МУК 4.2.3019-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация и проведение лабораторных исследований на иерсиниозы на территориальном, региональном и федеральном уровнях. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 18.06.2012)

с момента утверждения

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ИЕРСИНИОЗЫ НА ТЕРРИТОРИАЛЬНОМ, РЕГИОНАЛЬНОМ И ФЕДЕРАЛЬНОМ УРОВНЯХ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3019-12

1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, Ю. В. Демина, Н. В. Шеенков); Федеральным бюджетным учреждением науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора (Г. Я. Ценева, Е. А. Воскресенская, Г. И. Кокорина, Е. А. Богумильчик); Федеральным казенным учреждением здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (М. В. Чеснокова, С. В. Балахонов, В. Т. Климов, К. А. Тирских, М. Б. Черепанова); Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения (Центр гигиены и эпидемиологии в Новосибирской области» (Т. В. Каримова, О. В. Якунина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 18 июня 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУ) определяют организацию и порядок проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях территориального, регионального и федерального уровней.

1.2. МУ предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы медицинскими и другими организациями, независимо от организационно-правовой формы и формы собственности.

2. Нормативные и методические документы

В настоящих методических указаниях использованы ссылки и положения следующих нормативных и методических документов:

2.1. Федеральный закон от 03.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2.2. Постановление Правительства Российской Федерации от 16.04.2012 № 317 «О лицензировании деятельности в области использования возбудителей инфекционных заболеваний человека и животных (за исключением случая, если указанная деятельность осуществляется в медицинских целях) и генно-инженерно-модифицированных организмов III-IV степени потенциальной опасности, осуществляемой в замкнутых системах».

2.3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 24.02.2009 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера».

2.4. Приказ Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 07.07.2009 № 415н «Об утверждении квалификационных требований к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения».

2.5. Приказ Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 17.03.2008 № 88 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней».

2.6. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

2.7. СП 1.3.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами».

2.8. СП 1.3.2322-08 «Санитарно-эпидемиологические правила „Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней“.»

2.9. СП 1.3.2518-09 «Санитарно-эпидемиологические правила „Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08“.»

2.10. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

2.11. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».

2.12. МУ 3.1.2438-09 «Эпидемиологический надзор и профилактика псевдотуберкулеза и кишечного иерсиниоза».

2.13. МУК 4.2.2746-10 «Порядок применения молекулярно-генетических методов при обследовании очагов острых инфекций с групповой заболеваемостью».

2.14. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниозов».

3. Перечень сокращений

БХ — бульон Хоттингера

ЗФР — забуференный физиологический раствор

ИФА — иммуноферментный анализ

ЛПО — лечебно-профилактические организации

МО — медицинские организации

ОРА — ориентировочная реакция агглютинации

ПУС — полиуглеводная среда

ПК — пептонно-калиевая среда

ПЦР — полимеразная цепная реакция

РА — реакция агглютинации

РНГА — реакция непрямой гемагглютинации

СанПиН — санитарные правила и нормы

СБТС — среда с бромтимоловым синим

СП — санитарно-эпидемиологические правила

УСС — универсальный скошенный столбик

4. Общие положения

Yersinia pseudotuberculosis (возбудитель псевдотуберкулеза) и Yersinia enlerocolitica (возбудитель кишечного иерсиниоза) — энтеропатогенные иерсинии, относимые к возбудителям зооантропонозных инфекций. Заражение) Y. pseudotuberculosis происходит через инфицированные продукты питания (преимущественно овощи), Y. enierocolitica — чаше при употреблении в пищу молочных и мясных продуктов.

Иерсиниозы широко распространены в мире. В ряде стран Европы кишечный иерсиниоз занимает третье место по заболеваемости среди кишечных инфекций, после кампилобактериоза и сальмонеллеза. Заболеваемость псевдотуберкулезом в Российской Федерации регистрируется практически повсеместно, преимущественно в виде вспышек, кишечным иерсиниозом — в виде спорадических случаев.

Характеристика иерсиний

Род Yersinia включает группу грамотрицательных, не образующих спор, палочковидных (кокки или овоиды) факультативно-анаэробных микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Среди 17 видов, входящих в род Yersinia, три отнесены к патогенным для человека и животных — возбудитель чумы Y. pestis, возбудитель псевдотуберкулеза Y. pseudotuberculosis и 11 представителей вида Y. enierocolitica патогенных биотипов 1В и 2-5.

Y. enierocolitica биотипа 1А относят к непатогенным, однако они могут быть возбудителями оппортунистических инфекций. Также непатогенными являются 13 видов иерсиний: Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri, Y. aleksiciae, Y. similis, Y. massiliensis, Y. nurmii, Y. pekkanenii, Y. entomophaga.

Основные биохимические свойства Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica и некоторых других представителей Enterobacteriaceae, которые используются в практической работе при первичном изучении выделенных культур, представлены в табл. 1 и 2.

По О-антигену известен 21 серотип Y. pseudotuberculosis. Среди Y. enterocolitica различают 6 биотипов и 30 серотипов, из них 9 наиболее часто ассоциируются с заболеваниями человека: 0:3; 0:4; 0:5,27; 0:9; 0:8; 0:13; 0:18; 0:20; 0:21 (табл. 3).

Антигенное родство (по О-антигену) Y. pseudotuberculosis и большинства серотипов Y. enterocolitica выражено слабо. Значительное сходство по антигенной структуре выявлено у Y. pseudotuberculosis серотипа 0:1 и Y. enterocolitica «американских» серотипов 0:8; 0:18 и 0:21.

Таблица 1

семейства Enterobacteriaceae

Таблица 2

рода Yersinia (26 +/- 2) °С

Таблица 3

Био- и серотипы Y. enterocolitica и их связь с патогенностью

Температурный фактор является одним из важнейших определяющих изменчивость микробов и устойчивость их во внешней среде. Оптимальная температура для жизнедеятельности иерсиний — 28-30 °С, однако они могут, хотя и гораздо медленнее, размножаться при температуре 4-1 °С.

Достаточно долго иерсинии выживают на различных продуктах питания и даже могут на них размножаться (например, на овощах, особенно приготовленных в виде салатов). В молоке сохраняются до 18 суток, в сливочном масле — до 145 суток, на хлебе, кондитерских изделиях — от 16 до 24 суток. Иерсинии чувствительны к высокой температуре; при 100 °С погибают в течение нескольких секунд, однако при температуре 50-60 °С способны выживать до 20-30 мин., переносят большие (до 10%) концентрации раствора натрия хлорида, особенно при низких температурах. На микробы губительно действует прямая солнечная радиация, чувствительны иерсинии и к высыханию. Во влажной среде и невысокой температуре (14-18 °С) выживают длительно. Кислотность среды (при уровнях рН 3,6-4,0) также губительна для иерсиний. В дезинфицирующих растворах в стандартных разведениях микробы Yersinia погибают в течение 5-10 мин. Раствор перманганата калия в концентрации 0,5-0,3% вызывает гибель бактерий через 3 мин.

Патогенные Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica обладают широким набором факторов патогенности, детерминируемых хромосомными и плазмидными генами.

