МУК 4.2.3997-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации биопрепарата Коуд оф бэлэнс ПФ1 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 19.05.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 19 февраля 2024 года
Дата введения 19 мая 2024 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БИОПРЕПАРАТА КОУД ОФ БЭЛЭНС ПФ1 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3997-24
1. Разработаны Федеральным государственным автономным образовательным учреждением высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 19 февраля 2024 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) описывают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации штаммов биопрепарата Коуд оф бэлэнс ПФ1 (далее — микробиологический препарат) в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика микробиологического препарата
2.1. Микробиологический препарат предназначен для защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза и представляет собой комбинацию штаммов спорообразующих бактерий с антифузариозной активностью: Bacillus amyloliquefaciens штаммы V 3.14, R 4.6; Paenibacillus jamilae штаммы K 1.14, R 4.24; Paenibacillus peoriae штаммы O 1.27, O 2.11, R 3.13, R 4.5, R 6.1; Paenibacillus polymyxa штамм R 5.31 <1>. Суммарная численность 10 штаммов бактерий в микробиологическом препарате составляет не менее 108 КОЕ/г, в том числе каждого штамма — не менее 107 КОЕ/г (по 10% каждый).
<1> Все штаммы идентифицированы до вида на основе секвенирования генов 16S рРНК и депонированы в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов на базе ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра „Курчатовский институт“.»
2.2 Источником выделения штаммов являются почвы Краснодарского края.
2.3. Культурально-морфологические признаки: на ГРМ-агаре + сусло-агаре штаммы образуют характерные для аэробных спорообразующих бактерий складчатые колонии от светло-коричневого до бежевого цвета.
2.4. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма является комбинированная среда 50% ГРМ-агар + 50% сусло-агара.
2.5. Штаммы, входящие в микробиологический препарат, относятся к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа со штаммами не требует специальных мер предосторожности.
<2> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 КОЕ в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны колониеобразующих клеток микроорганизма и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам всех штаммов бактерий (по сумме бактерий) на комбинированной агаризованной среде (ГРМ-агар + сусло-агар 1:1). При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм. рт. ст. | - |
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные лабораторные конические КН-2-50-34, КН-2-250-50, КН-2-500-50, КН-2-1000-50 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения от 0 до плюс 55 °C | - |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | - |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | - |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060 ГОСТ 31598 |
| Дистиллятор | - |
| Облучатель бактерицидный настенный | - |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x 10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | - |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Таблица 5.3 | |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| ГРМ-агар | - |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
| Сусло пивное | - |
| Примечание: допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
VI. Требования безопасности
6.1. Выполнение измерений концентрации клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <3> и методическими документами <4>.
<4> ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утвержденный и введенный в действие постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <5> и инструкции по эксплуатации прибора.
<5> ГОСТ 12.1.019 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции. Работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. Условия измерений
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха — плюс (20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление — 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- влажность воздуха — не более 80%.
VIII. Приготовление агаризованной комбинированной среды (ГРМ-агар + сусло-агар 1:1)
8.1. Для приготовления агаризованной среды ГРМ-агар на 1.0 дм3 дистиллированной воды добавляют сухой порошок ГРМ-агар согласно инструкции, прилагаемой к питательной среде. Помешивая, нагревают до полного растворения агара. В готовой среде pH 7,4 +/- 0,2.
Для приготовления сусло-агара на 1 дм3 пивного сусла (10 — 20% сахара) добавляют 2,5 — 3 г агара, размешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.2. Приготовленные среды разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 — 20 мин.
8.3. Готовую среду хранят в защищенных от света местах при температуре не выше плюс 8 °C не более 10 дней.
8.4. При проведении исследований агаризованные среды расплавляют, смешивают в соотношении 1:1, остужают и разливают по чашкам Петри.
IX. Проведение измерения
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <6>.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма (табл. 9.1).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м раствором этилового спирта. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильные агаризованные среды (ГРМ-агар, сусло агар) расплавляют и смешивают в соотношении 1:1, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими документами. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 — 8 °C не более 10 дней.
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри культивируют при температуре плюс (28 +/- 2) °C. Через 2 — 4 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам. При необходимости идентификация микроорганизма до вида может быть проведена на основе секвенирования генов 16S рРНК.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды проверяются до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред. Для этого коллекционные штаммы микробиологического препарата высеваются на 2 — 3 чашки используемой среды.
9.2.5. Лиофилизованную культуру коллекционного штамма микробиологического препарата необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
X. Вычисление результатов измерения
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле (1):
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. Оформление результатов измерений
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, рекомендуемый образец которого приведен в приложении к настоящим МУК.
Приложение к МУК 4.2.3997-24 (рекомендуемый образец)
Пример оформления протокола N _______ количественного микробиологического анализа биопрепарата Коуд оф бэлэнс ПФ1 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа _________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) ___________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы)
_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________
4. Вид пробоотборника _____________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
____________________________________________________________________
6. Питательная среда, время инкубации _______________________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ___________
_____________________________________________________________________
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний)
_____________________________________________________________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов биопрепарата Коуд оф бэлэнс ПФ1 (микро-морфологические признаки)
_____________________________________________________________________
10. Результаты расчета концентрации штамма _________________________
11. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з. ____________
_____________________________________________________________________
12. Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) ___________
_____________________________________________________________________
13. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО, должность, дата, подпись)
_____________________________________________________________________
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
3. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
4. МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».
5. ГОСТ 12.1.009 «Электробезопасность. Термины и определения».
6. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
7. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
8. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования»
9. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
10. ГОСТ Р 51945 «Аспираторы. Общие технические условия».
11. ГОСТ 31598 «Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний».
12. ГОСТ Р ЕН 13060 «Стерилизаторы паровые малые».
13. ГОСТ 22340 «Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний».
14. ГОСТ 26678 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
15. ГОСТ 25706 «Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования».
16. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
17. ГОСТ 23932 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».
18. ГОСТ 9412 «Марля медицинская. Общие технические условия».
19. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
20. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».
21. ГОСТ 17206 «Агар микробиологический. Технические условия».
22. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
23. ГОСТ 6038 «Реактивы. D-глюкоза. Технические условия».
24. ГОСТ 17299 «Спирт этиловый технический. Технические условия».
25. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».