МУК 4.2.3994-24. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 ВКПМ Ac-2076 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 19.02.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 19.05.2024.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 19 февраля 2024 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРООРГАНИЗМА ARTHROBACTER PSYCHROCHITINIPHILUS ШТАММ ARC 42 ВКПМ Ac-2076 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3994-24
Дата введения 19 мая 2024 года
Методические указания разработаны ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, Г.М. Трухина, О.О. Синицына, Н.А. Борисова, Е.А. Вишневская, Е.В. Чикова, А.А. Самотоина).
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) описывают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 ВКПМ Ac-2076 (далее — микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42) в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 ВКПМ Ac-2076
2.1. Микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 <1> предполагается применять в биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды. Также микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 может быть использован для очистки акваторий водоемов и береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при низкой, в том числе отрицательной, температуре.
<1> Микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов на базе ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра „Курчатовский институт“ под номером ВКПМ Ac-2076 12.12.2017.»
2.2. Способ получения штамма: выделен из образцов грунта, отобранных в прибрежной зоне западного берега полуострова Ямал. Является природным изолятом, не модифицирован. Обладает способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов.
2.3 Таксономическое положение:
- царство Bacteria;
- тип Actinobacteria;
- порядок Actinomycatales;
- семейство Micrococcaceae;
- род Arthrobacter;
- вид psychrochitiniphilus;
- штамм ARC 42.
2.4 Микробиологическая характеристика.
2.4.1. Колонии при температуре плюс (22 +/- 1) °C и инкубации в течение 3 суток на модифицированной плотной питательной среде (англ. Plate Count Agar, далее — mPCA) имеют следующие характеристики: колонии круглые, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью, однородной структуры, мягкой консистенции, легко снимаются с агара, светло-желтого цвета, размером от 2 мм до 5 мм.
2.4.2. При микроскопии штамм представляет грамположительные палочки, кокки, в зависимости от стадии роста, располагаются хаотично, спор не образуют. Культура подвижная.
2.4.3. Микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 — грамположительный аэробный микроорганизм, оксидазоотрицательный, каталазоположительный, гидролизует эскулин и мочевину, не образует лецитиназу, гемолизотрицательный, не разлагает цитрат и малонат, подщелачивает D-лактат; обладает ферментами: Лейцинариламидаза, L-пролинариламидаза, Альфа-галактозидаза, Аланин-ариламидаза, Тирозинариламидаза, Ala-Phe-Proариламидаза, Аргининдигидролаза 1 и 2, Бета-галактопиранозидаза, Бета-глюкуронидаза; не ассимилирует сахара: D-глюкозу, сахарозу, лактозу, D-маннит, D-маннозу, амигдалин, D-ксилозу, D-сорбит, D-рибозу, D-мальтозу, D-рафинозу, D-трегалозу.
2.5. Оптимальная плотная питательная среда для выращивания и размножения микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 — mPCA следующего состава (г/дм3): K2HPO4 — 1,5; KH2PO4 — 0,75; MgSO4 — 1,0; (NH4)2SO4 — 4,0; NaCl — 30; гидролизат казеина — 5,0; дрожжевой экстракт — 2,5; D-глюкоза — 1,0; агар — 14; дистиллированная вода — 1000 см3; pH 7,0.
2.6. Микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <2>. Работа с микроорганизмом Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 не требует специальных мер предосторожности.