Способность Y. pseudotuberculosis к адгезии и инвазии в клетки эпителия кишечника зависит от экспрессии хромосомного inv-гена, кодирующего синтез белка наружной мембраны инвазина с молекулярной массой 108 кДа. Диссеминация микроба в организме хозяина связана с функционированием группы хромосомных генов, ответственных за ассимиляцию ионов железа («остров высокой патогенности», HPI). Штаммы Y. pseudotuberculosis, содержащие HPI, редко выделяются в России (3,9%), в основном они циркулируют в Европе, Австралии, Северной Америке.

Важным фактором патогенности Y. pseudotuberculosis является синтез суперантигена (YPM), ответственного за поликлональную активацию Т-лимфоцитов и гиперпродукцию провоспалительных цитокинов. Клинически это выражается развитием синдрома токсического шока. У 98% штаммов этого вида, выделенных от больных в России, Японии, Корее, обнаруживается суперантиген, вызывающий системное поражение органов и тканей.

Патогенные Y. enterocolitica также имеют факторы патогенности, обеспечивающие им адгезивные и инвазивные свойства (ген ail).

Гены НРI не выявляются у непатогенных Y. enterocolitica биотипа 1А и у низкопатогенных штаммов биотипов 2-5, но они определяются у всех высокопатогенных штаммов биотипа 1В. Энтеротоксигенность Y. enterocolitica биотипов 1В и 2-5 связана с экспрессией хромосомного гена ystA. У непатогенных представителей биотипа 1А обнаружен ген ystB.

Плазмидой вирулентности иерсиний pYV 42-48 MDa обладают все штаммы Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica 1В, 2-5 биотипов. Основная функция плазмиды pYV — нейтрализация факторов иммунитета макроорганизма.

Плазмида с молекулярной массой 82 MDa (pVM) обнаружена только у Y. pseudotuberculosis 1 серотипа. Штаммы, имеющие плазмиду pVM, вызывают более тяжелое течение псевдотуберкулеза.

5. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы для лабораторий территориального уровня

5.1. Рекомендованный порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в материале от людей в лабораториях лечебно-профилактических организаций

5.1.1. Требования к лабораториям, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Наличие разрешительных и регламентирующих работу документов.

Лаборатории, которые осуществляют исследования на иерсиниозы, должны иметь разрешительные документы на этот вид деятельности согласно действующему законодательству.

Проведение исследований на всех этапах: взятие проб, их хранение, доставка в лабораторию, регистрация, порядок исследования, выдача результатов должны соответствовать требованиям действующих нормативных и методических документов.

Обеззараживание отходов должно осуществляться в соответствии с действующими нормативными и методическими документами по обращению с медицинскими отходами.

Требования к специалистам и вспомогательному персоналу, участвующим в выполнении исследований на иерсиниозы.

Исследования на иерсиниозы могут выполнять специалисты не моложе 18 лет с высшим и средним медицинским образованием, имеющие допуск к работе с ПБА III-IV групп патогенности на основании приказа руководителя учреждения, окончившие курсы по специальности «Бактериология», знающие правила работы с ПБА III-IV группы патогенности. Специалисты должны проходить профессиональную переподготовку не реже одного раза в пять лет. Лица, имеющие высшее (среднее) медицинское образование должны иметь сертификат специалиста («Бактериология»/«Лабораторное дело»).

Инженерно-технический персонал, дезинфекторы и санитарки проходят специальную подготовку по месту работы в соответствии с должностными обязанностями.

Необходимый уровень подготовки специалистов лабораторий представлен в прилож. 1.

Требования к знаниям и умениям специалистов лабораторий приведены в прилож. 2.

Требования к обеспечению безопасности работы персонала.

Каждая бактериологическая лаборатория должна иметь пакет нормативно-методической документации и инструкций, определяющих режим безопасной работы сотрудников с учетом характера работ, особенностей технологии, свойств микроорганизмов. Результаты проверок знаний правил техники безопасности персонала при проведении работ фиксируются в специальном журнале.

Все сотрудники должны выполнять требования по обеспечению безопасности работы с материалом, подозрительным или зараженным возбудителями инфекционных болезней III-IV групп патогенности (опасности) в соответствии с действующими нормативными документами.

Порядок организации внутреннего и внешнего контроля качества лабораторных исследований.

Контроль качества исследований на иерсиниозы в лабораториях включает:

• контроль качества питательных сред, диагностических препаратов и тест-систем, дезинфицирующих средств и химических реактивов;
• своевременную поверку средств измерений, аттестацию испытательного оборудования;
• контроль качества стерилизации лабораторной посуды;
• контроль работы паровых и суховоздушных стерилизаторов;
• контроль температурного режима работы холодильников и термостатов;
• контроль работы бактерицидных ламп;
• проверку состояния воздуха производственных помещений и боксов, температурного режима, влажности;
• проверку санитарного состояния помещений, включая условия уборки, дезинфекции, контроля смывов с поверхностей и оборудования.

Результаты контроля фиксируют в специальных журналах, формулярах или других учетных документах.

Внешний контроль качества лабораторных исследований включает:

• участие в межлабораторных сличительных испытаниях (МСИ);
• участие в Федеральной системе внешней оценки качества (ФСВОК);
• приобретение шифрованных образцов для идентификации иерсиний.

Правила ведения документации.

Ведение лабораторной документации, включая состояние регистрационных и рабочих журналов, осуществляют ежедневно в соответствии с требованиями действующих нормативных и методических документов.

Требования к материальным ресурсам, необходимым для выполнения исследований на иерсиниозы

Для проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях должны быть в наличии:

• питательные среды, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 3 к МУ);
• диагностические препараты, тест-системы, зарегистрированные в установленном порядке (прилож. 4 к МУ);
• химические реактивы (прилож. 5 к МУ);
• приборы и оборудование (прилож. 6 к МУ);

5.1.2. Номенклатура и объем исследований

В лабораториях МО проводят:

• диагностические исследования материала от госпитализированных в стационар и амбулаторных больных с целью дифференциальной диагностики и установления этиологии заболевания при спорадической и вспышечной заболеваемости;
• исследования патологоанатомического материала.

В лабораториях МО проводят исследования материала в следующем объеме:

1. посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2. идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» и др.) при наличии оборудования и тест-систем;

3. выявление антител в парных сыворотках (РА, РНГА, ИФА);

4. экспрессные методы исследования (ПЦР) — при наличии оборудования.

5.1.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы

5.1.3.1. Правила отбора и транспортирования проб клинического материала.

При проведении бактериологического анализа на иерсиниозы исследуется клинический материал: испражнения, моча, кровь, мазки из зева, операционный или секционный материал: аппендикулярные отростки, мезентериальные лимфоузлы и патологически измененные органы и ткани, сгустки крови, желчь, содержимое кишечника.

Материал от больного (подозрительного на заболевание) отбирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного (подозрительного на заболевание) до начала лечения антибиотиками.

При совместном использовании бактериологического и ПЦР методов отбор материала осуществляется в одноразовую посуду.

