МУК 4.2.2317-08. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 18.01.2008)

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОТБОР, ПРОВЕРКА И ХРАНЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ ШТАММОВ КОКЛЮШНЫХ, ПАРАКОКЛЮШНЫХ И БРОНХИСЕПТИКОЗНЫХ БАКТЕРИЙ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны: Федеральным государственным учреждением науки «Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.»

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол № 3 от 6 декабря 2007 г.).

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 18 января 2008 г.

4. Введены взамен документа — «Инструкция по отбору, проверке и хранению производственных штаммов коклюшных бактерий», МЗ СССР, 1987 г.

1. Область применения

1.1. Настоящие Методические указания устанавливают требования к штаммам коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий, используемым в производстве корпускулярного или бесклеточного коклюшного компонента комплексных вакцин, а также диагностическим коклюшным и паракоклюшным препаратам и методам их контроля, условиям приготовления лиофилизированных культур, их хранению.

1.2. Методические указания предназначены для организаций, осуществляющих производственный выпуск препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша; органов и учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор; учреждений, осуществляющих свою деятельность в целях обеспечения государственного санитарно-эпидемиологического надзора; других органов и организаций, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью препаратов для профилактики и диагностики коклюша и паракоклюша.

2. Требования к производственным штаммам коклюшных бактерий Bordetella pertussis

Для производства корпускулярного или бесклеточного коклюшного компонента комплексных вакцин и диагностических препаратов используют штаммы B. pertussis, отвечающие требованиям, характерным для гладкой формы (фазы I) бактерий. Из каждого изучаемого штамма готовят коклюшную вакцину (КВ), которую характеризуют по всем требуемым параметрам. Коклюшные микробные клетки и КВ, приготовленные из них, должны отвечать следующим требованиям.

2.1. Морфология

Коклюшные бактерии — неподвижные грамотрицательные овоидной формы мелкие палочки (коккобактерии), располагающиеся в мазках отдельно или парами, без признаков полиморфизма, размером 0,2 — 0,3 х 0,5 — 1,0 мкм. Имеют нежную капсулу. Спор не образуют.

2.2. Культуральные свойства

Строгие аэробы, при росте использующие никотиновую кислоту, глутамин и цистеин как источники азота, углерода и энергии. Колонии микробов 1-го пассажа (посев лиофильно высушенной культуры из ампулы) появляются через 3 — 4 суток.

На среде Борде-Жангу (Прилож. 1) колонии мелкие диаметром от 0,5 до 1,0 мм выпуклые круглые с ровными краями серого цвета, блестящие (в виде «жемчужин»), полупрозрачные, окруженные нерезко ограниченной зоной гемолиза. На среде КУА (Прилож. 1) колонии мелкие, диаметром около 1,0 мм выпуклые круглые с ровными краями серовато-кремового цвета, блестящие. Культуры не должны расти на мясо-пептонном агаре.

Оптимальная температура выращивания (36,0 +/- 0,5) °С.

2.3. Ферментативные свойства

B. pertussis ферментативно малоактивны, сахаров не расщепляют, не обладают протеолитической активностью, не восстанавливают нитратов, продуцируют оксидазу, каталазоположительны, лакмусовое молоко подщелачивают за 12 — 14 дней (табл. 1).

Символы: + - свойственно виду; - - не свойственно виду.

а - положительно в нитратной среде с добавлением никотинамид аденин динуклеотида (NAD).

б - положительна в течение 4 ч.

2.4. Серологические свойства

Сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) культуры должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, сывороткой диагностической паракоклюшной (титр не ниже 1:16000) - не выше 1/10 титра.

2.5. Антигенная структура (серотипы)

Для рода Bordetella общим (родовым признаком) является наличие агглютиногена 7. Вид pertussis характеризуется обязательным присутствием агглютиногена 1 (видовой признак). Кроме того, в разной комбинации в состав штаммов могут входить агглютиногены: 2, 3, 4, 5, 6, 13 (табл. 2). При изготовлении вакцин необходимо использовать штаммы трех серотипов (1, 2, 3; 1.2.0; 1.0.3), взятых в равных соотношениях. Культуры должны агглютинироваться соответствующими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 не ниже 1:1280.