<2> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022 регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности P = 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток микроорганизма и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим, тинкториальным признакам.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и питательные среды
5.1. При выполнении измерений применяют средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и питательные среды, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Прибор для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы лабораторные аналитические | Предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг, ГОСТ OIML R 76-1 |
| Гири калибровочные | Классов точности E2, F1, F2, M1, M1-2, M2, M2-3, M3, ГОСТ OIML R 111-1 |
| Колбы мерные | 2-го класса точности 2-100-2, 2-200-2, 2-250-2, 2-1000-2, ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные | 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3, ГОСТ 29228 |
| Цилиндры мерные | 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3, ГОСТ 1770 |
| Термометры стеклянные жидкостные или ртутные | Пределы измерения 0 — 55 °C по ГОСТ 28498, ГОСТ 13646 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник | Со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, ГОСТ Р 51945 |
| Дозатор пипеточный механический одноканальный | С варьируемым объемом дозирования 100 — 1000 мкл, ГОСТ 28311 |
| Анализатор жидкости (pH-метр) | ГОСТ 27987 |
| Анализатор жидкости кондуктометрический лабораторный | ГОСТ 13350 |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование вспомогательных устройств и материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | - |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (24 +/- 2) °C | - |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ 31598, ГОСТ Р ЕН 13060 |
| Дистиллятор | ГОСТ 22340 |
| Облучатель бактерицидный настенный, рециркулятор | - |
| Холодильники фармацевтические | - |
| Микроскоп стереоскопический | - |
| Микроскоп световой стандартный биологический | ГОСТ 28489 |
| Лупа с увеличением \times 10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 25336 |
| Чашки биологические (Петри) стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) однократного применения стерильные полимерные | - |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | - |
| Петля бактериологическая одноразовая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 5556 |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Бокс микробиологической безопасности | ГОСТ Р ЕН 12469 |
| Примечание: допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Агар бактериологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | - |
| Натрия хлорид (NaCl) | Химически чистый, ГОСТ 4233 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный (K2HPO4) | Чистый для анализа, ГОСТ 2493 |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH2PO4) | Химически чистый, ГОСТ 4198 |
| Магний сернокислый (MgSO4) | Чистый, ГОСТ 4523 |
| Аммоний сернокислый ((NH4)2SO4) | Чистый, ГОСТ 9097 |
| Гидролизат казеина | ГОСТ 31689 |
| D-глюкоза | ГОСТ 6038 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ 5962 |
| Примечание: допускается использование других питательных сред, диагностических препаратов и реактивов с аналогичными характеристиками, а также селективных сред. | |
VI. Требования безопасности
6.1. Выполнение измерений концентрации клеток микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 в воздухе рабочей зоны осуществляют в соответствии с законодательством Российской Федерации <3>.
<3> Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <4> и инструкции по эксплуатации прибора.
<4> ГОСТ 12.1.009 «Элетробезопасность. Термины и определения», введенный приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 942-ст.
6.3. Работа с микроорганизмами проводится в боксированных помещениях либо в боксах микробиологической безопасности не ниже II класса <5>. Все виды работ с реактивами проводят в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <6>.
<5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
<6> Глава I СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 2 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный № 62296), с изменениями, внесенными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.12.2022 № 24 (зарегистрировано Минюстом России 09.03.2023, регистрационный № 72558).
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. Условия измерений
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха — плюс 15 — 25 °C;
- атмосферное давление — (760 +/- 20) мм рт. ст.;
- влажность воздуха — не более 60%.
VIII. Приготовление агаризованной питательной среды
8.1. Для приготовления mPCA используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1000 см3): K2HPO4 - 1,5; KH2PO4 - 0,75; MgSO4 — 1,0; (NH4)2SO4 — 4,0; NaCl — 30,0; гидролизат казеина — 5,0; дрожжевой экстракт — 2,5; D-глюкоза — 1,0; агар — 14,0; дистиллированная вода — 1000 см3; pH 7,0.
8.2. Сухие компоненты растворяют в 1000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и стерилизуют паром при 0,5 атм. в течение 30 минут.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение не более 10 дней.
8.5. Для длительного хранения штамм лиофилизируют с применением защитной среды, содержащей обезжиренное молоко (10% веса) с добавлением глюкозы (7,5% веса).
IX. Проведение измерения
9.1 Отбор проб воздуха.
Отбор проб воздуха проводят в соответствии с методическими документами <7>.
