МУК 4.2.4094-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического определения концентрации препарата Зеленая Анхана в воздухе рабочей зоны и атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания по методам контроля
(утв. Роспотребнадзором 25.12.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 25.03.2025.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 25 декабря 2024 года
Дата введения 25 марта 2025 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРЕПАРАТА ЗЕЛЕНАЯ АНХАНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ И АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ МУК 4.2.4094-24
1. Разработаны Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (д.б.н. Н.И. Шеина); Федеральным бюджетным учреждением науки «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (к.м.н. А.Л. Мишина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 25 декабря 2024 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее — МУК) описывают порядок применения метода микробиологического количественного определения концентрации штаммов препарата Зеленая Анхана (далее — микробиологический препарат) в воздухе рабочей зоны и в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика микробиологического препарата
2.1. Препарат Зеленая Анхана является микробиологическим удобрением и применяется в сельскохозяйственном производстве для предпосевной обработки семян и клубней и для некорневой подкормки растений в течение вегетационного периода. Препарат представляет собой светло-желтую суспензию и содержит не более 2% активной субстанции, 1,5 — 2,0% остатки питательной среды и более 96% воды.
2.2. Активная субстанция представляет собой микробную массу живых природных штаммов Bacillus subtilis VBs-1 ВКПМ B-14396, Bacillus subtilis VBa-2 ВКПМ B-14397, Bacillus cereus VBm-3 ВКПМ B-14398, Pseudomonas chlororaphis VPc-5 ВКПМ B-14391, Azotobacter vinelandii VAv-8 ВКПМ B-14393, Azotobacter chroococcum VAh-9 ВКПМ B-14394.
2.3. Все штаммы выделены из почв Краснодарского края, имеют паспорта и депонированы в Биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».
2.4. Концентрация штаммов Bacillus subtilis VBs-1, Bacillus subtilis VBa-2, Bacillus cereus VBm-3 в препарате составляет не менее 108 КОЕ/мл. Концентрация штаммов Pseudomonas chlororaphis VPc-5, Azotobacter vinelandii VAv-8, Azotobacter chroococcum VAh-9 в препарате составляет 107 КОЕ/мл. Контроль препарата в воздухе проводится по ведущему компоненту консорциума (штаммы рода Bacillus — Bacillus subtilis и Bacillus cereus), концентрация которых в 10 раз выше содержания остальных штаммов.
2.5. Морфологически штаммы бактерий рода Bacillus представлены грамположительными аэробными подвижными палочками, которые расположены одиночно, попарно или цепочкой, через 24 — 30 часов роста образуют овальные споры, расположены в клетке центрально. Колонии бело-серого или бежевого цвета, округлые, непрозрачные, с ровным краем, немного вязкой консистенции.
2.6. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма является мясо-пептонный агар (далее — МПА). Оптимальная температура роста плюс (30 +/- 2) °C, культивирование 24 — 48 часов.
2.7. Штаммы Bacillus subtilis VBs-1, Bacillus subtilis VBa-2, Bacillus cereus VBm-3, Pseudomonas chlororaphis VPc-5, Azotobacter vinelandii VAv-8, Azotobacter chroococcum VAh-9, входящие в состав препарата Зеленая Анхана, не являются фито- и зоопатогенными, выделены из почвы, не селекционированы и генно не модифицированы, а также не входят в состав 4 групп патогенности <4>. Работа со штаммами не требует специальных мер предосторожности.
<1> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Методы определения
3.1. Метод основан на аспирации из воздуха колониеобразующих клеток микроорганизмов рода Bacillus и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам штамма на агаризованной среде (МПА). При наличии в воздухе высоких концентраций штамма микробиологического препарата возможно использование седиментационного метода Коха.