2.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

Единичные колонии культур 2 - 3 пассажа на 1 - 2 сутки роста в тонком слое (1,5 - 2,0 мм) среды Борде-Жангу должны быть окружены зоной гемолиза.

Коклюшная суспензия (КС) мутностью 10 МЕ должна агглютинировать эритроциты человека 0 группы крови, куриные или гусиные эритроциты на 2 креста.

2.7. Дермонекротические свойства

При внутрикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 МЕ, должен образоваться геморрагический некроз размером от 0,5 до 2,0 см в диаметре, у морских свинок - от 0,3 до 1,0 см.

2.8. Вирулентность

    Культура  должна   быть  вирулентной   для  мышей:  при  интраназальном
заражении ЛД   должна быть в пределах 10 - 200 млн. микробных клеток, а при

        50

внутримозговом заражении — не выше 25 млн. микробных клеток.

Примечание.

Мутность микробной взвеси определяют в сравнении с ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-85-05), который откалиброван по международному стандартному образцу. 1 МЕ (международная единица мутности) условно соответствует 1 млрд. коклюшных бактерий.

2.9. Токсичность

КВ, приготовленная из обезвреженных формальдегидом культур одного штамма, содержащая мертиолят (100 +/- 20) мкг/мл, должна обладать низкой токсичностью.

Определение остаточной токсичности

2.9.1 В тесте изменения массы тела мышей по методу, рекомендованному

                                                                     10

ВОЗ. При внутрибрюшинном введении КВ в объеме 0,5 мл, содержащем 10 микробных клеток, все животные должны быть живы в течение срока наблюдения.

а) Через 72 часа групповая масса тела мышей должна быть не ниже их массы тела перед введением препарата.

б) Через 7 суток наблюдения относительный прирост массы тела мышей, получивших испытуемую вакцину, должен составлять не менее 60% прироста массы тела контрольных мышей и не менее абсолютного и относительного прироста массы тела мышей, получивших отраслевой стандартный образец иммуногенной активности коклюшной вакцины ОСО 42-28-89-01П.

в) Относительный прирост массы тела мышей, получивших ОСО 42-28-89-01П, должен соответствовать установленному показателю.

Если при проведении опыта одно из указанных условий нарушается, опыт повторяют на удвоенном количестве животных при тех же условиях учета опыта. Допускается гибель не более 5% от общего числа животных.

2.9.2 По лейкоцитозстимулирующей активности (ЛСА). КВ в объеме 0,5 мл,

         10

содержащем 10   микробных  клеток,  вводят  мышам  внутрибрюшинно.  Вакцину
следует   считать   слаботоксичной,   если   индекс   ЛСА  по  отношению  к
ОСО 42-28-89-01П составляет 0,5 и меньше; средней  токсичности, если индекс
ЛСА находится  в пределах  от 0,5 до 1,0; с выраженной  токсичностью,  если
индекс ЛСА более 1,0. Для производства  коклюшного компонента вакцин штаммы

с выраженной токсичностью использовать нельзя.

2.9.3. По гистаминсенсибилизирующей активности (ГСА). Разные дозы КВ вводят внутрибрюшинно. КВ следует считать слаботоксичной, если индекс ГСА по отношению к отраслевому стандартному образцу гистаминсенсибилизирующей активности коклюшной вакцины ОСО 42-28-87-02П будет равен 0,5 или меньше; среднетоксичной, если индекс ГСА будет находиться в пределах от 0,5 до 1,0; и с выраженными гистаминсенсибилизирующими свойствами, если индекс ГСА будет 1,0 и более. Для производства коклюшного компонента вакцин штаммы с выраженной токсичностью использовать нельзя.

2.9.4. По остаточному содержанию термолабильного (дермонекротического) токсина (ТЛТ). Определяют при подкожном введении испытуемых КВ в затылочную область мышей-сосунков или при внутрикожном введении белокожим кроликам породы шиншилла.

КВ не должна вызывать изменения кожных покровов у мышей-сосунков.

