МУК 4.2.2428-08. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод определения бактерий Enterobacter Sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.10.2008)

29 октября 2008 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SAKAZAKII В ПРОДУКТАХ ДЛЯ ПИТАНИЯ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

15 декабря 2008 года

1. Разработаны Государственным учреждением «Научно-исследовательский институт питания» Российской Академии медицинских наук.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29 октября 2008 г.

4. Введены в действие с 15 декабря 2008 г.

5. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок контроля и методы определения бактерий Enterobacter sakazakii — возбудителей пищевых токсикоинфекций у детей раннего возраста — при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.2. Методические указания предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, а также лабораторную диагностику заболеваний с пищевым путем передачи. Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

1.3. Контролю на наличие бактерий E. sakazakii подлежат детские молочные смеси и продукты прикорма сухие, а также специализированные продукты для лечебного и профилактического питания детей первого года жизни, при анализе которых на наличие патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонелл, не были выявлены облигатные патогены, принадлежащие к родам Salmonella, Shigella, Yersinia, группам энтеровирулентных Escherichia coli, но выявлялся рост сопутствующей грамотрицательной неспорообразующей микрофлоры.

1.4. Необходимость контроля указанных групп продукции на наличие E. sakazakii обусловлена регистрацией в последние годы документированных спорадических случаев и вспышек септических инфекций и некротизирующего энтероколита у детей 1 года жизни, в первую очередь недоношенных, новорожденных с низкой массой тела или иммунокомпромиссных. Все случаи заболеваний связаны с употреблением детских молочных смесей, контаминированных E. sakazakii, в т.ч. при очень низких уровнях возбудителя (1 — 10 КОЕ/г). При этом установлено, что в первую очередь E. sakazakii может попадать в сухие молочные смеси с контаминированными ингредиентами, добавляемыми после сушки, или из окружающей среды в процессе упаковки готового продукта.

1.5. Предлагаемый метод определения бактерий E. sakazakii в пищевых продуктах, предназначенных для детей раннего возраста, предусматривает определение наличия или отсутствия указанных микроорганизмов в определенной массе (объеме) продукта в соответствии с нормативами СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», выраженными в альтернативной форме и основанными на существующей системе отбора образцов и оценки результатов анализа по двухклассной системе. Настоящие методические указания также предусматривают определение количества E. sakazakii в пищевых продуктах для детей раннего возраста методом наиболее вероятного числа (НВЧ).

1.6. Обнаружение E. sakazakii в 300 г инстантных молочных смесей и продуктов прикорма сухих, предназначенных для детей 1 года жизни, или в 300 г сухих молочных смесей или специализированных продуктов для детей младше 6 месяцев должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, свидетельствующее о высокой степени риска для детей данной возрастной категории, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.

2. Сущность метода

2.1. Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii основан на высеве определенных количеств продукта в жидкие селективные среды для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae с последующим пересевом на поверхность твердых селективных сред, инкубировании посевов, выявлении в этих посевах бактерий, способных расти и образовывать типичные колонии на поверхности селективного агара, с последующим выделением чистой культуры. Ниже представлена методическая схема определения E. sakazakii.

Таблица 1

2.2. Идентификация чистых культур проводится по совокупности морфологических, биохимических и других признаков, определяющих принадлежность к виду E. sakazakii. Подтверждение принадлежности к E. sakazakii производится путем получения развернутых биохимических характеристик штаммов. Допускается использование тест-систем для биохимической дифференциации энтеробактерий API 20E, Rapid 20E, ID 32E (ф. "БиоМерье", Франция) и др.

Определение биохимических характеристик, дифференцирующих E. sakazakii от близкородственных представителей энтеробактерий Enterobacter cloacae и Pantoea agglomerans, приведены в табл. 2.

Таблица 2

Примечания:

"+" - 90 - 100% штаммов положительные;

"(+)" - 21 - 89% штаммов положительные;

"-" - 0 - 9% штаммов положительные;

"(-)" - 10 - 24% штаммов положительные.

Ведущими дифференцирующими признаками Enterobacter sakazakii от других представителей вида Enterobacter являются способность к образованию желтого пигмента при культивировании на неселективных средах при оптимальной температуре 25 °C и отсутствие ферментации D-сорбита. Для дифференциации E. sakazakii от сорбитвариабельных и обладающих желтым пигментом представителей рода Pantoea agglomerans (Syn: Erwinia spp.) используется тест разжижения желатины.

В качестве дополнительного теста при идентификации E. sakazakii возможно определение альфа-глюкозидазной активности на хромогенных средах, содержащих 4-нитрофенил-альфа-d-глюкопиранозид или 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-альфа,d-глюкопиранозид.

