--- title: "\"МУК 4.2.3035-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз, бета-глюканазы и ксиланазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.3035-12" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-3035-12" --- ## "МУК 4.2.3035-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз, бета-глюканазы и ксиланазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания" # "МУК 4.2.3035-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз, бета-глюканазы и ксиланазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания" (утв. и введены в действие Роспотребнадзором 20.07.2012)
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
20 июля 2012 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ** **КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA** **LONGIBRACHIATUM TW-420 ВКМ F-3880D - ПРОДУЦЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗ,** **БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.2.3035-12**
Дата введения
с момента утверждения 1. Разработаны ГБОУ ВПО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина). 2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды". 3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г. 4. Введены впервые. ### 1. Общие положения и область применения Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D - продуцента целлюлаз, $\beta - \text{глюконаз}$ и ксиланаз в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений". Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. ### 2. Биологическая характеристика мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D и его гигиенический норматив Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D является продуцентом комплекса целлюлаз, $\beta - \text{глюконаз}$ и ксиланаз. Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. longibrachiatum TW-307 ВКМ F-3865D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3880D. Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар) при t 29 - 34 °C в течение 7 суток, pH 3,5 - 5,0. При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80 - 90 мм на 7-е сутки при росте при t 25 °C. Мицелий развит преимущественно субстратный, воздушный мицелий - скудный, белого цвета. Цвет колонии первоначально белый, затем при формировании спор - зеленый. Обратная сторона колоний имеет светло-зеленовато-желтоватую окраску. При микроскопировании штамм имеет конидии, которые формируются в многочисленных компактных подушечках диаметром до 2 мм. Конидиеносцы бесцветные, гладкостенные формируются на субстратном мицелии, главные ветви которого длинные и прямые, иногда извитые. Боковые ветви короткие, формируются через неравные интервалы под углом к главным ветвям. Фиалиды одиночные, булавовидные или бутыловидные, размер 5 - 10 x 2 - 3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидные размером 4 - 7 x 2 - 4 мкм собраны в мелкие головки на вершинах фиалид. ### 3. Пределы измерений Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95. ### 4. Метод измерений Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. ### 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. #### 5.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Импактор микробиологический "Флора-100" ТУ 9443-001-05031637-02 Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77 воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением x10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные ГОСТ 23932-90 стеклянные диаметром 90 мм Пробирки бактериологические П1 и П2 ГОСТ 25336-82 вместимостью 15 и 20 мл Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая [ГОСТ 5556-81](https://bukva.ai/docs/gost-5556-81) #### 5.2 Реактивы, растворы Агар микробиологический ГОСТ 17206-84 D-Глюкоза [ГОСТ 6038-79](https://bukva.ai/docs/gost-6038-79) (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций) Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67) Кислота молочная пищевая ГОСТ 490-79 (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры) Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель 200, агар - 18 - 20, pH 4,5 - 5,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза - 15 - 20 перед использованием) Среда Гетчинсона, г/л (KH PO - 0,1; NaCl - 0,1; 2 4 CaCl - 0,1; FeCl - 0,1; MgSO x 7H O - 0,3; 2 3 4 2 NaNO - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода) 3 0,5%-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость $\mu$ 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF 0,1%-й раствор Конго красного (congo rot) ### 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования. 6.1. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". 6.2. ГОСТ 12.1.005-88 "Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами". 6.3. ГОСТ 12.1.019-79 "Электробезопасность при работе с электроустановками" и инструкции по эксплуатации прибора. 6.4. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977). 6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ### 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ### 8. Условия измерений Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%. ### 9. Проведение измерения #### 9.1 Условия отбора проб воздуха Для определения концентрации клеток мицелиального гриба воздух аспирируют при помощи пробоотборника "Флора" со скоростью 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и от марки пробоотборника. Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. #### 9.2 Выполнение анализа При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки. При выполнении анализа дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз. Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, [вып. 2](https://bukva.ai/docs/gf-xi-minzdrav-sssr-ministerstvo), с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды. ### 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
$X = \frac{N \cdot 1000}{V} \text{кл}./\text{м}^{3},$
где X - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента. Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин). Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод. ### 11. Оформление результатов измерений Результаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол N количественного микробиологического анализа штамма Tr. longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D в воздухе рабочей зоны 1. Дата проведения анализа ________________________________________________ 2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________ 3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________ 4. Вид пробоотборника _____________________________________________________ 5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____ ___________________________________________________________________________ 6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________ 7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.) ____________________________________________________________________ 8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ____________ 9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________ 10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК __________________ а.в. 11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________ 12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________ ## СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. ГОСТ 12.1.005-88. ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования 2. [ГОСТ 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329). ГСИ. Методики выполнения измерений 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. ---