МУК 4.2.3673-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Идентификация видовой принадлежности рыб семейства тресковых методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 14.12.2020)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 14 декабря 2020 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ РЫБ СЕМЕЙСТВА ТРЕСКОВЫХ МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3673-20
1. Разработаны ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М.В. Зароченцев, Д.С. Кудрявцев), ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии» (Н.С. Мюге, А.А. Сергеев), ООО «ГенБит» (И.И. Гревцева, М.М. Никитин, П.А. Французов, А.Г. Голиков).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 14 декабря 2020 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают методы идентификации рыб семейства тресковых (треска атлантическая (Gadus morhua), треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus), пикша (Melanogrammus aeglefinus), путассу (Micromesisteus poutassou), сайда (Pollachius virens), минтай (Gadus chalcogrammus), мерланг (Meriangius meriangus)) в продовольственном (пищевом) сырье и пищевых продуктах.
1.2. Представленные методы основаны на использовании полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, в том числе в формате свободно конфигурируемых ПЦР-матриц (включая предподготовленные ПЦР-матрицы). Методы направлены на выявление специфических последовательностей ДНК в геноме тресковых рыб.
1.3. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы лабораториями, осуществляющими исследования пищевых продуктов и продовольственного сырья.
1.4 МУК носят рекомендательный характер.
II. Аналитические характеристики метода
2.1. Аналитическая чувствительность метода составляет 104 копий ДНК в одном миллилитре раствора образца.
2.2. Аналитическая специфичность метода ПЦР в матричном формате аналогична аналитической специфичности ПЦР в классическом формате. Отсутствует положительная реакция в тестах с ДНК нецелевых объектов (ДНК близкородственных и других видов).
III. Оборудование и реактивы
3.1. Лаборатории, осуществляющие исследования, должны быть организованы в соответствии с методическими документами <1>, регламентирующими работу лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот.
<1> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
3.2 Для проведения исследований используется следующее оборудование:
- амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени, обеспечивающий проведение термоциклирования в ячейках объемом до 1,5 мкл, ячейках планшета или в микропробирках объемом до 200 мкл;
- ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения;
- общелабораторный холодильник с морозильником с температурой от плюс 3 °C до плюс 16 °C/минус 9 °C до минус 30 °C;
- микроцентрифуга настольная для пробирок конических полипропиленовых с крышкой объемом 1,5 — 2 мл (максимальное ускорение не менее 11000 g);
- аппарат для встряхивания типа «Вортекс» или микроцентрифуга «Вортекс» (максимальное ускорение не менее 450 g);
- термостат твердотельный для пробирок конических полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5 — 2 мл, диапазон температур — от плюс 20 °C до плюс 99 °C, количество гнезд — не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры 1 °C, разность температур между соседними ячейками — не более 0,5 °C;
- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;
- гомогенизатор лабораторный (опционально);
- облучатель бактерицидный настенный;
- дозаторы механические с переменным объемом дозирования: 0,2 — 2,5 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 1,2%; 0,5 — 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%; 2 — 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%; 20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%; 100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%;
- дозатор электронный с переменным объемом дозирования 0,5 — 10,0 мкл, обеспечивающий функцию диспенсирования (повторного дозирования, опционально).
Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
3.3 Для проведения исследований используются следующие расходные материалы:
- пробирки микроцентрифужные конические полипропиленовые с крышкой по типу «Эппендорф» вместимостью 1,5 см3, 0,5 см3, 0,2 см3;
- наконечники одноразовые с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 100; 200; 1000 мкл;
- при использовании микрочипового формата: ПЦР-матрицы (микрочипы) с иммобилизованными реактивами, предподготовленные для выявления и идентификации рыб семейства тресковые (треска атлантическая (Gadus morhua), треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus), пикша (Melanogrammus aeglefinus), путассу (Micromesisteus poutassou), сайда (Pollachius virens), минтай (Gadus chalcogrammus), мерланг (Meriangius meriangus)), в том числе в их смесях.
Определяемые генетические элементы и используемые специфические реактивы (праймеры, ДНК-зонды) для каждой ПЦР-тест-системы представлены в приложении к настоящим МУК.
