МУК 4.2.3586-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Идентификация и количественное определение новых линий ГМ кукурузы (DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG) и сои (MON87708) в пищевых продуктах по технологии TaqMan. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 05.11.2019)
Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
А. Ю. Попова
5 ноября 2019 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НОВЫХ ЛИНИЙ
ГМ КУКУРУЗЫ (DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG) И СОИ (MON87708)
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ ПО ТЕХНОЛОГИИ TaqMan
МУК 4.2.3586-19
1. Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (В.А. Тутельян, Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова), ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (М.В. Зароченцев, Д.С. Кудрявцев), Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФГУ «ФИЦ Биотехнологии» РАН (К.Г. Скрябин, Д.С. Груздев, М.В. Сухачева); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 05 ноября 2019 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной (далее — ГМ) кукурузы DAS-40278-9, MZIR098, MZHG0JG и сои MON87708 (ГМ-специфичной ДНК).
1.2. Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее — ПЦР-РВ) по технологии TaqMan <1>, и могут быть использованы для контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами (далее — ГМО) в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения). Поскольку возможность проведения ПЦР-РВ напрямую зависит от количества и качества ДНК, выделяемой из анализируемого продукта, при выборе метода экстракции ДНК следует руководствоваться требованиями ГОСТ Р ИСО 21571. Количество и качество выделенной ДНК может быть определено согласно ГОСТ Р 53244.
<1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченого флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы; при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.
1.3. Для интерпретации результатов ПЦР-РВ и расчета содержания ГМО применен метод относительного анализа по двум калибровочным кривым.
1.4. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
1.5 Методические указания носят рекомендательный характер.
II. Принцип идентификации и количественного определения ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым
2.1. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:
- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);
- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).
2.2. Для построения калибровочных кривых должны быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее — ССО) с известным содержанием ДНК <2>.
<2> Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM), ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (American Oil Chemists Society; AOCS) или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.
Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) — по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.
2.3. Количество ГМ-специфичной ДНК (рис. 2.1) и таксон-специфичной ДНК (рис. 2.2) в пробах определяется путем линейной интерполяции по соответствующим калибровочным кривым.
Рис. 2.1. Пример количественного анализа продуктов
амплификации ГМ-специфичной ДНК кукурузы линии DAS-40278-9
Рис. 2.2. Пример количественного анализа продуктов
амплификации таксон-специфичного гена hmg кукурузы
2.4. Содержание ГМО в пробе представляет собой отношение ГМ-специфичной ДНК к таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:
\text{ГМО},\% = \frac{\text{Количество ГМ} - \text{специфичной ДНК}}{\text{Количество таксон} - \text{специфичной ДНК}} \times 100
III. Методы идентификации и количественного определения линий ГМ кукурузы
3.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии DAS-40278-9 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события DAS-40278-9, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген hmg, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (high mobility group, HMG).
3.1.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.
3.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.1 - 3.4.
Примечание. Для определения кукурузы линии DAS-40278-9 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.
Количество геномных копий ГМ-кукурузы <*> в растворах
ДНК, используемых для построения калибровочных кривых
| Показатель | Концентрация ДНК в растворе | |||
| Раствор 1, 10% (получен из 10% ССО <**>) | Раствор 2, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 1) | Раствор 3, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 2) | Раствор 4, (получен путем 5-кратного разбавления Раствора 3) | |
| Общее содержание ДНК в реакции, нг | 200 | 40 | 8 | 1,33 |
| Референсный ген кукурузы hmg, копии | 73394 | 14679 | 2936 | 489 |
| Трансформационное событие DAS-40278-9, копии | 7339 | 1468 | 294 | 49 |
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК, DAS-40278-9 | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,50 |
| Праймер DAS-40278-9_5'-f1 (10 мкМ) | 350 нМ | 0,875 |
| Праймер DAS-40278-9_5'-r3 (10 мкМ) | 350 нМ | 0,875 |
| Зонд DAS-40278-9_5'-S2 (10 мкМ) | 150 нМ | 0,375 |
| Вода деионизированная | - | 5,375 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК, hmg | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,50 |
| Праймер MaiJ-F (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Праймер mhmg-R (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Зонд mhmg-P (10 мкМ) | 180 нМ | 0,45 |
| Вода деионизированная | - | 5,55 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
<*> Реакционная смесь, согласно протоколу Joint Research Centre (Объединенный Научный Центр Европейского Союза, далее — JRC), для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.
<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события DAS-40278-9. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.
| Стадия | Температура, °C | Время, с | Детекция | Циклы |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 45 |
| 60 | 60 | да |
3.2. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZIR098 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZIR098, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген adh1, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.
3.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 200 нг ДНК кукурузы.
3.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.5 - 3.8.
Примечание. Для определения кукурузы линии MZIR098 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.