IV. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы, питательные среды и материалы
4.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы, питательные среды и материалы, приведенные в табл. 4.1 - 4.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Барометр-анероид | Диапазон измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст., предел допустимой погрешности +/- 2,5 мм. рт. ст. |
| Весы лабораторные аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг, ГОСТ Р 53228-2008 |
| Колбы мерные лабораторные конические КН-2-50-34, КН-2-250-50, КН-2-500-50, КН-2-1000-50 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности | Вместимостью 1,0; 2,0, 5,0, 10 см3, ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные | 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3, ГОСТ 1770-74 |
| Термометр лабораторный шкальный | Пределы измерения от 0 до плюс 55 °C |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник | Скорость до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 КОЕ/м3 |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Шкаф сушильный стерилизационный | Поддерживающий температуру плюс (160 +/- 5 °C) |
| Термостаты | Поддерживающие рабочую температуру плюс (28 +/- 2 °C) и плюс (37 +/- 2 °C) |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-2011, ГОСТ 31598-2012 |
| Дистиллятор | - |
| Облучатель бактерицидный настенный | - |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные | Диаметром 40 — 45 мм, ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | - |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-2021 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-2022 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание: допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Таблица 4.3 | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
| Вода дистиллированная ГОСТ 6709-90 | |
| Мясо-пептонный бульон (далее — МПБ) | ГОСТ 20730-75 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962-2013 |
| Примечание: допускается использование других питательных сред, диагностических препаратов и реактивов с аналогичными характеристиками. | |
| V. Требования безопасности | |
5.1. Определение концентрации клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны и в атмосферном воздухе осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <2>, методическими документами <3>, а также документами по стандартизации <4>.
<2> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
<3> МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 06.06.2001 (далее — МУК 4.2.1054-01).
<4> ГОСТ 12.1.005-88 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утвержденный и введенный в действие постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
5.2. При выполнении определения необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <5> и инструкции по эксплуатации прибора.
<5> ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст; ГОСТ 12.1.009-2017 «Электробезопасность. Термины и определения», введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 942-ст.
5.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
5.4. К выполнению определения и обработке результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VI. Условия определения концентрации штамма
6.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха — плюс (20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление — (760 +/- 20) мм. рт. ст.;
- влажность воздуха — не более 80%.
VII. Приготовление агаризованной среды
7.1. При проведении исследований в мясо-пептонный бульон добавляют агар микробиологический из расчета 15 г на 1 дм3 МПБ и нагревают до полного растворения агара.
7.2. Приготовленную среду (МПА) разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при температуре плюс 120 °C в течение 15 — 20 минут, остужают и разливают по стерильным чашкам Петри.
7.3. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C не более 10 дней.
VIII. Проведение определения концентрации штамма в воздухе
8.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <6>, а также документами по стандартизации <7>.
<6> МУК 4.2.1054-01.
<7> ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений», введенный приказом Ростехрегулирования от 15.12.2009 № 1253-ст.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма (табл. 8.1).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
8.2 Выполнение определения концентрации штамма.
8.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (МПА) расплавляют, остужают до температуры плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
8.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <8>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 — 8 °C не более 10 дней.
<8> Подпункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденный Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее — МУК 4.2.2316-08).
8.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри культивируют при температуре (30 +/- 2) °C. Через 24 — 48 часов производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам. При необходимости штаммы возможно идентифицировать до вида с помощью анализа 16(18) S РНК.
8.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии ростовыми свойствами питательных сред <9>. Для этого музейный штамм высевают на 2 — 3 чашки используемой среды.
<9> Пункт 7 МУК 4.2.2316-08.
8.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
IX. Вычисление результатов определения
9.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле (1):
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
X. Оформление результатов определения
10.1. Результаты определения концентрации штамма в воздухе оформляют протоколом <10>. Протокол испытания должен включать:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
- используемый метод испытаний;
- все детали испытания, не установленные настоящим документом;
- полученные результаты и соотношение их с уровнем ПДКр.з или ПДКа.в.
<10> Пункты 7.3, 7.8 ГОСТ ISO 17025-2019 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий», введенного приказом Росстандарта от 15.07.2019 № 385-ст.
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
3. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
4. МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».
5. ГОСТ 12.1.009-2017 «Электробезопасность. Термины и определения».
6. ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1 Метрологические и технические требования. Испытания».
7. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
8. ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования»
9. ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
10. ГОСТ 31598-2012 «Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний».
11. ГОСТ Р ЕН 13060-2011 «Стерилизаторы паровые малые».
12. ГОСТ 22340-89 «Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний».
13. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
14. ГОСТ 25706-83 «Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования».
15. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
16. ГОСТ 23932-90 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».
17. ГОСТ 9412-2021 «Марля медицинская. Общие технические условия».
18. ГОСТ 5556-2022 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
19. ГОСТ 12026-76 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».
20. ГОСТ 17206-96 «Агар микробиологический. Технические условия».
21. ГОСТ Р 58144-2018 «Вода дистиллированная. Технические условия».
22. ГОСТ 17299-78 «Спирт этиловый технический. Технические условия».
23. ГОСТ 5962-2013 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».
24. ГОСТ 12.1.005-88 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».
25. ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
26. ГОСТ ISO 17025-2019 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий».
| ББК 51.214+51.242 |
|---|