3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

3.1. Аппаратура и инструментарий

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений pH +/- 0,01 ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C ТУ 64-1-28-70-76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 37 °C с отклонением от заданной +/- 1 °C ТУ 64-1-1382-83

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 41,5 °C с отклонением от заданной +/- 1 °C ТУ 64-1-1382-83

Весы лабораторные общего назначения 2 и 4 класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3,

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды в соответствии с ГОСТ 6709-72

Гомогенизатор перистальтического типа "Микс-2", "Стомайкер" или других наименований AES Lab, Cat. N AESAP 1066

Гомогенизатор типа "вортекс"

Микропипетки на 200 - 1000 мкл BIOHIT, Cat. N 720040 или "Ленпипет"

Облучатель бактерицидный настенный

ОБН-150 или других видов                             ТУ-16-535-84
Холодильник бытовой электрический                    ГОСТ 16317-87

Пинцет медицинский ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские                                  ГОСТ 21239-89
Скальпель хирургический, 15 см                       ГОСТ 21240-89
Часы механические сигнальные                         ГОСТ 3145-84
Электроплитка                                        ГОСТ 14919-83

Аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках (или другая аппаратура для встряхивания) ТУ 64-1-2451-78

3.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная                   ГОСТ 12026-76
Марля медицинская                                    ГОСТ 9412-77

или круглые разной вместимости                       ГОСТ 1770-74
Воронки стеклянные                                   ГОСТ 25336-82
Вата медицинская гигроскопическая                    ГОСТ 5556-81
Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см            ГОСТ 29227-91
Пробирки типов П1, П2                                ГОСТ 25336-82
Стекла предметные для микропрепаратов                ГОСТ 6672-75
Спиртовки лабораторные стеклянные                    ГОСТ 23932-90

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100 °C (цена деления шкалы 1 °C) ГОСТ 13646-68

Чашки биологические (Петри) или одноразовые

из полимерных материалов                             ГОСТ 23932-90
Пакеты стерильные для гомогенизатора                 AES Lab.,

                                                 Cat. N AES400/50G

Отраслевой стандарт для визуальной оценки мутности № 10 ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Денситометр для бактериальных суспензий типа «Densi-La-Meter» или «Денсимат» ф. «Лахема», «BioMerieux»

Стандарт Макфарланда № 1, 2, 3 ф. «BioMerieux»

Петля бактериологическая

3.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический                              ГОСТ 17206-84
Вода дистиллированная                                ГОСТ 6709-72
D-глюкоза, ч.                                        ГОСТ 6038-79
D-лактоза, 1-водная                                  ТУ 6-09-22-98-79

Маннит

D-сорбит

Рамноза

Калия гидроокись                                     ГОСТ 24363-80
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.              ГОСТ 4198-75
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный          ГОСТ 2493-75
Кислота соляная, х.ч.                                ГОСТ 3118-77
Литий хлористый, ч., или х.ч., или ч.д.а.            ГОСТ 4328-77
Масло иммерсионное для микроскопии                   ГОСТ 31739-78

Набор реактивов для окраски по Граму

Натрий-аммоний фосфорнокислый двузамещенный, 4-водный, ч. или х.ч. ГОСТ 4170-78

Натрия гидроокись, ч.д.а.                            ГОСТ 4328-77
Натрий лимоннокислый, 5,5-водный, ч.д.а.             ГОСТ 22280-75
Натрий хлористый, ч., или х.ч., или ч.д.а.           ГОСТ 4233-77
Пара-диметиламинобензальдегид, ч.                    ТУ 6-09-3272-77

Пептон сухой ферментативный для

бактериологических целей                             ГОСТ 13805-76
Спирт этиловый ректификованный технический           ГОСТ 18300-87
Спирт этиловый ректификованный                       ГОСТ 5962-67

Феноловый красный ГОСТ 5853-51

Фенолфталеин                                         ГОСТ 5850-72
Фуксин основной                                      ТУ 6-09-4119-75
Хлороформ технический                                ГОСТ 2-15-76-72
Уксусная кислота                                     ГОСТ 61-75

Сульфаниловая кислота альфа-Нафтол

Цинк порошкообразный ГОСТ 3640

Желатин сухой

Экстракт дрожжевой сухой

Тест-штамм Enterobacter sakazakii, типичный по культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам ГИСК им. Л.А. Тарасевича

Пептонная вода забуференная (сухая)

Триптозный ГРМ-агар и ГРМ-бульон, ФС 42-3377-97 (ГНЦПМ)

Питательный бульон и питательный агар ТУ 10-02-02-789-176-94

Триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) HiMedia M1214

Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом (TSYEB) HiMedia M1263

рамнозой, дульцитом, адонитом, сахарозой,

                                                 им. И.И. Мечникова
                                                 НИИ питательных сред)

SIM-arap (сероводород-индол-подвижность)             Difco
Среда Эндо                                           ТУ 9229-072-00419785
Агар желчный фиолетово-красный                       ТУ 9229-072-00419785
Среда Кесслер с глюкозой                             ГОСТ 30519-97
Бульон Мак-Конки с глюкозой                          ГОСТ 30519-97

Бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой ГОСТ 30519-97

Тест-системы биохимические для видовой идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E, для идентификации Enterobacteriaceae и других грамотрицательных палочек BioMerieux

Набор реактивов для окраски по Граму

Набор для постановки оксидазного теста

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками, прошедших регистрацию в РФ в установленном порядке, после процедуры их стандартизации относительно официально утвержденных методов анализа.