3.4 Для проведения исследований используются следующие реактивы:
- набор реактивов для выделения ДНК из пищевых продуктов и продовольственного сырья;
- тест-системы для выявления и идентификации рыб семейства тресковых, в том числе в виде коммерческих готовых наборов реагентов;
- буфер для ПЦР с MgCl2 концентрированный (10x);
- вода деионизованная;
- герметизирующая жидкость для предотвращения испарения реакционной смеси в процессе термоциклирования (минеральное масло, полиметилсилоксан).
VI. Подготовка образцов для анализа
4.1. Отбор проб пищевых продуктов и продовольственного сырья для выполнения лабораторных исследований проводят в соответствии с ГОСТ 31904.
4.2. При исследовании тушек (в том числе их фрагментов) или филе следует учитывать особенности добычи и улова рыбы, в частности вероятность контаминации чужеродной ДНК при контакте с другими видами рыб в процессе добычи и транспортировки. Для минимизации вероятности контаминации рекомендуется отбирать образец для последующего анализа из участков тушки/филе, не контактировавших с внешней средой (по возможности исключить отбор кожи, плавников, чешуи и т.п.).
V. Выделение ДНК
5.1. Для выделения ДНК используют готовые наборы реактивов, предназначенные для работы с пищевыми продуктами и продовольственным сырьем. Выделение ДНК осуществляется в соответствии с протоколом (инструкцией по применению), рекомендованным производителем.
5.1.1. Для упрощения процедуры выделения ДНК рекомендуется применение методов, основанных на использовании сорбентов.
5.1.2. Не допускается использовать методы выделения ДНК, основанные на применении комбинации реагентов «гуанидин — фенол — хлороформ».
5.2. Полученный препарат ДНК следует хранить при плюс 4 °C (кратковременное хранение, не более 6 ч) или в морозильной камере при минус 20 °C (длительное хранение, до 1 года).
VI. Проведение амплификации с детекцией в режиме реального времени
6.1. Для проведения анализа рекомендуется использовать коммерческие наборы реактивов (предподготовленные ПЦР-матрицы). В этом случае подготовку ПЦР-смесей и амплификацию необходимо проводить в соответствии с инструкцией производителя тест-систем (ПЦР-матриц).
6.2 В случае использования самостоятельно подготовленных ПЦР-матриц:
6.2.1. Подготовить реакционные объемы (пробирки, планшет) в количестве n x m, где n — количество исследуемых образцов, m — количество тест-систем в ПЦР-матрице (включая контрольные образцы).
6.2.2. Приготовить ПЦР-смесь объемом (n x m + 1) x 16 мкл, где n — количество исследуемых образцов, m — количество тест-систем в ПЦР-матрице (включая контрольные образцы). Пробирки с ПЦР-смесью в процессе приготовления должны находиться при температуре 0 °C (в емкости со смесью льда и воды или охлаждающем штативе). Состав ПЦР-смеси приведен в табл. 1.
Состав ПЦР-смеси (мастер-микса) на 16 мкл
6.2.3. В каждый элемент ПЦР-матрицы (пробирку, ячейку планшета) внести по 16 мкл ПЦР-смеси, приготовленной по п. 6.2.2. В реакционные объемы, предназначенные для идентификации образцов, внести по 9 мкл ДНК исследуемых образцов. В реакционные объемы, предназначенные для отрицательных контрольных образцов, внести по 9 мкл деионизованной воды.
6.2.4. Установить подготовленные ПЦР-матрицы (пробирки, планшеты) в амплификатор нуклеиновых кислот в соответствии с инструкцией по эксплуатации. С использованием управляющего программного обеспечения для амплификатора ввести программу амплификации в соответствии с табл. 2. Для каждой тест-системы установить соответствующий канал регистрации флуоресцентного сигнала. Запустить анализ.
VII. Регистрация и интерпретация результатов
7.1. Регистрация результатов амплификации на большинстве современных моделей амплификаторов происходит автоматически в режиме реального времени и отображается в виде графиков зависимости флуоресцентного сигнала от номера цикла ПЦР. Расчет значений пороговых циклов производится в соответствии с руководством к программному обеспечению амплификатора.
7.2. Указанные ниже критерии отнесения конкретного образца к содержащим или не содержащим видоспецифичную ДНК являются едиными для любого используемого формата ПЦР (пробирки, планшет, микрочипы).