КВ не должна вызывать у кроликов некроз. Допускается гиперемия диаметром не более 10 мм. На месте введения живой культуры должен определяться некроз размером не менее 5 мм в диаметре (контроль чувствительности кроликов к коклюшному токсину).

2.10. Защитные свойства

КВ при однократном внутрибрюшинном введении мышам в дозе, содержащей 9

микробные   клетки   в   концентрации   0,75  х  10 ,  должна  обеспечивать
выживаемость  при  последующем заражении вирулентным штаммом B. pertussis N

18323 не менее 70% животных.

Суспензия мутностью 20 МЕ должна содержать не менее 10 международных защитных единиц (МЗЕ).

Примечание:

При использовании штаммов коклюшных бактерий только в производстве диагностических препаратов (сывороток, диагностикумов) защитные свойства не проверяют.

3. Требования к производственным штаммам паракоклюшных бактерий Bordetella parapertussis

3.1. Морфология

Паракоклюшные бактерии морфологически подобны коклюшным бактериям. Это неподвижные грамотрицательные мелкие палочки, располагающиеся в мазках отдельно или парами, иногда в виде коротких цепочек, без признаков диссоциации, размером от 0,6 до 2,0 мкм. Спор не образуют.

3.2. Культуральные свойства

Строгие аэробы, использующие, как и коклюшные бактерии, для своего роста аминокислоты. На среде Борде-Жангу на 1 — 2 сутки образуют колонии выпуклые с ровными краями серого цвета, блестящие, напоминающие капельки ртути, полупрозрачные диаметром до 1,2 мм, окруженные зоной гемолиза. На среде КУА колонии выпуклые с ровными краями серовато-кремового цвета диаметром до 1,5 мм.

Паракоклюшные бактерии менее прихотливы к питательным средам: могут расти на пептонном агаре. Оптимальная температура для роста — (35,5 +/- 1) °С.

3.3. Ферментативные свойства

Паракоклюшные бактерии продуцируют тирозиназу, вызывая побурение питательной среды, содержащей кровь, уреазу, вызывая расщепление мочевины; утилизируют цитраты; каталазоположительны; подщелачивают лакмусовое молоко за 1 — 4 дня. Паракоклюшные бактерии не разлагают углеводы, не разжижают желатин (табл. 1).

3.4. Серологические свойства

Сывороткой диагностической паракоклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) культуры должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) — не выше 1/10 титра.

3.5. Антигенная структура (серотипы)

Агглютиноген 7 является родовым признаком. Видовой признак B. parapertussis характеризуется присутствием агглютиногена 14. Разные штаммы паракоклюшных бактерий могут отличаться между собой по содержанию типовых агглютиногенов 8, 9, 10 (табл. 2).

3.6. Гемагглютинирующая и гемолитическая активность

Паракоклюшные бактерии при росте на среде Борде-Жангу вызывают гемолиз эритроцитов. При равных условиях культивирования паракоклюшная палочка в сравнении с коклюшной вызывает более сильный гемолиз.

Паракоклюшная суспензия мутностью 10 МЕ должна агглютинировать эритроциты человека 0 группы крови, куриные или гусиные эритроциты на 2 креста.

3.7. Дермонекротические свойства

При внутрикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 МЕ, должен выявляться геморрагический некроз размером от 0,5 до 1,5 см.

3.8. Вирулентность

    Проверяют    в    случае    разработки   паракоклюшной   вакцины.   При
интраназальном  заражении мышей  массой тела 12 - 14 г  LD   должна быть не

                                                      50

выше 200 млн. микробных клеток.

4. Требования к производственным штаммам бронхисептикозных бактерий Bordetella bronchiseptica

Штаммы бронхисептикозных бактерий используют при производстве сывороток диагностических коклюшных к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшных к агглютиногену 14, адсорбированных, для реакции агглютинации (РА), сухих.

4.1. Морфология

Строгие аэробы, требующие, как и коклюшные бактерии, для роста аминокислоты. Бронхисептикозные бактерии — подвижные (обладают жгутиками) грамотрицательные мелкие палочки, по размерам неотличимы от коклюшного микроба, располагающиеся в мазках отдельно или в виде короткой цепочки. Спор не образуют.