Правила отбора материала от больных (подозрительных на заболевание):

• испражнения <*> берут на протяжении всего периода заболевания в количестве 0,5-1,0 г стерильной ложечкой из судна и помещают в стерильный широкогорлый флакон с 5,0-10,0 мл среды накопления;

<*> Высеваемость иерсиний наиболее высока в первые 3-5 дней болезни и до назначения антибиотиков, результаты бактериологического исследования улучшаются, если взятие материала производится 3-кратно в течение первой недели болезни (госпитализации).

• мочу исследуют в первые 7 дней болезни, берут 20-30 мл средней порции утренней мочи в стерильную посуду. Осадок после центрифугирования помещают в 5,0 мл среды накопления;
• смыв из зева берут в первые 3 дня болезни натощак с задней стенки глотки и корня языка тампоном, смоченном в физиологическом растворе и помещают в 5,0 мл среды накопления;
• кровь исследуют в течение болезни на высоте лихорадки, весь лихорадочный период и в период рецидива болезни. Кровь забирают натощак в количестве 5-10 мл из локтевой вены с соблюдением правил асептики, выдерживают при комнатной температуре в наклонном положении (под углом 30-45°) до образования сгустка (30-40 мин.), после чего сгусток отделяют от стенки, сыворотку переносят в пробирку для серологических реакций, а сгусток помещают в 5,0 мл среды накопления.

Правила отбора операционного или секционного материала:

• Аппендикулярный отросток. Стерильно ножницами измельчают 1,0-2,0 г пробы и помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.
• Мезентериальные лимфоузлы, другие органы и ткани. Стерильно ножницами измельчают 1.0-2,0 г пробы и помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.
• Желчь. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5-1,0 мл.
• Содержимое кишечника. В 5,0 мл среды накопления помещают 0,5-1,0 мл.
• Сгусток крови. Стерильно измельчают 0,5-1,0 мл пробы и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы этикетируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк направления и помещают в контейнер для транспортирования биологического материала на исследование.

Транспортирование материала в лабораторию осуществляется при температуре (4-12) °С в течение двух часов после взятия.

I этап исследования

(пробоподготовка и посев нативного материала)

Проводят «холодовое обогащение» исследуемого материала: внесенный в среду ПК, в ЗФР или 1%-ю пептонную воду (среды накопления) материал помещают в холодильник (6 +/- 2) °С и выдерживают в нем до первого положительного высева на 2-3, 5-7 или 10-15 сутки.

Постановка ускоренных методов исследования нативного материала: ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа <*>. При получении положительного результата выдают предварительный положительный ответ.

<*> Производственный выпуск «Тест-системы иммуноферментной для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа» будет осуществляться в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера с 2012 г.

II этап исследования

(на 2-3 сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (2-3 сутки «холодового обогащения») на плотные дифференциально-диагностические среды (СБТС, Эндо) или другие коммерческие дифференциальные среды для диагностики иерсиниозов, разрешенные к применению на территории Российской Федерации (среда Мак-Конки и др.) — петлей из верхней трети слоя среды (но не с поверхности!), не взбалтывая пробирки (!).

Для инактивации посторонней микрофлоры перед каждым высевом на плотную питательную среду проводят щелочную обработку материала 0,72%-м раствором гидроксида калия в 0,5%-м растворе хлорида натрия (30-60 с) или 5%-м раствором тринатрий фосфата. Посевы инкубируют при (26 +/- 2) °С 48 ч. (на среде СБТС) или (на среде Эндо) 24 ч. (не более 30 ч.!).

Ускоренные методы исследования материала из сред накопления (2-3-и сутки «холодового обогащения»): ПЦР или ИФА для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза 1 серотипа. При получении положительного результата выдают подтверждение предварительного положительного ответа и продолжают бактериологическое исследование пробы до выделения культуры. При отрицательных результатах ПЦР на этапах I-II дальнейшее бактериологическое исследование пробы прекращают.

III этап исследования

(4-5-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на этапе II исследования, и учет морфологии колоний.

Проводят отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) <*> и той же колонии — на скошенные столбики (или сектора) МПА (АХ) для накопления бактериальной массы. Посевы инкубируют на средах Олькеницкого, УСС, Ресселя I при (37 +/- 1) °С, на МПА (АХ), среде Ресселя II — при (26 +/- 2) °С. При наличии сложности отбора колонии на две среды возможен первичный отбор колоний на среды с мочевиной с последующим пересевом уреазоположительных культур на МПА (АХ), среду Рессель II.

<*> Прописи сред и способ приготовления представлены в прилож. 8.

IV этап исследования

(5-6-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур из пробирки (или чашки) с МПА, засеянных на этапе II исследования (2-3 сутки «холодового обогащения»):

• микроскопия мазка, окрашенного по Граму;
• тест на цитохромоксидазу;
• ферментативная активность на средах Гисса <*> (26 +/- 2) °С: маннитол, сахароза, рамноза, раффиноза, сорбитол, мелибиоза, салицин, ксилоза;

<*> При использовании сред Ресселя I и II проводят постановку следующих биохимических тестов — сахароза, рамноза, раффиноза, салицин, ксилоза, сорбит, индол.

• реакция Фогеса-Проскауэра (среда Кларка) при (20 +/- 2) °С и (37 +/- 1) °С;
• декарбоксилирование орнитина (среда Биргера-Крушинской) при (37 +/- 1) °С;
• утилизация цитрата (среда Симмонса) при (37 +/- 1) °С;
• дезаминирование фенилаланина (агар с фенилаланином) при (37 +/- 1) °С;
• образование индола (0,3% полужидкий агар) при (20 +/- 2) °С и (37 +/- 1) °C;
• проба с псевдотуберкулезным фагом (агар Хоттингера, МПА) при (26 +/- 2) °С;
• постановка ОРА на стекле с псевдотуберкулезной и иерсиниозной сыворотками — культуры с МПА (АХ), среды Ресселя II;
• идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) — при наличии оборудования и тест-систем.

V этап исследования

(5-7-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления (5-7-е сутки «холодового обогащения») на плотные дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки.

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на IV этапе исследования (2-3-и сутки «холодового обогащения»), определяют биотип Y. enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

VI этап исследования

(7-8-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на V этапе исследования (5-7-е сутки «холодового обогащения»).

Проводят отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и) Y. Enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и МПА (АХ).

VII этап исследования

(8-10-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительных культур, засеянных на VI этапе исследования (5-7-е сутки «холодового обогащения») по тестам, предусмотренным на IV этапе исследования.

VIII этап исследования

(9-11-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на VII этапе исследования (5-7-е сутки «холодового обогащения»), определяют биотип Y. enterocolitica.

Проводят реакцию агглютинации на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

Выдача окончательного положительного ответа.

IX этап исследования

(10-е сутки от начала исследования)

Проводят высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды после предварительной щелочной обработки (10-е сутки «холодового обогащения»).

X этап исследования

(12-е сутки от начала исследования)

Просмотр посевов на дифференциально-диагностических средах, засеянных на IХ-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»), отбор характерных для Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica колоний на дифференциальную среду с мочевиной (среду Олькеницкого, УСС или среды Ресселя I и II) и агар МПА (АХ).

