МУК 4.2.2878-11. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы определения бактерий рода Campylobacter в пищевых продуктах. Дополнения и изменения 1 к МУК 4.2.2321-08. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.06.2011)
Примечание
Документ введен в действие с 24 июня 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г. ОНИЩЕНКО
24 июня 2011 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAMPYLOBACTER В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ 1 К МУК 4.2.2321-08
Дата введения: с момента утверждения
1. Разработаны Учреждением Российской академии медицинских наук Научно-исследовательским институтом питания, ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» при участии фирмы «BioMerieux».
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24.06.2011.
4. Введены в действие с момента утверждения.
Внести дополнения и изменения в МУК 4.2.2321-08:
1. Раздел 1 «Общие положения и область применения» дополнить абзацем 1.3 следующего содержания:
«1.3. Настоящие Методические указания устанавливают методы определения бактерий рода Campylobacter в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения на основе бактериологического анализа (качественного и количественного с идентификацией до вида), а также фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (качественного недифференцированного суммарного определения бактерий видов C. jejuni, C. coli, C. lari, обусловливающих основную часть ОКИ кампилобактериозной природы у человека)».
2. Раздел 2 «Сущность метода» изложить в новой редакции:
2.1. Бактериологический метод определения бактерий рода Campylobacter основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды, содержащие антибиотики и аэротолерантные добавки, с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Все этапы инкубации посевов осуществляются в микроаэрофильных условиях. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к видам бактерий рода Campylobacter.
2.2. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа бактерий рода Campylobacter основан на связывании бактериальных антигенов, находящихся в бульоне обогащения, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), последующем удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, меченных щелочной фосфатазой, и флюоресцентно-меченого субстрата и измерении флюоресценции продукта гидролиза флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата), который катализируется щелочной фосфатазой. Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм.
2.2.1. Для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферона при 450 нм, и тест-наборы, в состав которых входят сенсибилизированные антителами наконечники, используемые в качестве пипетирующего устройства, и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюоресцентного анализа, зарегистрированные в РФ в установленном порядке. Предел обнаружения бактерий рода Campylobacter при использовании данного метода соответствует 1 клетке на 25 г (при наличии предобогащения).
2.2.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют анализаторы иммуноферментные и тест-наборы, зарегистрированные в РФ в установленном порядке и обеспечивающие проведение измерений с характеристиками специфичности и чувствительности, указанными в п. п. 1.3 и 2.2.1».
3. В разделе 3 «Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды» пункт 3.1 «Аппаратура и инструментарий» дополнить строкой:
Автоматический ИФА-анализатор для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа типа VIDAS(R) или miniVIDAS(R), или с аналогичными характеристиками, подобный BioMerieux, Франция, или аналог.
4. В разделе 3 пункт 3.2 «Лабораторная посуда и материалы» дополнить строками:
Пакет для гомогенизации с фильтром, подобный BioMerieux, Франция, или аналог Набор реагентов для определения бактерий рода Campylobacter типа VIDAS(R) Campylobacter (CAM) или с аналогичными характеристиками, подобный BioMerieux, Франция, или аналог.
5. Раздел 3 «Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды» дополнить пунктом 3.5 в следующей редакции:
«3.5. Состав тест-набора для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа»
В состав тест-набора входят материалы и реагенты в количестве, достаточном для исследования 26 проб и 4 контрольных образцов, состоящий из следующих компонентов:
| 30 стрипов для определения бактерий рода Campylobacter | STR | Готовы к использованию |
| 30 наконечников | SPR | Готовы к использованию. На внутреннюю поверхность наконечников нанесены антитела к поверхностным антигенам Campylobacter |
| Стандарт (1 фл. по 6 мл) | S1 | Готов к использованию. Очищенный и инактивированный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте |
| Положительный контроль определения (1 фл. по 6 мл) | C1 | Готов к использованию. Очищенный и инактивированный антиген Campylobacter + консервант + белковые стабилизаторы. Доверительный интервал указан на калибровочной карте |
| Отрицательный контроль определения (1 фл. по 6 мл) | C2 | Готов к использованию. Забуференный физиологический раствор — твин + консервант. Максимальное приемлемое значение указано на калибровочной карте |
| 1 калибровочная карта | Лист спецификаций с фабричными установками для калибровки тестов | |
| 1 инструкция | ||
3.5.1. Состав стрипа для фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Каждый стрип в тест-наборе состоит из 10 лунок, запечатанных фольгой, на которую нанесен штрих-код, несущий информацию о типе анализа, номере партии и сроке годности. Фольга перфорирована над лункой для внесения образца. Последняя лунка представляет собой кювету, в которой происходит считывание результата. Прочие лунки содержат реактивы для анализа. Распределение лунок в стрипе:
| Лунка | Реактивы |
|---|---|
| 1 | Лунка для внесения образца: внесите 0,5 куб. см бульона обогащения (обогащенной культуры), стандарта или контроля |
| 2 | Предпромывочный буфер (400 куб. мм): забуференный физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант |
| 3 — 4 - 5 - | Промывочный буфер (600 куб. мм): забуференный |
| 7 — 8 - 9 | физиологический раствор, содержащий твин (150 мМ/л) pH 7,6 + консервант |
| 6 | Конъюгат (400 куб. мм): антитела (IgG) к Campylobacter, меченные щелочной фосфатазой + консервант |
| 10 | Кювета, содержащая субстрат (300 куб. мм): 4-метил-умбелиферил-фосфат (0,6 М/л) + диэтаноламин (0,62 М/л или 6,6%, pH 9,2) + консервант |
3.5.2. Для определения бактерий рода Campylobacter методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа допускается использование другого оборудования и тест-наборов аналогичного назначения, зарегистрированных в РФ в установленном порядке, с аналогичными характеристиками чувствительности и специфичности».