4.2. Культуральные свойства

На среде Борде-Жангу через 24 — 48 ч образуют колонии мелкие диаметром до 1 мм круглые с ровными краями при первичном посеве неотличимы от колоний коклюшного микроба, окружены зоной гемолиза. На среде КУА через 24 ч образуют колонии до 1,2 мм серые круглые с ровными краями, микроб растет в виде очень мелких выпуклых колоний серого цвета. Культура может расти на пептонном агаре, на 5% желчи. Оптимальная температура для роста — (35,5 +/- 1) °С.

4.3. Ферментативные свойства

Бронхисептикозные бактерии не разлагают углеводы, не разжижают желатин, подщелачивают лакмусовое молоко за 1 — 4 дня; продуцируют каталазу, уреазу, оксидазу; восстанавливают нитраты в нитриты, утилизируют цитраты.

4.4. Серологические свойства

Бронхисептикозной сывороткой (титр не ниже 1:16000) должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, коклюшной или паракоклюшной сывороткой (титр не ниже 1:16000) — не выше 1/10 титра.

4.5. Антигенная структура (серотипы)

Родовой признак — наличие агглютиногена 7, видовой признак — агглютиногена 12. Разные штаммы бронхисептикозных бактерий могут отличаться между собой по содержанию типовых агглютиногенов 8, 9, 10, 11, 13 (табл. 2).

4.6. Гемолизирующая активность

Единичные колонии культур 2 — 3 пассажа на 1 — 2 сутки роста в тонком слое (1,5 — 2,0 мм) среды Борде-Жангу должны быть окружены зоной гемолиза.

4.7. Дермонекротические свойства

При внутрикожном введении кроликам 0,2 мл взвеси, содержащей живую культуру мутностью 1 МЕ, должен образоваться геморрагический некроз размером от 0,5 до 2,0 см в диаметре, у морских свинок — от 0,3 до 1,0 см.

4.8. Вирулентность

Для изготовления диагностических препаратов не определяют.

Характеристика штаммов Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica приведена в табл. 1 и 2 <*>.

<*> Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, v. 1.

5. Хранение штаммов

Производственные штаммы, аттестованные во ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича, хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 +/- 3) °С. На этикетке каждой ампулы должно быть указано: наименование (род, вид), номер штамма или особое название штамма, дата и порядковый номер лиофилизации (высушивания). Продолжительность хранения высушенных штаммов не должна превышать 10 лет. Ежегодно перед использованием в производстве штаммы должны быть проверены по всем требуемым показателям. Протоколы их контроля должны быть представлены в ГИСК им. Л.А. Тарасевича в установленный срок и храниться в специализированной лаборатории.

Свежевыделенные и производственные штаммы рекомендуется высушивать на стерильном обезжиренном молоке или растворе, содержащем 10% сахарозы и 1% желатина в воде (сахарозо-желатиновая среда — СЖ). Свежевыделенные штаммы должны быть высушены в пределах 3-х месяцев от момента выделения (5 — 6 пересевов) после проверки всех основных свойств, указанных в разделе 1.