XI этап исследования

(13-е сутки от начала исследования)

Проводят идентификацию и дифференциацию уреазоположительного изолята, засеянного на Х-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»), по набору биохимических тестов, предусмотренных на IV-м этапе исследования.

XII этап исследования

(14-е сутки от начала исследования)

Проводят учет результатов биохимической идентификации и дифференциации Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica, проведенных на XI-м этапе исследования (10-е сутки «холодового обогащения»).

Выдача окончательного положительного ответа.

Передача выделенной культуры для дальнейшей идентификации в специализированную лабораторию возможна на любом этапе исследования.

5.1.3.2 Полимеразная цепная реакция.

Для выявления ДНК иерсиний используют наборы для ПЦР, зарегистрированные в установленном порядке. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению. Материал для исследования отбирается в одноразовую пробирку (или контейнер) в соответствии с п. 5.1.3.1 в среду накопления ЗФР (рН 7,2-7,4).

Наиболее информативным для ПЦР являются испражнения и кровь в период лихорадки. Материал забирается немедленно при выявлении больного и до назначения антибиотиков (!).

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и на 2-3 сутки после «холодового обогащения» в ЗФР. Непосредственно перед исследованием проводят пробоподготовку материала, используя набор для выделения ДНК.

При использовании этих методов при пробоподготовке получают препарат суммарной ДНК всех содержащихся в пробе микроорганизмов, что может вызвать ингибирование ПЦР и снижение ее чувствительности. Разработан способ подготовки проб, основанный на использовании щелочной обработки материала, при котором большая часть индигенной микрофлоры погибает и удаляется как супернатант при центрифугировании, а относительно устойчивые к щелочи иерсинии выживают (патент от 27.07.2000 № 2153671):

1. Исследуемый материал (нативный) центрифугируют при 500-1000 об./мин. 1,5-2,0 мин. для осаждения грубых частиц или отстаивают 2-3 ч. при комнатной температуре.

2. Переносят 0,2-0,5 мл верхней фазы (в том числе, после «холодового обогащения» в течение 2-3 суток) в лунки полистиролового планшета для серологических реакций и смешивают с 0.72% КОН в таком же объеме.

3. После 30-60 с. экспозиции проводят посев материала на дифференциально-диагностические среды и сразу же в лунки планшета добавляют 0,2-0,5 мл БХ для прекращения действия щелочи как селективного агента.

4. Материал из лунки переносят в пробирку типа «Эппендорф» и центрифугируют на микроцентрифуге при 10000-12000 об./мин. 3-5 мин.

5. Надосадочную жидкость удаляют, осадок дважды промывают дистиллированной водой путем центрифугирования.

6. К осадку добавляют 20 мкл деионизованной воды, прогревают 10 мин. при 100 °С, центрифугируют при 12000 об./мин. 2 мин. Для ПЦР используют 1-3 мкл надосадочной жидкости.

5.1.3.3 Иммунологические методы выявления специфических антигенов.

Для выявления антигенов иерсиний используют тест-систему иммуноферментную для выявления антигенов иерсиний псевдотуберкулеза I серотипа.

Материал для исследования, сроки и правила его взятия аналогичны п. 5.1.3.1.

Исследование проб проводят в первые сутки их получения и затем на 3-5-е сутки после «холодового обогащения» в среде ПК. Непосредственно перед исследованием материал инактивируют 30 мин. при (56 +/- 1) °С, центрифугируют при 3000 об./мин. и берут для исследования надосадочную жидкость. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.3.4 Серологическое исследование на иерсиниозы.

Для исследования требуется две пробы крови, взятые в разные периоды заболевания (парные сыворотки!): 1-я неделя начала заболевания и конец 2-й, начало 3-й недели болезни.

Серологическая диагностика основывается на появлении или нарастании титра антител в течение болезни. Достоверным считается 2-4-кратное и выше нарастание титра антител при исследовании парных сывороток.

Реакция агглютинации (РА). Для постановки РА используют стандартные иерсиниозные антигены распространенных серотипов, представляющие собой 10 млрд взвесь иерсиний эталонных штаммов в S-форме, убитых формалином и суспендированных в 0,9%-м растворе хлорида натрия. Перед постановкой микробную взвесь разводят в 10 раз до рабочей концентрации 1 млрд/мл. Реакцию ставят методом равных объемов (0,5 мл сыворотки + 0,5 мл взвеси). Диагностический титр — 1:160.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Для постановки РНГА используют коммерческие эритроцитарные диагностикумы к Y. pseudotuberculosis I серотипа и Y. enterocolitica серотипов О:3 и О:9, представляющие собой полисахаридные антигены иерсиний, фиксированные на поверхности формалинизированных бараньих эритроцитов. Методика постановки и учета РНГА приведена в инструкции по применению. При постановке РНГА с псевдотуберкулезным диагностикумом диагностический титр равен 1:100, кишечноиерсиниозными — 1:200.

Для повышения диагностической эффективности РНГА и исключения ложноположительных результатов рекомендуется соблюдать следующие правила при постановке:

1. Непосредственно перед постановкой РНГА чистые полистироловые пластины ополаскивают дистиллированной водой, а затем высушивают.

2. Накануне постановки РНГА эритроцитарный диагностикум разводят 10 мл ЗФР (рН 7,2) и помешают в холодильник на ночь (для регидратации эритроцитов). Диагностикум, используемый сразу после разведения, часто дает нечеткий результат.

3. Исследуемые сыворотки крови, разведенные ЗФР в соотношении 1:25, необходимо прогреть при 56 °С в течение 30 мин. для устранения неспецифических гемагглютининов, которые могут содержаться в сыворотках крови людей.

4. Поскольку некоторые сыворотки крови человека содержат антитела к эритроцитам барана (последние используются для конструирования коммерческого диагностикума), рекомендуется предварительно перед использованием провести адсорбцию каждой сыворотки 50%-й взвесью бараньих эритроцитов (0,1 мл на 1 мл сыворотки) в течение ночи при температуре холодильника.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для постановки ИФА используют тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM», «Иерсиниоз-ИФА-IgG», предназначенные для выявления антител классов A, M и G к возбудителям кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза. Постановку и учет реакции осуществляют в соответствии с инструкцией по применению.

5.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Данные о проведении исследований (испытаний) регистрируются в учетной документации, включающей:

• направления на проведение исследований;
• журналы регистрации образцов, поступивших на исследование;
• журналы регистрации результатов исследований.

Результаты каждого исследования (испытания) оформляются по унифицированным формам.

5.2. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.1. Требования к лабораториям филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации, осуществляющим исследования на иерсиниозы

Согласно п. 5.1.1.

5.2.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации при проведении эпидемиологического надзора в соответствии с требованиями СП 3.1.2615-10 «Профилактика иерсиниозов» осуществляют в плановом порядке:

• исследование проб с эпидемически значимых объектов («объекты риска»): смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях;
• исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);
• лабораторные исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) — осуществляются по согласованию.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

• материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении эпидемиологического расследования и санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий;
• в эпидемических очагах иерсиниозов или при неблагополучной эпидемиологической ситуации:

смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;

смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;

остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);

экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок:

помет мелких млекопитающих;

вода открытых водоемов и из емкостей для хранения.

В лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации проводят диагностические исследования материала в следующем объеме:

1. посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных по морфологическим свойствам колоний иерсиний на ПУС;

2. идентификация и дифференциация выделенных культур до вида возбудителя по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам;

3. выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА).

5.2.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в филиалах (отделениях) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании (городе, административном районе) в субъекте Российской Федерации

5.2.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды.

Отбор проб и доставку осуществляют специалисты, владеющие методами отбора проб из объектов окружающей среды филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ».

• Пищевые продукты. В стерильную емкость помещают 25 г каждого продукта.
• Овощи. Одним влажным стерильным тампоном делают смыв не менее чем 10 экз. каждого вида овощей на границе здоровой и загнивающей части, помещают тампон в 5,0-10,0 мл среды накопления.
• Смывы с оборудования, инвентаря, тары. Одним влажным тампоном производят смыв с одноименных поверхностей площадью 100 кв. см каждая, тампон помещают в 5,0-10,0 мл среды накопления.
• Вода из емкостей для хранения и открытых водоемов. В стерильные флаконы забирают 1-2 л воды.
• Помет. Собирают стерильной палочкой 1-2 г и помещают в 5,0 мл среды накопления.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией, заполняют бланк-направление и помещают в контейнер для транспортирования материала для исследования. Транспортирование осуществляют при температуре 4-12 °С в течение двух часов после забора.

5.2.3.2. Правила отбора и транспортирования проб от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения.

Материал от больных (подозрительных на заболевание) и лиц, находящихся с ними в одинаковых условиях по риску заражения, забирает медицинский персонал МО немедленно при выявлении больного, до начала лечения антибиотиками.

Пробы маркируют, обрабатывают снаружи дезинфицирующим раствором, упаковывают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией и вместе с бланком-направлением транспортируют при 4-12 °С в лабораторию МО или филиал (отделение) ФБУЗ «ЦГиЭ» (по договоренности) в течение двух часов после забора.

Взятие материала осуществляют согласно п. 5.1.3.1.

5.2.3.3. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды и материала от людей.

Исследование проб объектов окружающей среды, исследование клинического материала на иерсиниозы, видопринадлежность выделенных культур осуществляют в соответствии с п. 5.1.3.

5.2.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ» согласно п. 5.1.4.

5.2.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями филиалов (отделений) ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в муниципальном образовании в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

Информация о выделенных штаммах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica в лабораториях филиалов (отделений) ФБУЗ «ЦГиЭ» от людей и объектов окружающей среды передается в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации.

Культуры Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica направляются в лаборатории ФБУЗ «ЦГиЭ» в субъекте Российской Федерации. Передача и транспортирование осуществляются в соответствии с действующими санитарными правилами по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо, акт передачи живых культур.

5.3. Порядок организации и проведения лабораторных исследований на иерсиниозы в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.1. Требования к лабораториям ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

Согласно п. 5.1.1.

5.3.2. Номенклатура и объем исследований

Микробиологические лаборатории ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации проводят в плановом порядке:

• исследования проб с эпидемиологически значимых объектов «объектов риска» (смывы с оборудования, инвентаря, овощей, пищевых продуктов в овощехранилищах, мясо- и молокоперерабатывающих предприятиях, объектах торговли продуктами растительного происхождения, пищеблоках объектов общественного питания, общеобразовательных учреждениях, детских и медицинских организациях);
• исследования продуктов животноводства, птицеводства, плодоовощной продукции в разрезе Программы производственного контроля (по согласованию);
• исследования материала от больных (подозрительных на заболевание) (по согласованию);
• подтверждение и идентификацию культур иерсиний, выделенных лабораториями МО и филиалами (отделениями) ФБУЗ «ЦГиЭ» по морфологическим, культурально-биохимическим и серологическим свойствам.

По эпидпоказаниям исследованию подлежат:

• материал от людей, находящихся в одинаковых с больными условиях по риску заражения, в эпидемических очагах при проведении санитарно-противоэпидемических мероприятий;
• смывы с овощей, фруктов и других продуктов, не подвергающихся термической обработке;
• смывы с поверхности оборудования, инвентаря и тары в овощехранилищах, пищеблоках организованных коллективов, домашних очагах;
• остатки подозреваемых пищевых продуктов (салаты, сок домашнего приготовления, фляжное молоко, творог домашнего приготовления, сырое свиное мясо, субпродукты и т.д.);
• экскременты домашних и сельскохозяйственных животных, смывы с их подстилок;
• помет мелких млекопитающих;
• вода открытых водоемов и из емкостей для хранения;
• исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования (тонкий кишечник мелких млекопитающих и птиц, брыжейка и мезентеральные лимфоузлы, гнезда грызунов, почва).

В лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации проводят исследования материала в следующем объеме:

1. посев на среды накопления, «холодовое обогащение» с периодическими высевами на дифференциально-диагностические среды, отсев характерных для иерсиний колоний на ПУС с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики иерсиниозов (ПЦР, Real-time ПЦР);

2. идентификация и дифференциация выделенных культур до вида по морфологическим, биохимическим и антигенным свойствам, в том числе с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2». «Mini API». «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) при наличии оборудования и тест-систем;

3. индикация и идентификация культур иерсиний с использованием ПЦР, Real-time ПЦР;

4. выявление антител в парных сыворотках (РНГА, ИФА, РА).

5.3.3. Порядок лабораторных исследований на иерсиниозы в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации

5.3.3.1. Правила отбора и транспортирования проб из объектов окружающей среды.

Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно п. 5.2.3.1.

5.3.3.2 Правила отбора и транспортирования клинического материала.

Отбор и транспортирование материала осуществляют согласно пп. 5.1.3.1 и 5.2.3.2.

5.3.3.3. Правила отбора проб материала от животных, собранных при обследовании природных или антропоургических очагов иерсиниозов.

Материал, собранный в ходе обследования природных и антропургических очагов, должен быть свежим, поэтому органы животных следует забирать в максимально короткие сроки или соблюдать низкотемпературный режим для транспортировки и хранения полевого материала. Лабораторному исследованию подвергают: тонкий кишечник мелких млекопитающих, птиц, сельскохозяйственных и домашних животных, субстрат гнезд грызунов:

• Тонкий кишечник. 1,0-2,0 г в месте перехода тонкой кишки в толстую с содержимым забирают стерильно и помещают в 5,0 мл среды накопления.
• Брыжейка, мезентеральные лимфоузлы. 1,0-2,0 г стерильно измельчают, 1 мл суспензии помещают в 5,0 мл среды накопления.
• Гнезда грызунов. Субстраты гнезд (примерно 10 г каждого) растирают в ступке пестиком с фосфатно-буферным раствором, 1,5 мл взвеси вносят в 15,0 мл среды накопления.

5.3.3.4. Порядок проведения лабораторного исследования на иерсиниозы объектов окружающей среды, материала от людей, полевого материала, выделенных культур.

