--- title: "\"МУК 4.2.3033-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.3033-12" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-3033-12" --- ## "МУК 4.2.3033-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" # "МУК 4.2.3033-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 20.07.2012) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100005) в действие с 20 июля 2012 года. Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации **Г.Г.ОНИЩЕНКО** 20 июля 2012 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ** **КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM** **PV2007 BKM F-3972D - ПРОДУЦЕНТА КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ** **В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.2.3033-12** Дата введения: с момента утверждения ## 1. Общие положения и область применения Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха. Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма P. verruculosum PV2007 BKM F-3972D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований [ГОСТ 17.2.4.02-81](https://bukva.ai/docs/gost-17-2-4-02-81) "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и [ГОСТ 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "ГСИ. Методики выполнения измерений". Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. ## 2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D и его гигиенический норматив Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов - ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K BKM F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером BKM F-3972D. Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 - 30 °C в течение 7 - 10 суток, pH 4,5 - 5,0. При t 5 °C рост колоний не наблюдается. На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 - 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 - 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии - палево-оранжевая. При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 - 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 - 13 x 2,5 - 3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7 - 8 x 2,8 - 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 - 3,5 мкм. ## 3. Пределы измерений Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95. ## 4. Метод измерений Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам. ## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. ### 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Импактор микробиологический "Флора-100" ТУ 9443-001-05031637-02 Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77 Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением x 10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 90 мм ГОСТ 23932-90 Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл ГОСТ 25336-82 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 ### 5.2. Реактивы, растворы Агар микробиологический ГОСТ 17206-84 D-Глюкоза (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций) [ГОСТ 6038-79](https://bukva.ai/docs/gost-6038-79) Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67) Кислота молочная пищевая (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры) ГОСТ 490-79 Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель - 200, агар - 18 - 20, pH 4,5 - 5,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза - 15 - 20 перед использованием) Среда Гетчинсона, г/л ( $KH_{2}PO_{4}$ - 0,1; NaCl - 0,1; $CaCl_{2}$ - 0,1; $FeCl_{3}$ - 0,1; $MgSO_{4} \times 7H_{2}O$ - 0,3; $NaNO_{3}$ - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода) 0,5%-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость $\mu$ 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF 0,1%-й раствор Конго Красного (congo rot) ## 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования. 6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". 6.2. ГОСТ 12.1.005-88 "Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами". 6.3. ГОСТ 12.1.019-79 "Электробезопасность при работе с электроустановками". 6.4. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977). 6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ## 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ## 8. Условия измерений Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%. ## 9. Проведение измерения ### 9.1. Условия отбора проб воздуха Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника. Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. ### 9.2. Выполнение анализа При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки. При выполнении анализа воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбокси-метилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз. Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная [Фармакопея](https://bukva.ai/docs/gf-xi-minzdrav-sssr-ministerstvo) СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды. ## 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле: $X = \frac{N \cdot 1000}{V} \text{кл}./\text{м}^{3}$ , где X - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха; V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента. Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной [формуле](#p100073), где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин). Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод. ## 11. Оформление результатов измерений Результаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол N количественного микробиологического анализа штамма P. verruculosum PV2007 BKM F-3972D в атмосферном воздухе населенных мест 1. Дата проведения анализа ________________________________________________ 2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________ 3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________ 4. Вид пробоотборника _____________________________________________________ 5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____ 6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________ 7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.) ______________________________________________________________________ 8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ____________ 9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________ 10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК __________________ а.в. 11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________ 12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________ ## Список литературы 1. [РД 52.04.186-96](https://bukva.ai/docs/rukovodstvo-rd-52-04-186-89) "Руководство по контролю загрязнения атмосферы". М., 1991, 693 с. 2. [ГОСТ 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "ГСИ. Методики выполнения измерений". 3. [ГОСТ 17.2.4.02-81](https://bukva.ai/docs/gost-17-2-4-02-81) "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с. ---