<7> МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 06.06.2001; ГОСТ Р 8.563 «Методики (методы) измерений», введенный приказом Ростехрегулирования от 15.12.2009 № 1253-ст.
Для этого воздух отбирают при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма (табл. 9.1).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную mPCA расплавляют, охлаждают до температуры плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими документами <8>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс (37 +/- 1) °C не менее чем на (18 +/- 2) часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс 2 — 8 °C не более 10 дней.
<8> Подпункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее — МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (24 +/- 2) °C. Через 4 — 5 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим и тинкториальным признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с ростовыми свойствами питательных сред <9>. Для этого микроорганизм Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<9> Пункт 7 МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизированную культуру микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
9.2.6. Идентификацию микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 до вида можно проводить с помощью анализа гена 16S РНК на основе ПЦР-реакции.
X. Вычисление результатов измерения
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле (1):
\text{К } = \frac{\text{П } \cdot 1000}{\text{С } \cdot T} , (1)
где К — концентрация штамма в воздухе, КОЕ/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. Оформление результатов измерений
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
Приложение к МУК 4.2.3994-24 (рекомендуемый образец)
Протокол № количественного микробиологического анализа микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 ВКПМ Ac-2076 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Место отбора пробы (адрес, точка отбора пробы) _________________________
3. Вид пробоотборника _____________________________________________________
4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
5. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _____________________________________________
8. Результаты идентификации микроорганизма Arthrobacter psychrochitiniphilus штамм ARC 42 ВКПМ Ac-2076 (морфологические признаки)
9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________
10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК ______________________
11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________
12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
3. СанПиН 1.2.3685-21 «Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания».
4. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.11.2020 № 1847 «Об утверждении перечня измерений, относящихся к сфере государственного регулирования обеспечения единства измерений».
5. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
6. МУК 4.2.1054-01 «Измерение концентраций микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе населенных мест».
7. ГОСТ 12.1.009 «Электробезопасность. Термины и определения».
8. ГОСТ OIML R 76-1 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
9. ГОСТ OIML R 111-1 «Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования».
10. ГОСТ 1770 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
11. ГОСТ 29228 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 2. Пипетки градуированные без установленного времени ожидания».
12. ГОСТ 28498 «Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний».
13. ГОСТ 13646 «Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия».
14. ГОСТ Р 51945 «Аспираторы. Общие технические условия».
15. ГОСТ 28311 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».
16. ГОСТ 27987 «Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия».
17. ГОСТ 13350 «Анализаторы жидкости кондуктометрические ГСП. Общие технические условия».
18. ГОСТ 31598 «Стерилизаторы паровые большие. Общие технические требования и методы испытаний».
19. ГОСТ Р ЕН 13060 «Стерилизаторы паровые малые».
20. ГОСТ 22340 «Аквадистилляторы медицинские электрические. Общие технические требования и методы испытаний».
21. ГОСТ 28489 «Микроскопы световые. Термины и определения».
22. ГОСТ 25706 «Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования».
23. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
24. ГОСТ 23932 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия».
25. ГОСТ 9412 «Марля медицинская. Общие технические условия».
26. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
27. ГОСТ 12026 «Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия».
28. ГОСТ Р ЕН 12469 «Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности».
29. ГОСТ 17206 «Агар микробиологический. Технические условия».
30. ГОСТ Р 58144 «Вода дистиллированная. Технические условия».
31. ГОСТ 4233 «Натрий хлористый. Технические условия».
32. ГОСТ 2493 «Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».
33. ГОСТ 4198 «Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия».
34. ГОСТ 4523 «Магний серно-кислый 7-водный. Технические условия».
35. ГОСТ 9097 «Сульфат аммония. Технические условия».
36. ГОСТ 31689 «Казеин. Технические условия».
37. ГОСТ 6038 «D-глюкоза. Технические условия».
38. ГОСТ 17299 «Спирт этиловый технический. Технические условия».
39. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия».