--- title: "\"МУК 4.2.2656-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.2656-10" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-2656-10" --- ## "МУК 4.2.2656-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны. Методические указания" # "МУК 4.2.2656-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 09.07.2010) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100002) в действие с 9 июля 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
9 июля 2010 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК** **ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ASPERGILLUS NIGER** **ВКПМ F-171 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.2.2656-10**
Дата введения -
с момента утверждения 1. Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК РАСХН). 2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 июля 2010 г. 4. Введены в действие с момента утверждения. 5. Введены впервые. ## 1. Общие положения и область применения Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171, селекционированного в ГУ ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН (ГУ ВНИИПАКК), в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха. Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации конидий штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений биотехнологического производства лимонной кислоты и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений" и Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда". Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. ## 2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив Продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °C клетки (кл.) образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием, аспорогенные. На 5-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем 8,1 см на среде Чапека и 8,6 см - на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии бежевая - на среде Чапека, светло-бежевая - на сусло-агаре. Воздушный мицелий сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются несептированные клетки - конидиеносцы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм, максимальная - 1265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца - от 9 до 20 мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие - пузырек диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются цилиндрические выросты - стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы первого слоя отделяются, в основном, две вторичные стеригмы. Стеригмы первого слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя - от 6 до 32 мкм, второго слоя - от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют шарообразную форму, диаметр - 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами. Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см - на среде Чапека и 0,6 см - на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая, белая. Систематическое положение микроорганизма Царство Fungi Подцарство Neomycota Отдел Ascomycota Подотдел Euascomycotina Класс Plectomycetes Порядок Hyphomycetales Род Aspergillus Вид Niger Штамм ВКПМ F-171, ГУ ВНИИПАКК Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент лимонной кислоты. Штамм растет на жидких агаризованных средах. Оптимальная температура - от 28 до 32 °C. Для размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°). Предельно допустимая концентрация Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 3 воздухе рабочей зоны - 1 x 10 кл./куб. м, пометка А, класс опасности 3. ## 3. Пределы измерений Методика позволяет выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м. ## 4. Метод измерений Метод измерения концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста. ## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. ### 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства Импактор воздуха микробиологический "Флора-100" ТУ 64-098-33-95 Термостаты электрические суховоздушные типа ТС ТУ 64-1-1382-76 Автоклав электрический Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой ГОСТ 16317-87 Весы лабораторные аналитические ВЛА-200-М Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм ГОСТ 25336-82 Колбы конические ГОСТ 25336-82 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа МБИ-15 ГОСТ 25706-83 Термометр Прибор для определения влажности воздуха ### 5.2. Реактивы, растворы Среда Чапека (или сухой бакто-агар Czapek) ТУ 9229-014-00419789-95 (или импортного производства) Среда сусло-агар с массовой концентрацией лимонной кислоты 1,0% [ГОСТ 10444.1-84](https://bukva.ai/docs/gost-10444-1-84) Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья [ГОСТ Р 51652-2000](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000) ## 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны соблюдают: - правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88; - правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов; - требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980); - положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977); - санитарные правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322-08; - требования безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции по контролю производства лимонной кислоты (1997). Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ## 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ## 8. Условия измерений Измерение концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора "Фора-100" при температуре окружающей среды от 0 до 50 °C и относительной влажности воздуха не более 80%. ## 9. Проведение измерения ### 9.1. Условия отбора проб воздуха Определение концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную питательную среду Чапека или сусло-агар с последующей инкубацией в термостате и подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам. Воздух аспирируют с помощью импактора "Флора-100" в автоматическом режиме со скоростью 10 куб. дм/мин. на поверхность среды Чапека или сусло-агара на чашки Петри. Линейная скорость анализируемого воздуха автоматически поддерживается на уровне, позволяющем осаждать с 50% эффективностью частицы диаметром не менее 1,4 мкм (D ). Контроль 50 параметров (заданный отбираемый объем воздуха, текущий отобранный объем) осуществляется методом индикации. Аспирацию воздуха проводят с интервалом 2 мин. и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с [МУК 4.2.734-99](https://bukva.ai/docs/muk-4-2-734-99). Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора по форме: Акт отбора проб 1. Дата, Ф.И.О. работающего (рабочее место) _______________________________ 2. Профессия ______________________________________________________________ 3. Предприятие (лаборатория, подразделение) _______________________________ 4. Участок (технологическая стадия, операция) _____________________________ 5. Место отбора (наименование рабочей зоны) _______________________________ 6. Прибор для отбора проб _________________________________________________ 7. Количество проб и точка их отбора ______________________________________ 8. Условия отбора проб (объем прокаченного воздуха и время аспирации) _____ ___________________________________________________________________________ 9. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____ ___________________________________________________________________________ 10. Микроорганизм, содержание которого контролируется (род, вид, штамм) ___ ___________________________________________________________________________ 11. Питательная среда, оптимум роста, время инкубации _____________________ Ответственный исполнитель Руководитель (технологического участка,
лаборатории, подразделения)
### 9.2. Выполнение анализа Агаризованную среду Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в стерильные чашки Петри по 20 куб. см. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C на сутки, после чего проросшие чашки бракуют. После отбора проб воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °C на 48 ч, по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив - планапохроматический; увеличение - 40,0 x 0,65; система - сухая; поле зрения с окуляром 10x в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр - К-6,3x. ## 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 куб. м воздуха выполняют на основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля, и производят по формуле: П x 1000 K = --------, C x t где: K - концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м; П - количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри; 1000 - коэффициент пересчета 1 куб. дм в 1 куб. м воздуха;
C - скорость аспирации, куб. дм/мин.;
t - время аспирации, мин. ## 11. Оформление результатов измерений Результаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол N количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны 1. Дата проведения анализа ________________________________________________ 2. Место отбора пробы _____________________________________________________ 3. Название лаборатории ___________________________________________________ 4. Юридический адрес организации __________________________________________ Результаты микробиологического анализа | Шифр или N пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл./куб. м | | --- | --- | --- | Ответственный исполнитель __________________________________ ## Список литературы 1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны". М.: Стандартинформ, 1988. 49 с. 2. [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений". М.: Госстандарт России, 1997. 19 с. 3. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда". М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.
4. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.
5. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
6. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитных болезней". М.: Минздрав России, 2008. 19 с.
7. ИК 01-00334557-97 "Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты". СПб.: ВНИИПАКК, 1997. 268 с.
---