6. Раздел 4 «Подготовка к анализу» дополнить пунктом 4.3 в следующей редакции:
«4.3. Требования к выполнению фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа»
4.3.1 Условия безопасного проведения работ
При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.
Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:
- не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;
- не использовать поврежденные стрипы;
- не использовать набор по истечении срока годности;
- не смешивать реактивы из различных партий;
- пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;
- анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.
Тест-набор содержит едкий реактив диэтаноламин, а также натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления.
4.3.2 Требования к квалификации специалистов
Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.
4.3.3 Условия выполнения измерений
7. Раздел 7 дополнить пунктом 7.3 в следующей редакции:
«7.3. Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа»
7.3.1 Подготовка анализатора к работе:
- Перед использованием реактивов новой партии в анализатор вводят (автоматически или вручную) спецификации реактивов, используя калибровочную карту, входящую в каждый набор. Процедуру необходимо проводить только один раз для каждой партии реактивов.
- Для каждой новой партии реактивов проводят калибровку прибора, используя стандарт, входящий в состав набора. Калибровку проводят после ввода данных партии, но не реже одного раза в 14 дней. Для этого в отдельные стрипы вносят по 0,5 куб. см реактива C1, C2 и в два стрипа реактив S1 из тест-набора. Необходимо ввести информацию об образце и контролях в анализатор для создания рабочего листа. Установить стрипы и наконечники в анализатор и запустить программу.
Эта операция необходима для построения точной калибровочной кривой и компенсации вариаций, которые могут возникнуть при хранении набора. Стандарт S1 необходимо тестировать в двукратной повторности согласно руководству по эксплуатации прибора. Результаты должны находиться в пределах установленного диапазона, указанного на калибровочной карте. Если результат не соответствует диапазону, следует повторить калибровку.
7.3.2 Подготовка образцов к фермент-связанному флюоресцентному иммуноанализу
Отобрать в пробирку 1 — 2 куб. см бульона обогащения, инкубированного по п. 7.1 МУК 4.2.2321-08, закрыть и нагревать на водяной бане (15 +/- 1) мин. при 95 — 100 °С. Охладить 10 мин., перемешать и внести 0,5 куб. см в стрип из тест-набора.
Оставшуюся часть бульона хранят в холодильнике при 2 — 4 °С для подтверждения положительных образцов.
7.3.3 Проведение фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа
Перед проведением анализа необходимое количество компонентов тест-набора оставить при комнатной температуре на 30 мин.
Для каждого анализа используется 1 стрип и 1 наконечник из тест-набора. В открытую лунку стрипа вносят 0,5 куб. см термостатированного образца по п. 7.3.2. Далее стрипы и наконечники устанавливают в анализатор, вводят название соответствующих образцов и запускают анализ. Время анализа приблизительно 70 мин.
7.3.4 Интерпретация результатов
Оптический сканер прибора измеряет флюоресценцию дважды в оптической кювете для каждого образца. Первый раз измеряется фон субстрата и кюветы перед внесением в нее субстрата. Второй раз флюоресценция измеряется после внесения субстрата в конус и образования флюоресцирующего продукта в результате ферментативной реакции на поверхности конуса. Вычитание фона кюветы из последнего измерения дает относительную величину флуоресценции — ОВФ (Relative Fluorescence Value) тестируемого образца. Интерпретация значений ОВФ проводится прибором автоматически согласно формуле:
[Результат теста = ОВФ образца / ОВФ стандарта]
| Результат теста | Интерпретация |
|---|---|
| < 0,1 | Отрицательный |
| >= 0,1 | Положительный |
Результат теста со значением меньше порогового указывает на то, что образец не содержит антигена Campylobacter либо содержит его в концентрации ниже порога определения. Результат теста со значением, равным или больше порогового, свидетельствует о том, что образец загрязнен бактериями рода Campylobacter. В этом случае следует провести подтверждение положительного результата по п. 7.3.5.
Результаты также считаются недействительными, если (1) значение ОВФ фона выше ожидаемого значения или (2) нет информации о значениях ОВФ стандарта. В первом случае возможно загрязнение субстрата, в связи с чем необходимо провести повторное тестирование образца с новым стрипом. Во втором случае должен быть протестирован новый стандарт из той же партии и результаты теста должны быть пересчитаны по этому стандарту.
На принтер выводится информация — тип теста, номер образца, дата и время анализа, номер партии и дата окончания срока годности набора, значения ОВФ, результат и его интерпретация.
7.3.5 Подтверждение положительного результата
Подтверждение положительного результата проводят путем высева 0,1 мл хранившегося в холодильнике бульона обогащения, полученного по п. 7.3.2, на поверхность одной из селективных сред (по п. 4.2.2). Инкубацию образцов проводят при температуре (42 +/- 1) °С в течение 20 — 24 ч, при отсутствии роста инкубировать еще 24 ч.
При наличии характерных колоний необходимо провести идентификацию до 5 подозрительных колоний на принадлежность к бактериям рода Campylobacter по п. 8.1.
При получении противоречивых результатов (положительных альтернативным методом, не подтвержденных стандартным методом) для проверки следует использовать дополнительные методы».