Исследование материала от людей с диагностической целью и по эпидпоказаниям, проб из объектов окружающей среды по эпидпоказаниям проводят в соответствии с п. 5.1.3. При осуществлении планового эпизоотологического мониторинга за природными очагами иерсиниозов высевы со сред накопления рекомендуется проводить до 21 суток.

Идентификация выделенной культуры проводится по следующим тестам:

• характерная морфология колоний;
• типичные биохимические свойства;
• чувствительность к псевдотуберкулезному фагу;
• серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica;
• биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, липазная активность, образование индола, ферментация ксилозы, нитратредуктазная активность, реакция Фогес-Проскауэра);
• определение вирулентности иерсиний по фенотипическим признакам (тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний);
• РА на стекле с сывороткой к вирулентным иерсиниям.

5.3.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов анализа производится по учетным формам ФБУЗ «ЦГиЭ» согласно п. 5.1.4.

5.3.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями ФБУЗ «Центр гигиены эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности

Информация о выделенных или идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica передается в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности.

Культуры иерсиний, выделенных от людей, мелких млекопитающих и объектов окружающей среды, и идентифицированные в лабораториях ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте Российской Федерации передаются в установленном порядке в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности. Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру, сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

6. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы для лабораторий регионального уровня

6.1. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности в федеральных округах

6.1.1. Требования к лабораториям Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности

Согласно п. 5.1.1.

6.1.2. Номенклатура и объем исследования

Лаборатории Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности проводят:

• верификацию культур иерсиний и их расширенную идентификацию;
• диагностические исследования материала от больных и объектов окружающей среды — в случае отсутствия диагностических возможностей на местах, трудности дифференциальной диагностики, наличия тяжелых и атипичных форм инфекции и т.д.;
• исследование проб, собранных в ходе эпизоотологического обследования природных и антропургических очагов иерсиниозов;
• контроль качества питательных сред.

Лаборатории Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности проводят исследования в следующем объеме:

• идентификация культур, доставленных (определение биотипа, серотипа возбудителя, определение вирулентности культуры по фенотипическим признакам);
• индикация и идентификация культур иерсиний при использовании ПЦР, Real-time ПЦР;
• посев на среды накопления с одновременным выполнением экспресс-методов диагностики (ПЦР, Real-time ПЦР);
• высев со сред накопления на дифференциально-диагностические среды, отсев подозрительных колоний для последующей родовой и видовой дифференциации;
• идентификация возбудителя с использованием полу- или автоматизированных систем идентификации («Vitek-2», «Mini API», «Микроб-2», «Микроб-Автомат» или аналоги) при наличии оборудования.

6.1.3. Организация и обеспечение исследований на иерсиниозы в лабораториях Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности

Порядок исследований клинического материала, проб из объектов окружающей среды, грызунов, птиц, материала от сельскохозяйственных и домашних животных проводят в соответствии с п. 5.1.3.

К подтверждающим тестам относительно Y. pseudotuberculosis/Y. enterocolitica относятся:

• характерная морфология колоний;
• типичные биохимические свойства;
• чувствительность к псевдотуберкулезному бактериофагу:
• серологическое типирование с использованием диагностических сывороток к Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis;
• биотипирование Y. enterocolitica по набору тестов (ферментация салицина, ксилозы, образование индола, редукция нитратов, реакция Фогес-Проскауэра);
• тест на аутоагглютинацию, определение кальцийзависимости роста иерсиний, определение температурозависимой морфологии колоний; РА на стекле для выявления вирулентных иерсиний с СВИ;
• определение чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным методом;
• определение видоспецифических ДНК-мишений методом ПЦР.

6.1.4. Регистрация и оформление результатов исследования

Регистрация результатов исследования оформляется согласно п. 5.1.4.

6.1.5. Порядок передачи информации и выделенных культур лабораториями Региональных центров по мониторингу возбудителей инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности в Референс-центры

Информация о выделенных и идентифицированных культурах Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica передается в Референс-центр по мониторингу за возбудителями иерсиниозов (ФБУН «Санкт-Петербургский НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора) и Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекций (ФКУЗ «Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора).

При невозможности проведения диагностических исследований для установления причинно-следственной связи при работе в эпидемическом очаге, верификации и расширенной идентификации культур в Региональном центре по мониторингу за возбудителями II-IV групп патогенности лабораторные исследования (пп. 6.1.2 и 6.1.3) проводятся в других Региональных центрах по мониторингу за возбудителями II-IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам (Региональные опорные базы-консультантов). Лаборатории данных центров должны соответствовать требованиям, изложенным в п. 5.1.1.

Культуры Y. pseudotuberculosis и патогенных Y. enterocolitica от людей, грызунов и объектов окружающей среды, идентифицированные в лабораториях ФБУЗ «ЦГиЭ» в субъекте РФ, Региональных центрах по мониторингу возбудителей II-IV групп патогенности и в Региональных опорных базах — консультантов в федеральных округах передаются в установленном порядке в Референс-центр по иерсиниозам, а для территорий Сибирского и Дальневосточного федеральных округов — в Референс-центр по природно-очаговым инфекционным болезням.

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с действующими СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов II-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру (прилож. 7 к МУ), сопроводительное письмо и акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

7. Порядок организации и проведения исследований на иерсиниозы в лабораториях федерального уровня (Референс-центр по мониторингу за иерсиниозами, Референс-центр по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней)

7.1. Требования к лабораториям Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и Референс-центра по мониторингу за возбудителями природно-очаговых инфекционных болезней

Согласно п. 5.1.1.

7.2. Номенклатура и объем исследований

Диагностические лаборатории Референс-центров проводят:

• расширенную идентификацию и изучение биологических, биохимических, молекулярно-генетических характеристик иерсиний, в том числе культур с атипичными свойствами;
• проводят генотипирование иерсиний современными методами;
• проводят исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды и проб полевого материала — на договорной основе;
• оказывают консультативно-методическую помощь по проведению лабораторных исследований на иерсиниозы организациям Роспотребнадзора и здравоохранения в субъектах Российской Федерации;
• обеспечивают повышение профессиональной подготовки специалистов лабораторного звена организаций Роспотребнадзора и здравоохранения при наличии соответствующих разрешительных документов;
• направляют в Государственные коллекции штаммы иерсиний в установленном порядке;
• организуют работы по внешнему контролю качества лабораторных исследований и мониторинга за иерсиниями по согласованию с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

7.3. Организация и обеспечение деятельности при мониторинге за иерсиниозами

Материалом для исследования служат культуры иерсиний, в том числе культуры с атипичными свойствами, выделенные в лабораториях территориального (муниципального) и регионального уровней; клинический материал, сыворотка крови больных иерсиниозами и подозрительных на инфекцию лиц, пробы из объектов окружающей среды и полевой материал по эпидпоказаниям и на договорной основе.

При исследовании культур возбудителей иерсиниозов, в том числе культур с атипичными свойствами, используют биологические и современные высокотехнологичные методы бактериологического, иммуносерологического и молекулярно-генетического анализа, а также современные серологические методы исследования сывороток крови больных иерсиниозами и подозрительных на эти инфекции, обследуемых по эпидпоказаниям.