Производственные штаммы рекомендуется высушивать из 3 — 4 пересева после восстановления их из лиофильно высушенного состояния. В асептических условиях ампулу с сухой культурой обрабатывают 96%-м спиртом этиловым, протирают сухой стерильной безворсовой тканью, вскрывают под защитой пламени спиртовки и стерильной пипеткой вносят в нее 0,2 — 0,3 мл 0,9%-го стерильного раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2. Полученную взвесь в объеме по 0,1 мл переносят в чашки Петри со средой Борде-Жангу с 30% крови. Пастеровской пипеткой с запаянным концом культуру в чашках Петри штрихом рассевают по поверхности среды для получения отдельных колоний. Для синхронизации роста культуры засеянные чашки Петри выдерживают от 18 до 20 ч при температуре (5 +/- 3) °С. Затем чашки помещают в термостат при (35,5 +/- 0,5) °С. Для создания влажной атмосферы в термостат помещают открытую емкость со стерильной дистиллированной водой. Через 48 — 72 ч под микроскопом-лупой (окуляр 8) проверяют морфологию выросшей культуры. Если более 80% выросших колоний соответствуют требованиям типичных колоний (мелкие, круглые, гладкие, выпуклые, почти прозрачные, дающие под микроскопом при боковом освещении острый лучик), то отбирают 10 — 15 таких колоний. Отобранные колонии засевают на пробирки со средой Борде-Жангу с 30% крови. Пробирки с культурой помещают в термостат при температуре (35,5 +/- 0,5) °С. Через 40 — 48 ч из выросшей культуры готовят мазки, которые окрашивают по Граму. Отконтролированную по морфологии и бактериоскопической чистоте коклюшную культуру пересевают на 15 — 20 пробирок со средой Борде-Жангу с 30% крови и инкубируют 24 — 36 ч при температуре (35,5 +/- 0,5) °С и повышенном содержании влаги. После очередной проверки культуры на чистоту и морфологическую однородность чистую типичную культуру с поверхности питательной среды снимают запаянной пастеровской пипеткой и переносят на стенку пробирки со средой СЖ. Культуру при помощи той же запаянной пастеровской пипетки растирают на стенке пробирки, постепенно смывая средой СЖ, суспендируют пастеровской пипеткой. Пробирку со смытой культурой помещают в емкость с водой, в которой находятся куски льда. Полученную микробную взвесь из пробирок объединяют в стерильную колбу вместимостью 0,1 л, перемешивают пастеровской пипеткой и колбу помещают в емкость с водой и льдом. Определяют мутность приготовленной суспензии и не позднее чем через 1 ч после начала смыва суспензию (не менее 30 МЕ/мл) из колбы стерильной пастеровской пипеткой разливают по 0,2 — 0,25 мл в подготовленные стерильные вакуумные ампулы. Стерильность микробной суспензии проверяют до и после розлива путем высева 0,5 — 1,0 мл на тиогликолевую среду.

Если требованиям типичных колоний соответствуют менее 80% выросших колоний, то необходимо дополнительно провести селекцию штамма. С этой целью необходимо под микроскопом-лупой отобрать 10 — 15 типичных колоний. Каждую колонию засеять штрихом на чашки Петри со средой Борде-Жангу с 30% крови (5 — 6 колоний на 1 чашку). Чашки с культурой поместить в термостат при температуре (35,5 +/- 0,5) °С на 18 — 24 ч. Через 18 — 24 ч определить активность выросшей культуры в реакции агглютинации на стекле с адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3. Для дальнейшего исследования отбирают культуру, которая дает агглютинацию на стекле на 3 креста. Отобранную культуру пересевают на среду БЖ с 30% крови или КУА с 5% крови, затем ее проверяют в развернутой реакции агглютинации с агглютинирующей сывороткой к агглютиногенам 1, 2, 3. Культура, агглютинирующаяся типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 в разведении 1:1280 и выше, используется для лиофильной сушки, как указано выше. Если культура агглютинируется сывороткой в более низких разведениях, то процедуру селекции необходимо повторить.

Разлитую партию ампул замораживают и высушивают одновременно. В журнале лиофилизации штаммов Bordetella pertussis регистрируют: название культуры, номер штамма или его особое название, количество разлитых ампул, дату розлива, дату замораживания, дату лиофилизации, дату отпайки, количество разлитых ампул, количество лиофилизированных ампул, количество забракованных ампул с высушенной культурой, фамилии и подписи исполнителей и ответственного лица. Качество запайки и наличие вакуума в ампулах проверяют на аппарате д'Арсонваля или Тесла. Остаточная влажность лиофилизата не должна превышать 3%.

Каждую серию лиофилизированной культуры проверяют на выживаемость, отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, затем по всем иммунобиологическим свойствам, указанным в разделе 1. Для контроля используют коклюшную культуру 2 — 3 пассажа. Результаты контроля фиксируют в журнале проверки штаммов. Лиофилизированную культуру регистрируют в инвентарном журнале коллекционных штаммов Bordetella pertussis.

Примечание:

1-ый пассаж — культура, выращенная при посеве из ампулы.

