пинцетом, выливают содержимое и стерильную банку (большую колбу) с бусами или битым стеклом и энергично встряхивают после внесения каждого яйца.
Среда Петраньяни (ингредиенты и приготовление)
Молоко цельное - 300 мл
Крахмал картофельный - 12 г
Пептон - 2 г
Картофель очищенный, мелко нарезанный - 2 клубня размером с яйцо.
Ингредиенты тщательно смешивают в колбе и варят на слабом огне до образования клейстера. К охлажденной до 50 °C смеси добавляют 8 цельных яиц и 2 желтка, 24 мл глицерина и 20 мл 2% стерильного водного раствора малахитовой зелени. Хорошо смешивают, фильтруют через воронку с двойным слоем марли, разливают по пробиркам (4 - 5 мл в каждую) и стерилизуют при 120 °C в течение 20 мин.
Среда Левенштейна-Йенсена (ингредиенты и приготовление)
а) Солевой раствор
Однозамещенный фосфорнокислый калий - 2,4 г
Сернокислый магний - 0,34 г
Лимоннокислый магний - 0,6 г
Аспарагин - 3,6 г
Глицерин х.ч. - 12 мл
Вида дистиллированная - до 600 мл
Соли растворяют в указанной последовательности, раствор стерилизуют 2 ч текучим паром или в автоклаве в течение 15 мин при температуре 120 °C.
б) Яичная масса.
Приготавливают 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Для этого яйца, вымытые в проточной воде с мылом, в количестве 20 - 25 штук кладут в 70% спирт на срок не менее 1 часа, затем разбивают в стерильную круглодонную колбу с бусами (из каждого десятка яиц отбрасывают два белка), хорошо размешивают и фильтруют через стерильную марлю.
в) Водный 2% раствор малахитовой зелени.
2 г малахитового зеленого растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин. при 120 °C.
г) Приготовление среды.
В колбу, содержащую 30 г картофельного крахмала, добавляют 600 мл солевого раствора, смесь нагревают, постоянно взбалтывая, на кипящей бане до вязкой консистенции. К охлажденной до температуры 45 - 60 °C смеси добавляют 1 л яичной массы и 20 мл 2% водного раствора малахитовой зелени, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 4 - 5 мл, скашивают и сворачивают дважды при 85 °C в течение 20 мин.
Среда ФАСТ-ЗЛ лиофилизированная (способ приготовления)
Во флакон с лиофилизированной средой ФАСТ-ЗЛ вливают 57 мл стерильной дистиллированной воды с pH 6,0 и 1,3 мл микобактина: энергично встряхивают и помещают в термостат с температурой нагрева 37 - 38 °C на 30 мин. с периодическим встряхиванием. Лиофилизированная среда должна полностью раствориться и представлять собой однородную жидкость светло-зеленого цвета консистенции молока.
После растворения сухой среды (30 - 40 мин) ее разливают при периодическом встряхивании флакона в стерильные бактериологические пробирки по 5 мл и укупоривают стерильными ватно-марлевыми пробками.
Пробирки в наклонном положении помещают в аппарат Коха с температурой нагрева 85 °C на 30 мин. для свертывания среды. Затем пробирки в том же положении выдерживают в термостате при температуре 37 - 38 °C в течение 18 - 20 часов и повторно прогревают при температуре 85 °C в течение 20 мин.
## 8. ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
8.1. Для гистологического исследования отбирают пораженные участки кишечника и лимфатические узлы, которые фиксируют в 10% растворе формалина.
8.2. Гистологические изменения при паратуберкулезе характеризуются наличием пролифератов из эпителиоидных клеток, располагающихся диффузно и в виде гранулем в слизистой оболочке кишечника, а иногда и в подслизистом слое. Среди них иногда встречаются и гигантские клетки типа Лангганса.
Ворсинки слизистой оболочки увеличены, часто сливаются и имеют вид колбообразных вздутий. Некоторые ворсинки сдавлены и атрофированы. Либеркюновые железы также подвергаются атрофии.
В брыжеечных лимфатических узлах эпителиоидные клетки располагаются преимущественно в краевых и центральных синусах, а в лимфатических сосудах - в их стенках (продуктивный эндолимфангит).
У верблюдов аналогичные эпителиоидные пролифераты выявляют также в печени и селезенке.
В срезах, окрашенных по методу Циля-Нильсена, микобактерии паратуберкулеза обнаруживают в эпителиоидных и гигантских клетках и реже вне их. В отдельных случаях микобактерии обнаружить не удается.
8.3. Изменения при паратуберкулезе следует дифференцировать от туберкулеза, неспецифического катара, паразитарных очагов.
Туберкулез кишечника характеризуется обычно язвенными поражениями кишечной стенки и образованием в брыжеечных лимфатических узлах очагов с творожистым или обызвествленным содержимым, окруженных грануляционной тканью из эпителиоидных, лимфоидных и гигантских клеток. При окраске по методу Циля-Нильсена в содержимом очага могут быть обнаружены единичные красные палочки.
Паразитарные узелки определяют по нахождению паразита и эозинофильноклеточной пролиферации. При неспецифическом катаре кишечника отсутствуют пролифераты из эпителиоидных клеток в стенке кишки и лимфоузлах.
С утверждением данного Наставления утрачивают силу "[Наставление](https://bukva.ai/docs/instruktsiya-o-meropriyatiyah-po-profilaktike-i-minselhoz-sssr-ministerstvo-9#p100049) по диагностике паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза) крупного рогатого скота" (приложение N 1 к Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации паратуберкулезного энтерита (паратуберкулеза), утвержденное ГУВ МСХ СССР 18 августа 1975 г., "Наставление по аллергической диагностике паратуберкулеза у овец", утвержденное ГУВ МСХ СССР 11 августа 1981 г., "Временное наставление по постановке реакции связывания комплемента для диагностики паратуберкулеза крупного рогатого скота и овец с антигеном Сибирского научно-исследовательского ветеринарного института", утвержденное ГУВ МСХ СССР 31 мая 1968 г.
***
Разработчики:
Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ),
Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ),
Департамент ветеринарии Минсельхоза РФ,
Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория.
Начальник отдела ветсанэкспертизы
и лабораторной диагностики
В.И.БЕЛОУСОВ
---