Порядок исследования клинического материала, проб из объектов окружающей среды, мелких млекопитающих на иерсиниозы соответствуют п. 5.1.3.

Идентификация поступивших культур осуществляется по полной схеме:

• характерная морфология колоний;
• изучение биохимических свойств на расширенной биохимической панели, определение биотипа Y. enterocolitica;
• постановка развернутой реакции агглютинации с иерсиниозными агглютинирующими сыворотками (к Y. enterocolitica серотипов О:3; О:5,27; О:8; О:9 и др.; к Y. pseudotuberculosis серотипов О:1, О:3);
• определение детерминант патогенности в ПЦР (гены «острова высокой патогенности» HPI; «острова патогенности» YAPI; гены адгезии — инвазии inv, ail, гены энтеротоксинов ystA, ystB, гены плазмиды вирулентности иерсиний);
• определение чувствительности к антибиотикам (диско-диффузионным методом, методом разведений в агаре и бульоне);
• определение плазмидного спектра выделенных штаммов;
• определение серо-генотипа ПЦР (в случае отсутствия диагностических сывороток);
• электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) — определение пульсотипа;
• мультилокусный вариабельный анализ (MLVA);
• определение вирулентности Y. pseudotuberculosis (определение LD50 при пероральном заражении белых мышей с помощью зонда; постановка кератоконъюнктивальной пробы на морских свинках).

При идентификации культур иерсиний с атипичными свойствами используют дополнительные биохимические, серологические, иммунологические и другие методы для подтверждения принадлежности культур к роду Yersinia и известным видам:

• расширенная панель биохимических тестов;
• ПЦР с использованием дополнительных специфических праймеров;
• постановка иммуносерологических реакций с использованием моноклональных антител.

Окончанием идентификации должно быть составление молекулярного профиля возбудителя.

7.4. Порядок взаимодействия лабораторий Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами с организациями Роспотребнадзора

Информация об идентифицированных культурах иерсиний направляется в Региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней II-IV групп патогенности по согласованию с Референс-центром по иерсиниозам. Оригинальные штаммы иерсиний, идентифицированные в бактериологических лабораториях Референс-центров, передаются в Государственную коллекцию штаммов микроорганизмов Национального центра верификации диагностической деятельности ФКУЗ «РосНИПЧИ „Микроб“ Роспотребнадзора.»

Передачу и транспортирование осуществляют в соответствии с СП по порядку учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности. Прилагается паспорт на культуру в одном экземпляре, сопроводительное письмо, акт передачи патогенных биологических агентов III-IV групп за пределы организации.

Приложение 1

ПО ЛАБОРАТОРНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ ИЕРСИНИОЗОВ

Приложение 2

ТРЕБОВАНИЯ К ПРОФЕССИОНАЛЬНЫМ НАВЫКАМ СПЕЦИАЛИСТОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЕРСИНИОЗОВ

1. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, выполняющих исследования на иерсиниозы

1.1 Врачи-бактериологи, врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны знать:

• основные положения клинико-эпидемиологических проявлений иерсиниозов и характеристику иерсиний, особенности лабораторного обследования больного в соответствии с клиническими формами заболеваний;
• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала:
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования;
• морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;
• порядок работы на лабораторном оборудовании;
• порядок выдачи результатов лабораторного исследования;
• порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;
• требования биологической безопасности при передаче ПБА.

1.2 Врачи-бактериологи должны уметь:

• проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред:
• проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;
• проводить биотипирование выделенных культур Y. enterocolitica;
• проводить с выделенными культурами Y. etiterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;
• проводить учет полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических, вирулентных свойств исследуемого микроорганизма;
• проводить учет серологического исследования крови;
• выдавать ответ по результатам исследований;
• готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;
• вести необходимую документацию.

1.3 Врачи-лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

• готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;
• проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учет результатов;
• проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;
• выдавать ответ по результатам исследований;
• вести необходимую документацию.

1.4 Лаборанты-бактериологи должны знать:

• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала:
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка клинического материала);
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования;
• порядок работы на лабораторном оборудовании.

1.5 Лаборанты-бактериологи должны уметь:

• принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;
• проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;
• выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов;
• выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);
• готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;
• готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;
• готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;
• вести необходимую документацию.

1.6 Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

• принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;
• готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;
• проводить пробоподготовку клинического материала;
• проводить выделение нуклеиновых кислот:
• проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;
• готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

2. Требования к знаниям и умениям специалистов филиалов (отделения) ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

2.1 Врачи-бактериологи должны знать:

• основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингент обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб из объектов окружающей среды;
• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала, проб из объектов окружающей среды;
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала);
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования;
• морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные свойства иерсиний;
• порядок работы на лабораторном оборудовании;
• порядок выдачи результатов лабораторного исследования;
• порядок, сроки передачи культур иерсиний в специализированную лабораторию для дальнейшего изучения;
• требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

2.2 Врачи-бактериологи должны уметь:

• проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных сред;
• проводить пересев колоний на полиуглеводные среды;
• проводить биотипирование выделенных культур Y. enterocolitica:
• проводить с выделенными культурами Y. enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;
• проводить учет полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;
• проводить учет серологического исследования крови;
• выдавать ответ по результатам исследований;
• готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;
• вести необходимую документацию.

2.3 Лаборанты должны знать:

• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов:
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования;
• порядок работы на лабораторном оборудовании.

2.4 Лаборанты должны уметь:

• принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований доставки клинического материала;
• проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку исследуемого материала;
• выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний — аутоагглютинации, кальцийзависимости;
• выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);
• готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;
• готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;
• готовить культуры, материал для передачи в специализированную лабораторию;
• вести необходимую документацию.

3. Требования к знаниям и умениям специалистов региональных центров по мониторингу за возбудителями (II-IV групп патогенности), ФБУЗ ЦГиЭ, выполняющих исследования на иерсиниозы

3.1 Врачи-бактериологи должны знать:

• основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;
• порядок организации и обеспечения консультативной и практической помощи лабораториям ЛПУ, филиалов (отделения) ФБУЗ ЦГиЭ, ФБУЗ ЦГиЭ территориального уровня;
• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала, проб из внешней среды;
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование (подготовка диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовка материала);
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования;
• морфологические, культуральные, серологические, биохимические, вирулентные, молекулярно-биологические свойства иерсиний;
• порядок работы на лабораторном оборудовании;
• порядок выдачи результатов лабораторного исследования;
• порядок, сроки передачи культур иерсиний в Референс-центр по иерсиниозам для дальнейшего изучения;
• требования биологической безопасности при передаче ПБА в другую организацию.