Питательные среды и биологические препараты зарубежного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4. Подготовка к анализу

4.1. Приготовление растворов и реактивов

4.2. Приготовление питательных сред

4.2.1. Среды промышленного изготовления, поименованные в п. 3.3, готовят согласно прописям на этикетке или в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.

4.2.2. Питательный агар с 5% глюкозы готовят в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

4.2.3. Триптон-соевый бульон с дрожжевым экстрактом, триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом.

Состав сред (г/л): ферментативный гидролизат казеина — 17,0; пептон соевый — 3,0; натрий хлористый — 5,0; фосфат калия однозамещенный — 2,5; глюкоза — 2,5; дрожжевой экстракт — 6,0; агар микробиологический (для TSYEA) — 15,0.

Компоненты растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.

Готовые среды разливают в стерильные колбы или пробирки и хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C.

4.2.4. Среда для определения подвижности: 20 г гидролизата казеина ферментативного, 6 г пептона мясного ферментативного и 5 г агара растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды, устанавливают pH 7,3 +/- 0,2, разливают в пробирки по 5 — 7 куб. см и стерилизуют при 121 °C в течение 15 мин.

4.2.5. Среды Гисса с углеводами: 10 г пептона ферментативного и 5 г натрия хлористого растворяют в 1000 куб. см дистиллированной воды и добавляют 10 г соответствующего углевода. Устанавливают pH 7,1 +/- 0,1, вносят 10 мл индикатора Андреде (также возможно использование индикатора бромкрезолового пурпурного, «ВР» и др.), разливают в пробирки и стерилизуют при 112 °C в течение 20 мин.

5. Отбор и подготовка проб к анализу

5.1. Отбор и подготовку проб продукции производят в соответствии с ГОСТ 26668-85 «Методы отбора проб для микробиологических анализов», ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов», МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов», ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96). Масса или объем отбираемых проб должны быть достаточными для проведения исследования на патогенные микроорганизмы и минимально вдвое превышать аналитический образец.

5.2. От продукции в потребительской таре пробы отбирают в количестве одной или нескольких единиц в зависимости от массы или объема потребительской тары, с тем чтобы количество было достаточным для проведения анализа. От продукции в транспортной или потребительской таре больших размеров (или неупакованной) пробы отбирают из разных мест с различной глубины, включая поверхность.

5.3. Для микробиологических анализов пробы отбирают до взятия проб на физико-химические и органолептические анализы стерильным инструментом в стерильную посуду.

5.4. Первичный посев исследуемых проб продуктов на патогенные микроорганизмы проводят в соответствии с порядком, изложенным в МУК 4.2.577-96 «Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов».

6. Проведение анализа

6.1. Пробы продуктов массой 100, 125 или 137,5 г вносят в фосфатный буферный раствор (ФБР) или изотонический раствор (п. 3.3) в соотношении 1:9 по объему. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч.

6.2. При количественном анализе общая масса (объем) навески должна быть не менее 400 г (куб. см).

Из подготовленной по п. 5 пробы для анализа отбирают 4 навески (порции) продукта массой 100 г (куб. см) каждая. Производят посев каждой из трех навесок (порций) в 900 куб. см ФБР и перемешивают.

Из четвертой навески (порции) массой (объемом) 100 г (куб. см) отбирают три навески (порции) продукта массой 10 г (куб. см) и производят посев в 90 куб. см ФБР, перемешивают. Из этой же пробы отбирают три навески (порции) продукта массой 1 г (куб. см) и производят посев в 9 куб. см ФБР. Для посева (при необходимости — предполагаемом высоком содержании E. sakazakii в продукте) меньших количеств продукта — 0,1; 0,01 г — делают десятикратно убывающие разведения навески массой 10 г и вносят по 1 куб. см (х 3) соответствующих разведений в 9 куб. см ФБР.

6.2.1. После термостатирования проб продукта в среде для первичного накопления 10 куб. см суспензии (1 куб. см — при первичном засеве 1 г или 1 куб. см) пересевают в 90 куб. см (9 куб. см) жидких селективных сред для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae по ГОСТ 30519-97 — среду Кесслера с глюкозой, или глюкозный бульон с бриллиантовым зеленым и желчью, или бульон Мак-Конки. Посевы термостатируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (22 +/- 2) ч.

6.2.2. Из посевов после термостатирования, независимо от наличия или отсутствия признаков роста, делают пересев штрихом на поверхность чашек Петри с одной из агаризованных дифференциально-диагностических сред по п. 3.3. Допускается проводить пересев петлей штрихом. Чашки со средами предварительно подсушивают.

6.2.3. При отсутствии роста на чашках с дифференциально-диагностическими средами типа агара Эндо или агара желчного фиолетово-красного анализ прекращают и дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной пробе.

6.3. При обнаружении на чашках лактозоположительных колоний дальнейшему изучению подвергают все обнаруженные варианты, для чего отбирают по 3 — 5 колоний каждого типа для их дальнейшего изучения.

6.4. Отобранные для исследования 3 — 5 характерных колоний пересевают на поверхность триптон-соевого агара с дрожжевым экстрактом по п. 3.3 и термостатируют при температуре 25 °C в течение 72 ч. В качестве положительного контроля используют референс-штамм E. sakazakii, типичный по фенотипическим свойствам.

6.5. Культуры, растущие на триптон-соевом агаре с образованием желтого или желто-коричневого пигмента, подвергают дальнейшему изучению для подтверждения принадлежности к Enterobacter sakazakii.

7. Подтверждение принадлежности выделенных культур к Enterobacter sakazakii

7.1. Подтверждение принадлежности выделенных культур проводят с применением тест-систем для биохимической идентификации API 20E, Rapid 20E, ID 32E.

7.2. К бактериям Enterobacter sakazakii относят культуры, имеющие характерные признаки роста на дифференциально-диагностических средах, при микроскопии по Граму окрашенные отрицательно, подвижные, оксидазоотрицательные, соответствующие комплексу признаков, указанных в табл. 2, имеющие желтый пигмент, не ферментирующие сорбит и не разжижающие желатину. Бактерии Е. sakazakii обладают альфа-глюкозидазной активностью.

8. Учет результатов

8.1 Результаты оценивают по каждой исследованной пробе отдельно.

8.2. При получении положительного результата подтверждающего анализа дают заключение о выявлении E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

При получении отрицательного результата дают заключение об отсутствии E. sakazakii в исследованной навеске (объеме) продукта.

8.3 Учет результатов при количественном определении.

Результат оценивают по каждой исследованной пробе продукта отдельно. Регистрируют число положительных результатов в колбах и пробирках с посевами трех последовательно убывающих масс (объемов) продукта, в которых подтверждено наличие бактерий E. sakazakii при пересеве на твердые питательные среды и последующей идентификации. В зависимости от получаемой комбинации положительных и отрицательных результатов для каждого значения массы (объема) продукта составляют трехзначное число (индекс), по которому, используя таблицу, приведенную в Приложении, находят наиболее вероятное число (НВЧ) бактерий E. sakazakii, соответствующее их содержанию в 1 г (куб. см) продукта.

Для окончательного определения НВЧ бактерий E. sakazakii в анализируемом образце учитывают значение первой выбранной для расчета индекса НВЧ массы (объема) продукта с подтвержденным наличием E. sakazakii. Так, в случае если расчет ведется от посева массы (объема) 100 г (куб. см) (х 3) продукта, количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ, взятого из таблицы соответственно установленному индексу, на 100. В случае, когда в качестве первого значения для расчета выбрана масса (объем) 10 г (х 3), количество E. sakazakii в 1 г (куб. см) образца рассчитывается путем деления числа НВЧ из таблицы на 10.

Пример: Бактерии E. sakazakii обнаружены в трех повторностях при посеве 100 г, в трех повторностях при посеве 10 г и в одной — при посеве 1 г.

Результат по числу секторов с подтвержденным ростом бактерий E. sakazakii из трех выбранных масс записывается как индекс 3:3:1, что соответствует НВЧ, равному 46 (см. Приложение). Соответственно, наиболее вероятное число бактерий E. sakazakii составляет 0,46 КОЕ в 1 г продукта.

Если значение НВЧ по таблице составляет величину более чем 110 КОЕ (индекс 3:3:3), исследование целесообразно повторить, используя более высокие разведения образца, в которых исходная концентрация продукта будет в 10 или 100 раз ниже, чем в первоначально выбранном значении.

9. Требования безопасности

Исследования пищевых продуктов на наличие Enterobacter sakazakii проводят в соответствии с СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

10. Нормативные ссылки

10.1. ГОСТ 30519-97 «Продукты пищевые. Метод выявления бактерий семейства Enterobacteriaceae».

10.2. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».

10.3. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических исследований».

10.4. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».

10.5. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».

10.6. ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов, питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе».

10.7. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

10.8. СанПиН 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

Приложение