Наставление по применению набора для выявления антигенов парвовирусного энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом (ИФА)

(утв. Минсельхозом России, согласовано протоколом Минсельхозпрода России от 15.02.2000 № 1, ПВР-1-1.0/-325)

Утверждено в 2002 году

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ ПАРВОВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА СОБАК, ВИРУСНОГО ЭНТЕРИТА НОРОК И ПАНЛЕЙКОПЕНИИ КОШЕК ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ АНАЛИЗОМ (ИФА)

1. Общие положения.

1.1. Назначение набора. Набор предназначен для выявления иммуноферментным анализом (ИФА) специфического антигена парвовирусного энтерита собак (ВЭС), вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек в биологическом материале от больных и экспериментально зараженных животных. Набор рассчитан на проведение 45 анализов (в двух повторах). Компоновка набора допускает возможность дробного использования компонентов для проведения нескольких серий анализов по мере поступления биоматериала.

1.2 Состав набора. Набор состоит из 12 компонентов.

Специфические компоненты:

1. специфический иммуноглобулин G (IgG) к ВЭС, лиофилизированный — 1 флакон, 0,1 мл;

2. положительный контроль (К+) — специфический антиген ВЭС, лиофилизированный, 0,1 мл — 1 флакон;

3. отрицательный контроль (К-) — лизат клеток без вируса, лиофилизированный, 0,1 мл — 1 флакон;

4. конъюгат — меченный пероксидазой хрена специфический иммуноглобулин G к ВЭС, лиофилизированный, 0,1 мл — 1 флакон.

Неспецифические компоненты:

5. 1 М карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ): pH 9,4...9,6, жидкий, 11 мл — 1 флакон.

6. 20-кратный концентрат фосфатно-солевого, содержащего твин 20, буферного раствора (ФСБТ), pH 7,2...7,4, жидкий — 2 флакона по 25 мл;

7. буферный раствор для разведения реагентов (БДР), pH 7,2...7,4, жидкий — 2 флакона по 20 мл;

8. субстратный раствор с перекисью водорода для разведения хромогена (СР), жидкий, 5,1 мл — 1 флакон;

9. хромоген — 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ) жидкий, 5,1 мл — 1 флакон;

10. 1 М серная кислота, стоп-раствор, жидкий, 5,1 мл — 1 флакон;

11. плоскодонный полистироловый планшет 96-луночный — 1 шт.;

12. наставление по применению набора — 1 экз.

1.3. Упаковка и маркировка. Компоненты набора выпускаются в закрытых флаконах. На флаконы с каждым компонентом наклеивают или наносят несмываемой краской по стеклу этикетки с указанием товарного знака и наименования предприятия-изготовителя, названия компонента, его номера и количества, номера серии и контроля, срока годности. На каждую коробку с диагностическим набором наклеивают этикетку, в которой указывают наименование и товарный знак предприятия-изготовителя, полное название набора, номер серии набора и контроля, срок годности, условия хранения и обозначение ТУ; в коробку вкладывают наставление по применению набора.

1.4. Набор хранят при температуре от 2 до 8 °C и относительной влажности не более 80%. Срок годности — 12 мес. с даты изготовления.

Примечание. Набор содержит все необходимые для анализа компоненты. Дополнительно требуются микропипетки на 10, 100, 200 и 1000 мкл, мерная лабораторная посуда, дистиллированная вода, суховоздушный термостат с температурой 37 °C, спектрофотометр для иммуноферментного анализа со светофильтром на 450 нм.

ВНИМАНИЕ! В состав компонентов набора входят токсические консерванты — мертиолят и азид натрия. Не допускайте попадания их внутрь и на слизистые оболочки. Серная кислота вызывает раздражение при попадании на кожу и слизистые оболочки.

2. Принцип метода.

2.1. Метод основан на взаимодействии иммобилизованного на поверхности лунок планшета специфического иммуноглобулина с антигеном ВЭС из исследуемой пробы и последующем выявлении полученного комплекса конъюгатом (меченым пероксидазой хрена специфическим к антигену ВЭС иммуноглобулином G). Связанная пероксидаза вызывает разложение находящейся в хромоген-субстратном растворе перекиси водорода и окисление хромогена. В лунках развивается окраска, интенсивность которой прямо пропорциональна количеству антигена в определяемой пробе.

3. Подготовка материала для анализа и рабочих растворов.

3.1 Подготовка биологического материала.

Для анализа используют пробы фекалий, дефибринизированную кровь, а также участки тонкого и толстого отделов кишечника, взятые от павших или вынужденно убитых животных в первые часы после гибели. Из материала готовят 10%-ную суспензию на забуференном физрастворе (в набор не входит) и центрифугируют ее 10 мин при 2000...3000 об/мин. Анализируют полученный супернатант.

Предназначенный для исследования материал можно хранить в морозильной камере бытового холодильника. Размораживать только перед анализом!

3.2 Подготовка рабочих растворов.

3.2.1. Перед началом работы все компоненты выдерживают не менее 0,5 ч при комнатной температуре.

3.2.2. Буфер для растворения специфического иммуноглобулина G — карбонатно-бикарбонатный буфер (флакон 5 — КББ) готов к употреблению.

3.2.3. Рабочий раствор для промывки планшетов (ФСБТ). Содержимое флаконов 6 растворяют в 1000 мл дистиллированной воды. Готовый раствор стабилен 3 сут при 4 °C. Для более длительного хранения неиспользованный раствор замораживают и хранят при -20 °C.

3.2.4. Раствор для блокировки свободной поверхности лунок и для растворения положительного (К+) и отрицательного (К-) контролей и конъюгата (флакон 7, БДР) готов к употреблению.

