--- title: "\"МУК 4.2.2720-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток B. licheniformis ВКПМ В-9608 - продуцента протеазы в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.2720-10" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-2720-10" --- ## "МУК 4.2.2720-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток B. licheniformis ВКПМ В-9608 - продуцента протеазы в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" # "МУК 4.2.2720-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток B. licheniformis ВКПМ В-9608 - продуцента протеазы в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 04.08.2010) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100002) в действие с 4 октября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
4 августа 2010 года
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ** **КЛЕТОК B. LICHENIFORMIS ВКПМ В-9608 - ПРОДУЦЕНТА ПРОТЕАЗЫ** **В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.2720-10**
Дата введения
4 октября 2010 года
1. Разработаны ГОУ ВОП Российский государственный медицинский университет. 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1). 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г. 4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.
5. Введены впервые.
## 1. Общие положения и область применения Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма B. licheniformis ВКПМ В-9608 - продуцента протеазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 500000 клеток в 1 куб. м воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями [ГОСТ 17.2.4.02-81](https://bukva.ai/docs/gost-17-2-4-02-81) "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений". Методические указания предназначены для применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также лабораториями организаций, аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды". ## 2. Биологическая характеристика B. licheniformis ВКПМ В-9608 и его гигиенический норматив Штамм B. licheniformis ВКПМ В-9608 является продуцентом протеазы. Штамм создан с помощью генетических методов в ГосНИИ "Генетика" и депонирован в ВКПМ. B. licheniformis ВКПМ В-9608 строгий аэроб, сапрофит, мезофил. На LB-агаре при температуре 36 - 37 °C штамм дает обильный рост, при этом образуются колонии кремового цвета, неправильной формы, слизистые, тянущиеся за бактериологической петлей, шероховатые, непрозрачные. На 2 - 3-и сутки по краю колонии появляется светлая кайма, в центре колония наблюдается складчатая поверхность, максимальный диаметр - 8 - 10 мм. На мясопептонном бульоне штамм дает обильный рост клеток, раствор становится мутным, спустя 24 ч роста появляется кремоватый оттенок. Штамм интенсивно разлагает белковые среды благодаря действию протеолитических энзимов, при этом на желатине происходит разжижение, на среде лакмус - молоко - пощелочение, пептонизация. Устойчив к бета-лактамным антибиотикам, линкомицину и полимиксину, а также некоторым сульфаниламидам (сульфометаксозолу). Морфологически клетки представляют собой грамположительные одиночные подвижные палочки размером 0,6 - 0,8 х 0,2 - 0,3 мкм, образующие споры. В первые часы роста (логарифмическая фаза) образуются цепочки из 2 - 3 клеток вытянутой формы. К 48 - 56 ч (стационарная фаза) цепочки распадаются, клетки утолщаются, появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму. Систематическое положение микроорганизма Класс Schizomycetes Отряд Eubacteriales Семейство Bacillaceae Род Bacillus Вид licheniformis Штамм ВКПМ В-9608 Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 5000 кл./куб. м, пометка А, 4-й класс опасности. ## 3. Пределы измерений Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 5 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95. ## 4. Метод измерений Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений клеток микроорганизма на агаризованную среду LB-агар и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам. Косвенный метод основан на аспирации из воздуха клеток микроорганизма на поверхность плотной питательной среды (молочный агар Эйкмана) и подсчете прозрачных зон, образующихся вокруг выросших колоний и четко выделяющихся на общем молочно-мутном фоне среды через 18 - 24 ч. При данном методе на одной чашке Петри после забора пробы может быть учтено не более 50 колоний, т.к. большее количество колоний на чашке образует сливающиеся зоны пептонизации молочного белка казеина. ## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. ### 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Импактор микробиологический "Флора-100" ТУ 9443-001-05031637-2002 Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77 Прибор MAS-100 ECO фирмы "Merk" (Германия) для отбора проб воздуха Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая [ГОСТ 25556-81](https://bukva.ai/docs/gost-5556-81) ### 5.2. Реактивы, растворы Полимиксин, левомицетин, нистатин Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67)
LB-агар (дрожжевой экстракт 5 г/л, триптон
10 г/л, NaCl 5 г/л, агар 15 г/л, pH 6,8 - 7,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин.) Молочный агар Эйкмана (10 мл среды МПА и 2,5 - 3,0 мл стерильного молока - содержание жира не более 2%, белка - 2,8% - смешать ex tempore) ## 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования. 6.1. Санитарные правила [СП 1.2.731-99](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-4-2) "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами". 6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88. 6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора. 6.4. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977). 6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ## 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ## 8. Условия измерений Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 740 - 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70%. ## 9. Проведение измерения ### 9.1. Условия отбора проб воздуха Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин. на поверхность плотной агаризованной среды. Время аспирации воздуха (5 - 15 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма. Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. ### 9.2. Выполнение анализа При выполнении анализа воздуха прямым методом LB-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор полимиксина (или левомицетина) из расчета 10 - 15 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), раствор нистатина из расчета 10 мкг на 1 мл среды (для подавления грибковой флоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. При выполнении анализа воздуха косвенным методом к уже приготовленному МПА добавляют, соблюдая все правила асептики, стерильное молоко из расчета 10 мл агаризованной среды и 2,5 - 3,0 мл молока и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 37 °C. Через 18 - 24 ч производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам (прямой метод) или прозрачных зон вокруг выросших колоний продуцента на общем молочно-мутном фоне среды (косвенный метод) как результат ферментативного действия протеазы на молочный белок - казеин. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, [вып. 2](https://bukva.ai/docs/gf-xi-minzdrav-sssr-ministerstvo), с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки используемой среды, термостатируется в термостате при 37 °C и на 2 - 3-и сутки производится подсчет выросших колоний. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать в 2 - 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств. ## 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле: N х 1000 X = --------, кл./куб. м, V где: X - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество зон вокруг колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). ## 11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме: Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Bacillus licheniformis ВКПМ В-9608 в атмосферном воздухе населенных мест 1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории. 2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика. 3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией. 4. Описание состояния объекта исследования.
5. Дата получения объекта измерений и дата проведения анализа.
6. Место отбора пробы. Результаты микробиологического анализа | Шифр или N пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл./куб. м | | --- | --- | --- |
Ответственный исполнитель:
Руководитель:
## Список литературы 1. [Руководство](https://bukva.ai/docs/rukovodstvo-rd-52-04-186-89) по контролю загрязнения атмосферы. РД 52.04.186-96. М., 1991, 693 с. 2. [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "ГСИ. Методики выполнения измерений". 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980, 27 с. 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977, 7 с.
5. [ГОСТ 17.2.4.02-81](https://bukva.ai/docs/gost-17-2-4-02-81) "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с.
---