Журналы, в которых производят регистрацию штаммов до и после высушивания, а также фиксируют данные контроля их биологических свойств, должны быть прошнурованы и скреплены печатью. Копии протоколов контроля штаммов следует ежегодно направлять в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

За состояние штаммов несет ответственность производственная лаборатория.

Использование ампул с культурой данного номера лиофилизации для производственных целей допускается только после окончательной проверки ее по всем свойствам.

После восстановления культуру поддерживают пересевом каждые 7 — 10 дней на пробирках со средой Борде-Жангу с 30% крови или КУА с 5% крови. На питательных средах культуру хранят при температуре (5 +/- 3) °С не более 10 дней. Для производственных посевов используют не более 3 — 4 пересевов с момента восстановления культуры из высушенного состояния.

Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов регламентируется действующими нормативными документами.

6. Методы контроля производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий

6.1. Морфологические и культуральные свойства

Для определения морфологических и культуральных свойств производят высев культур штрихом для получения изолированных колоний на чашки Петри со средой КУА, содержащей 5% крови, или Борде-Жангу, содержащей 30% крови. Параллельно сеют на чашки Петри с данными средами, разлитыми тонким слоем (1,5 — 2,0 мм), для оценки гемолитических свойств штаммов.

Засеянную культуру на среде Борде-Жангу или КУА инкубируют в термостате при температуре (35,5 +/- 0,5) °С при повышенном содержании влаги. Рост культуры просматривают через 48 — 72 ч (B. pertussis) или через 24 — 48 ч (B. parapertussis и B. bronchiseptica). Проверяют морфологию колоний под микроскопом-лупой МБС. Для дальнейшей работы следует отбирать мелкие круглые выпуклые почти прозрачные колонии, отражающие при косом освещении острый лучик света. Контроль морфологии культуры проводят путем микроскопирования препаратов, окрашенных по Граму.

6.2. Серологические свойства

6.2.1 Развернутая реакция агглютинации

Для серологической оценки коклюшной и паракоклюшной культур используют сыворотки производства Государственного учреждения НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (филиал «Медгамал» ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН): сыворотка диагностическая коклюшная поливалентная для реакции агглютинации (РА), сухая; сыворотка диагностическая паракоклюшная поливалентная для реакции агглютинации (РА), сухая; сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшные к агглютиногену 14, адсорбированные, для реакции агглютинации (РА), сухие или другие, аналогичные вышеуказанным.

Сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) коклюшные культуры должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, сывороткой диагностической паракоклюшной (титр не ниже 1:16000) — не выше 1/10 титра.

Сывороткой диагностической паракоклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) паракоклюшные культуры должны агглютинироваться не ниже 3/4 титра, сывороткой диагностической коклюшной поливалентной (титр не ниже 1:16000) — не выше 1/10 титра.

Реакцию агглютинации проводят с культурой 2 — 3 пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу или КУА в течение 48 ч (коклюшная), 24 ч (паракоклюшная и бронхисептикозная). Со среды Борде-Жангу культуру снимают платиновой или стеклянной петлей, сделанной из пастеровской пипетки, со среды КУА смывают небольшим количеством 0,9%-го раствора натрия хлорида и суспендируют в 0,9%-м растворе натрия хлорида. Взвесь должна быть гомогенной (зернистость указывает на диссоциацию штамма). Мутность взвеси доводят до 10 МЕ.

В 2 ампулы с сухим препаратом сыворотки диагностической коклюшной поливалентной или сыворотки диагностической паракоклюшной поливалентной вносят в каждую по 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2. Содержимое ампул аккуратно перемешивают пастеровской пипеткой до полного растворения сыворотки и объединяют. В результате получают 2 мл цельной сыворотки (пробирка № 1). Из пробирки № 1 отбирают 1 мл сыворотки, добавляют 4 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2, получают разведение 1:5 (пробирка № 2); к 1 мл сыворотки с разведением 1:5 добавляют 9 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 для получения разведения 1:50 (пробирка № 3); из пробирки № 3 отбирают 1 мл сыворотки, добавляют к нему 9 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 — в результате получают разведение 1:500 (пробирка № 4). Для постановки развернутой РА готовят двукратные разведения сыворотки от 1:500 до 1:128000.