3.2 Врачи-бактериологи должны уметь:

• проводить отбор типичных для иерсиний колоний с питательных

сред;

• проводить посев на полиуглеводные среды;
• проводить типирование выделенных культур Y. enterocolitica на наличие маркеров вирулентности;
• проводить с выделенными культурами Y. enterocolitica РА с сывороткой к вирулентным иерсиниям;
• проводить серологическое типирование культур иерсиний;
• проводить учет полученных морфологических, культуральных, серологических, биохимических свойств и маркеров вирулентности исследуемого микроорганизма;
• проводить учет серологического исследования крови;
• выдавать ответ по результатам исследований;
• готовить культуры, материал для передачи в лаборатории Регионального центра по мониторингу за возбудителями I-II группы патогенности. Референс-центр по иерсиниозам;
• вести необходимую документацию;

3.3 Врачи ПЦР-лаборатории должны уметь:

• готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;
• проводить выделение нуклеиновых кислот, амплификацию, учет результатов;
• проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;
• выдавать ответ по результатам исследований;
• вести необходимую документацию.

3.4 Лаборанты должны знать:

• нормативные документы, регламентирующие проведение исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при работе с материалом, подозрительным на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок сбора, хранения, обеззараживания, утилизации биологических отходов;
• порядок доставки, приема, регистрации клинического материала;
• порядок проведения работ, обеспечивающих лабораторное исследование;
• этапы лабораторного исследования;
• методы лабораторного исследования.

3.5 Лаборанты-бактериологи должны уметь:

• принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;
• проводить подготовку диагностических препаратов, химических реактивов, расходных материалов, лабораторной посуды, сред, пробоподготовку клинического материала;
• выполнять первичные посевы клинического материала, пересевы со сред обогащения, проведение биохимических тестов, тестов на маркеры вирулентности иерсиний — аутоагглютинации, кальцийзависимости;
• выполнять постановку серологических реакций (РА, ИФА, РНГА);
• готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать посевы, биологические отходы;
• готовить рабочие места врача и лаборанта, после окончания работ проводить обеззараживание;
• вести необходимую документацию.

3.6 Лаборанты ПЦР-лаборатории должны уметь:

• принимать, регистрировать клинический материал, оценивать соблюдение требований забора, доставки клинического материала;
• готовить рабочее место для проведения ПЦР-исследования;
• проводить пробоподготовку клинического материала;
• проводить обеззараживание рабочего места после окончания работ;
• готовить дезинфицирующие средства, обеззараживать биологические отходы.

4. Требования к знаниям и умениям специалистов МО, ФБУЗ ЦГиЭ (филиалов, отделения филиалов), осуществляющих отбор клинического материала, проб объектов окружающей среды для исследования на иерсиниозы

4.1 Специалисты должны знать:

• основные положения эпидемиологического надзора за иерсиниозами, в том числе контингенты обследуемых, клинические формы заболеваний, виды исследуемых проб от людей, из объектов окружающей среды;
• нормативные документы, регламентирующие забор материала, проб для исследований на иерсиниозы;
• требования биологической безопасности при заборе, доставке материала, подозрительного на зараженность возбудителями III-IV групп патогенности;
• порядок доставки клинического материала, проб из внешней среды;
• порядок заполнения сопроводительной документации.

4.2 Специалисты должны уметь:

• проводить отбор проб от людей, из объектов окружающей среды;
• заполнять сопроводительную документацию;
• доставлять клинический материал, пробы из внешней среды в лабораторию в соответствии с требованиями.

Приложение 3

ИССЛЕДОВАНИЙ НА ИЕРСИНИОЗЫ

Приложение 4

ИССЛЕДОВАНИЙ НА ИЕРСИНИОЗЫ

Приложение 5

ИССЛЕДОВАНИЙ НА ИЕРСИНИОЗЫ

Приложение 6

ИССЛЕДОВАНИЙ НА ИЕРСИНИОЗЫ

Приложение 7

ПАСПОРТ штамма бактерий рода Yersinia (для лабораторий территориального и регионального уровней)

1. Видовое название штамма ________________________________________________

2. Лабораторный номер штамма ______________________________________________

3. Особое обозначение штамма (серотип, биотип) ____________________________

4. Источник выделения штамма: _____________________________________________

4.1 Ф.И.О., возраст, № истории болезни, год, МО, окончательный диагноз

(основное заболевание, течение, осложнения) _______________________________

4.2 Вид животного ________________________________________________________

4.3 Объект окружающей среды или продукт питания __________________________

5. Субстрат, из которого выделен штамм ____________________________________

6. Дата выделения _________________________________________________________

7. Место выделения штамма (область, район, населенный пункт) ______________

8. Метод выделения ________________________________________________________

9. Ф.И.О. лица, идентифицировавшего штамм _________________________________

10. Культурально-морфологические и другие свойства штамма (рост на плотных, жидких питательных средах и пр.) __________________________________________

11. Биохимическая активность штамма:

12. Тесты патогенности:

13. Другие тесты

14. Дата последней проверки свойств штамма ________________________________

15. Условия хранения и транспортирования __________________________________

16. Дата отправки штамма, координаты отправителя (адрес, электронная почта, тел./факс) ________________________________________________________________

Приложение 8

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО ВЫДЕЛЕНИЯ КУЛЬТУР

Трехсахарный агар с мочевиной (Рессель I)

Состав:

Приготовление

Твердые ингредиенты помещают в дистиллированную воду в любой последовательности. После того, как растворится агар, смесь нагревают до кипения, добавляют индикаторы — феноловый красный и метиленовый синий. РН 7,0-7,2 (в горячем виде среда грязно-зеленого цвета), разливают по пробиркам (5-6 мл в каждую) и стерилизуют автоклавированием 15 мин. под давлением 0,5 атм.

Свежестерилизованная среда приобретает желтый или желто-оранжевый цвет в результате восстановления (обесцвечивание) метиленового синего при автоклавировании.

Осторожным встряхиванием (!) каждой пробирки в наклонном положении вновь придают еще горячей среде ее исходную грязно-серую окраску. Это происходит за счет окисления метиленового синего кислородом воздуха.

Среду скашивают, оставляя столбик высотой 2 см и косую поверхность 4-5 см. Застывшая среда должна в течение 2-3 дней «дозреть», т.е. приобрести однотонную сиреневато-светло-коричневую окраску, что свидетельствует об окислении, т.е. о восстановлении цветности метиленового синего по всей глубине среды. Посев культуры осуществляют штрихами по скошенной поверхности и уколом в столбик среды.

Трехсахарный агар с сахарозой и маннитом (Рессель II)

Состав:

Приготовление

Ингредиенты вводят в следующем порядке: в холодной воде растворить квасцы, затем добавить крахмал и сухой питательный агар, дать им хорошо раствориться, после чего внести остальные компоненты.

Среду доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, разливают в пробирки по 7-8 мл, автоклавируют при 0,5-0,7 атм. 15-20 мин. после чего скашивают. Цвет среды розово-красный.

Универсальный скошенный столбик

Состав:

Приготовление

Ингредиенты вносить в любом порядке. Количество питательного агара, вносимого в среду, зависит от его серии. Если на этикетке указано, что на 100 мл воды его надо брать 5 г, то в среду добавляют 3,5 г, если на этикетке имеется рекомендация 3,5 г на 100 мл, то добавляют 2,5 г. Среду кипятить в течение 10-15 мин., разливать в стерильные пробирки по 5 мл, автоклавировать при 0,5 атм. 15 мин., после чего скашивать. Цвет среды абрикосовый.