Количество геномных копий ГМ-кукурузы <*> в растворах
ДНК, используемых для построения калибровочных кривых
<**> Для приготовления раствора может быть использован 99% ССО, кат. № AOCS 1114-B.
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер MZIR098-f (10мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Праймер MZIR098-r (10мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Зонд MZIR098-p (10мкМ) | 100 нМ | 0,25 |
| Вода деионизированная | - | 5,75 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер Zm adh1-F | 300 нМ | 0,75 |
| Праймер Zm adh1-R | 300 нМ | 0,75 |
| Зонд Zm adh1-P | 200 нМ | 0,50 |
| Вода деионизированная | - | 5,50 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.
<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZIR098. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.
| Стадия | Температура, °C | Время, с | Детекция | Циклы |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 40 |
| 60 | 60 | да |
3.3. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MZHG0JG основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события MZHG0JG, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген adh1, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1.
3.3.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,01% в 250 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,08% в 250 нг ДНК кукурузы.
3.3.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 3.9 - 3.12.
Примечание. Для определения кукурузы линии MZHG0JG допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.
Количество геномных копий ГМ-кукурузы <*> в растворах
ДНК, используемых для построения калибровочных кривых
<**> Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. № AOCS 1114-C.
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер MZHG0JG forward prime (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Праймер MZHG0JG reverse primer (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Зонд MZHG0JG probe (10 мкМ) | 100 нМ | 0,25 |
| Вода деионизированная | - | 5,75 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер Zm adh1 primer F (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Праймер Zm adh1 primer R (10 мкМ) | 300 нМ | 0,75 |
| Зонд Zm adh1 probe (10 мкМ) | 200 нМ | 0,50 |
| Вода деионизированная | - | 5,5 |
| Образец ДНК | - | 5 |
| Итого: | 25 мкл | |
<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.
<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MZHG0JG. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.
| Стадия | Температура, °C | Время, с | Детекция | Циклы |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 40 |
| 60 | 60 | да |
IV. Метод идентификации и количественного определения ГМ сои линии MON87708
4.1. Метод идентификации и количественного определения сои линии MON87708 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87708, расположенная на границе геномной ДНК сои и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для сои целевая последовательность — ген le1, кодирующий лектин.
4.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК сои; предел количественного определения метода составляет как минимум 0,085% в 200 нг ДНК сои.
4.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 4.1 - 4.4.
Количество геномных копий ГМ-сои <*> в растворах
ДНК, используемых для построения калибровочных кривых
<*> Из расчета массы генома сои, равной 1,13 пкг
<**> Для приготовления раствора может быть использован 100% ССО, кат. № AOCS 0311-A.
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 25 |
| Праймер MON87708 primer 1 (10 мкМ) | 300 нМ | 1,5 |
| Праймер MON87708 primer 2 (10 мкМ) | 300 нМ | 1,5 |
| Зонд MON87708 probe (5 мкМ) | 150 нМ | 1,5 |
| Вода деионизированная | - | 16,5 |
| Образец ДНК (не более 200 нг) | - | 4 |
| Итого: | 50 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 25 |
| Праймер lec F (10 мкМ) | 150 нМ | 0,75 |
| Праймер lec R (10 мкМ) | 150 нМ | 0,75 |
| Зонд lec P probe (5 мкМ) | 50 нМ | 0,50 |
| Вода деионизированная | - | 19 |
| Образец ДНК (не более 200 нг) | - | 4 |
| Итого: | 50 мкл | |
<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.
<*> Согласно протоколу JRC, для количественного определения трансформационного события MON87708. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.
| Стадия | Температура, °C | Время, с | Детекция | Циклы |
| Активация урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) | 50 | 120 | нет | 1 |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 45 |
| 60 | 60 | да |
4.2.3. Для определения сои линии MON87708 допустимо использование тест-систем с аналогичными техническими характеристиками и разрешенными для использования в установленном порядке.
Библиографические ссылки
1. ГОСТ Р 53244 (ИСО 21570). Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы, основанные на количественном определении нуклеиновых кислот. М.: Стандартинформ, 2009. 60 с.
2. ГОСТ Р ИСО 21571. Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот.
3. Arumuganathan K., Earle E.D., 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9: 208 — 218.
4. Event-specific Method for the Quantification of maize DAS-40278-9 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/2012-08-15_EURL-VL-10-10%20VM_JRC76621.pdf
5. Event-specific Method for the Quantification of maize MZHG0JG by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-04-16-VM.pdf
6. Event-specific Method for the Quantification of maize MZIR098 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/StatusOfDossiers.aspx
7. Event-specific Method for the Quantification of soybean MON87708 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-ll_VM.pdf
8. Seifi M., Ghasemi A., Heidarzadeh S., Khosravi M., Namipashaki A., Soofiany V.M. et al. Overview of real-time PCR principles. In: Polymerase chain reaction / ed. by Hernandez-Rodriguez P. Rijeka, Croatia: InTech, 2012. 566 p.