3.2.5. Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор хромогена (ТМБ — флакон 9) разводят субстратным раствором (флакон 8) в соотношении 1:1 и перемешивают. Пример: для приготовления 5 мл рабочего раствора к 2,5 мл раствора ТМБ добавляют 2,5 мл субстратного раствора. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

3.2.6. Раствор специфического иммуноглобулина для сенсибилизации планшета. Содержимое флакона 1 растворяют в 11 мл КББ. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

3.2.7. Раствор положительного контроля (К+). Содержимое флакона 2 — специфический антиген — растворяют в 2 мл БДР (флакон 7). Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф» по 0,25 мл и хранят при температуре -20 °C и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

3.2.8. Раствор отрицательного контроля (К-). Содержимое флакона 3 — лизат клеток без вируса — растворяют в 2 мл БДР (флакон 7). Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф» по 0,25 мл и хранят при температуре -20 °C и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

3.2.9. Раствор конъюгата. Содержимое флакона 4 — конъюгат — растворяют в 0,1 мл БДР (флакон 7) и доводят объем до 10 мл этим же буфером. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Неиспользованный раствор фасуют в пробирки типа «Эппендорф» по 0,8 мл и хранят при температуре -20 °C и ниже до следующего исследования, избегая повторного замораживания.

3.2.10. Раствор для остановки реакции (стоп-раствор, флакон 10) готов к употреблению.

4. Постановка реакции.

4.1. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл раствора специфического иммуноглобулина G (см. п. 3.2.6).

4.2. Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 3...4 ч при 37 °C или 18 ч при 4 °C.

4.3. Планшет промывают 4 раза буфером ФСБТ (300 мкл/лунка) (см. п. 3.2.3), каждый раз полностью удаляя жидкость из лунок постукиванием перевернутого планшета по фильтровальной бумаге.

4.4. Во все лунки планшета вносят по 200 мкл буфера БДР (см. п. 3.2.4). Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 0,5 ч при 37 °C.

4.5. ВНИМАНИЕ! Если количество образцов для исследования не позволяет использовать планшет полностью, то неиспользованные стрипы замораживают с раствором БДР. Стрипы помещают в полиэтиленовый пакет и хранят до момента использования при температуре от -20 до -40 °C, не допуская повторного замораживания. По мере необходимости стрипы размораживают, промывают раствором ФСБТ и используют в реакции, начиная с п. 4.6).

4.6 В лунки A1...B1 вносят по 100 мкл БДР — контроль конъюгата.

4.7. В лунки C1...D1 вносят по 100 мкл раствора отрицательного контроля (К-) (см. п. 3.2.8).

4.8. В лунки E1...F1 вносят по 100 мкл раствора положительного контроля (К+) (см. п. 3.2.7).

4.9. В остальные лунки вносят по 100 мкл исследуемых образцов (см. п. 3.1) (по 2 лунки на каждый образец).

4.10. Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 1 ч при 37 °C.

4.11 Планшет 4 раза промывают буфером ФСБТ (см. п. 4.3).

4.12. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата (см. п. 3.2.9).

4.13. Планшет помещают в полиэтиленовый пакет и инкубируют 1 ч при 37 °C.

4.14 Планшет 4 раза промывают буфером ФСБТ (см. п. 4.3).

4.15. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл рабочего хромоген-субстратного раствора (см. п. 3.2.5).

4.16. Планшет инкубируют 20 мин при комнатной температуре в темном месте.

4.17. Реакцию останавливают добавлением во все лунки планшета 50 мкл стоп-раствора (флакон 10).

5. Учет и интерпретация результатов.

5.1. Визуальный учет. (Останавливать реакцию не рекомендуется.) Лунки с положительным контролем должны иметь сине-голубое окрашивание до остановки реакции (желтое после остановки реакции). Лунки с отрицательным контролем и контролем конъюгата должны оставаться бесцветными (до и после остановки реакции). Лунки с исследуемыми образцами, в которых присутствует специфический антиген, имеют сине-голубое (желтое после остановки реакции) окрашивание различной интенсивности в зависимости от концентрации антигена.

Реакцию считают положительной, когда заметна четкая разница в интенсивности окрашивания опытных и контрольных отрицательных (К-) лунок планшета.

5.2 Инструментальный учет.

Результаты ИФА учитывают спектрофотометрически при длине волны 450 нм после остановки реакции кислотой. Положительной считают реакцию при соотношении величины оптической плотности в лунке с исследуемой пробой (P) к величине оптической плотности в лунке с отрицательным контролем (N) (P/N), равном не менее 2,1. Величина оптической плотности для положительного контроля (К+) должна быть не ниже 0,4 единиц.

6. Порядок предъявления рекламаций.

6.1. Рекламацию на качество наборов для выявления антигена ПВЭС, в соответствии с указанием Главного управления ветеринарии «О порядке предъявления рекламации на ветеринарные препараты отечественного производства и закупаемые по импорту» № 22-7/28 от 8 мая 1992 г. направляют на предприятие-изготовитель: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16, НПО НАРВАК, во Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) по адресу: 123022, г. Москва. Звенигородское шоссе, 5, и ЦНМВЛ (Москва, Оранжерейная, 23).

Наставление разработано НПО НАРВАК.

Одобрено Советом по ветеринарным препаратам Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ, протокол № 1 от 15 февраля 2000 г., ПВР-1-1.0/-325.

С утверждением настоящего наставления утрачивает силу Наставление по применению набора для выявления антигенов парвовирусного энтерита собак, вирусного энтерита норок и панлейкопении кошек иммуноферментным анализом, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ № 13-7-2/1970 от 24 апреля 2000 г.

---