7.3 Результат анализа считается достоверным, если выполнены следующие условия:
7.3.1. для внутреннего контрольного образца значение порогового цикла не превышает 25,00;
7.3.2. для отрицательных контролей ПЦР (К-) флуоресцентный сигнал не регистрируется (не превышает порогового значения);
7.3.3. в случае если хотя бы одно из условий 7.3.1 - 7.3.2 не выполняется, анализ необходимо повторить.
7.4. Видоспецифичная ДНК рыб семейства тресковых (треска атлантическая (Gadus morhua), треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus), пикша (Melanogrammus aeglefinus), путассу (Micromesisteus poutassou), сайда (Pollachius virens), минтай (Gadus chalcogrammus), мерланг (Meriangius meriangus)) обнаружена, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла не превышает 30.
7.5. Видоспецифичная ДНК рыб семейства тресковых не обнаружена, если для соответствующей пробирки/реактора значение порогового цикла превышает 30 или флуоресцентный сигнал не регистрируется.
7.6. Интерпретацию результатов анализа проводят согласно табл. 3.
7.6.1. При применении готовых наборов реагентов (тест-систем) интерпретацию результатов проводят в соответствии с инструкцией по применению соответствующего набора.
Примечание: «+» — флуоресцентный сигнал регистрируется; «-» — отсутствие сигнала флуоресценции.
ОПРЕДЕЛЯЕМЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ
| Вид/род | Мишень | Номер в базе данных GenBank <2> и последовательности специфических олигонуклеотидов (праймеров и зондов) |
| 1 | 2 | 3 |
| Треска атлантическая (Gadus morhua) | Ген пантофизина (panI) | AF288943.1 PRF <*>: CAATGTTAATGTTTCTCCTACTTT PRR <*>: TGACGAAGTGTAGTTGCCAA Probe <*>: ROX-CAGCATCCTTACCAAGTCCCTACC-BHQ2 |
| Треска тихоокеанская (Gadus macrocephalus) | Ген субъединицы 2 NADH — дегидрогеназы (ND2) | EU729423.1 PRF: ATGTGTCAGATTATACCAGTTAATTC PRR: GTTGGTTAAATTGTATAACAAGGA Probe: FAM-TCTGGGCGTGACCTCAACACTA-BHQ1 |
| Пикша (Melanogrammus aeglefinus) | Ген АТФазы 6 (ATP6) | DQ010963.1 PRF: AATTTAGGCTTAGCTGTTCC PRR: GAATTAGAGCTGTAGGGGTG Probe: ROX-TAGCAACTGTTCTTATTGGAATACGAA-BHQ2 |
| Путассу (Micromesisteus poutassou) | Ген пантофизина (panI) | AY292496.1 PRF: ACTCTCCTGGTTGATTGATATT PRR: CTATACAGGTGTTGGAAGCC Probe: FAM-CTTGTTTCTTAGATTGATGCAGCATT-BHQ1 |
| Сайда (Pollachius virens) | Ген пантофизина (panI) | AY292491.1 PRF: GTTTGTGCTATCATACCCATC PRR: GGACTTTGTAAGAATGCTGC Probe: ROX-CTCCTAAATCGTGGCTGGTTGA-BHQ2 |
| Минтай (Gadus chalcogrammus) | Ген пантофизина (panI) | AY292495.1 PRF: GCAATGTTAATGTTTCTCCTACT PRR: AGTTAGTTGCCAATAAGGAAAG Probe: FAM-CAGCATTCTTACACAGTCCCTACCT-BHQ1 |
| Мерланг (Meriangius meriangus) | Ген родопсина (rhod) | EU492056.1 PRF: TACACCCGCGCTGAGG PRR: GTAGATGGACGAGGACTTGG Probe: FAM-AGATGGGACCGAAGACGCTG-BHQ1 |
| Внутренний контрольный образец | Ген цитохрома b (cytb) P. onca | KM236783.1 PRF: GTAGACAAAGCCACCCTAACACG PRR: GTAGAACACCCCTAGATCACCATCG Probe: ROX-GGTCTCTTCCTAGCCATACACTACAC-BHQ2 Плазмида со вставкой tatatGTA-GACAAAGCCACCCTAACACGatatatatGGTCTCTTCCTAGCCATACACTACACatatatataCGATGGTGATCTAGGGGT-GTTCTACatat |
| Примечание. <*> PRF — прямой праймер, PRR — обратный праймер, Probe — ДНК-зонд. Последовательности приведены в направлении 5' — 3'. | ||
<2> Официальный сайт https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/