В ряд пробирок, за исключением первой, наливают по 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2. Затем в первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл разведения сыворотки 1:500. После тщательного перемешивания содержимого второй пробирки 0,5 мл полученного разведения 1:1000 переносят в третью, где получают разведение 1:2000, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки ряда, содержащей предельное разведение сыворотки, 0,5 мл жидкости удаляют для сохранения общего объема.

В ряд агглютинационных пробирок, содержащих по 0,5 мл различных разведений сыворотки, вносят микробную взвесь в равном объеме с концентрацией 10 млрд. м.кл/мл. Одновременно проводят контроль сыворотки и микробной взвеси в тех же объемах на отсутствие спонтанной агглютинации: сыворотка в разведении 1:50 с 0,9%-м раствором натрия хлорида, pH 7,1 +/- 0,2; микробная взвесь с 0,9%-м раствором натрия хлорида. Смесь хорошо встряхивают и помещают в термостат на 2 ч при (37 +/- 1) °С, а затем оставляют до следующего дня при комнатной температуре (20 +/- 2) °С. Результаты реакции агглютинации через 20 — 24 ч учитывают визуально до встряхивания пробирок, а затем для более точного учета — в агглютиноскопе при осторожном встряхивании осадка путем медленного наклона пробирки. При положительной реакции осадок покрывает все дно пробирки в виде зонтика. Титр — последнее удвоенное разведение сыворотки, дающее агглютинацию на 3+, выраженное обратной величиной.

Учет реакции:

++++ — полная агглютинация — большой плотный осадок, четко виден зонтик, полное просветление надосадочной жидкости, после легкого встряхивания — крупные хлопья в прозрачной надосадочной жидкости;

+++ — осадок большой, рыхлый, надосадочная жидкость еще прозрачна, слегка опалесцирует, после легкого встряхивания — средние хлопья в слегка опалесцируюшей надосадочной жидкости;

++ — мелкие, нестойкие хлопья, осадок небольшой, рыхлый, надосадочная жидкость непрозрачна, после легкого встряхивания — мелкие, нестойкие хлопья;

+ — следы агглютинации — в центре небольшой осадок, надосадочная жидкость непрозрачная;

• - отрицательная реакция — осадка нет или небольшой компактный осадок в центре дна пробирки, взвесь равномерно мутная.

Оценка контрольных реакций:

• сыворотка должна быть прозрачной, без осадка;
• микробная суспензия с 0,9%-м раствором натрия хлорида — осадка нет или небольшой компактный осадок в центре дна пробирки, взвесь равномерно мутная.

6.2.2 Реакция агглютинации на стекле

Для дифференциальной диагностики видов рода Bordetella могут быть использованы гипериммунные сыворотки. Гипериммунные сыворотки с титром 1:16000 разводят до 1:200, с титром 1:32000 — 1:400. Около капли сыворотки размещают культуру, которую растирают до гомогенного состояния. Реакция агглютинации на стекле является ориентировочным показателем, после которого, при необходимости, проводят развернутую реакцию агглютинации.

Для определения серотипового состава культуры используют сыворотки диагностические коклюшные к агглютиногенам 1, 2, 3 и паракоклюшные к агглютиногену 14, адсорбированные, для реакции агглютинации (РА), сухие.

В ампулу с сухими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 добавляют 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 для получения разведения 1:10 (с учетом исходного разведения сыворотки при адсорбции в 5 раз). В ампулу с сухой адсорбированной типоспецифической сывороткой к паракоклюшному агглютиногену 14 добавляют 0,1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 для получения разведения сыворотки 1:10 (с учетом исходного разведения сыворотки при адсорбции в 10 раз). Содержимое ампулы несколько раз перемешивают пипеткой до однородного состояния и для постановки РА на предметном стекле переносят 0,5 мл сыворотки в пробирку, содержащую 0,75 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2, для получения разведения 1:25. Далее сыворотку разводят тем же раствором двукратно до 1:200 — 1:400.

На обезжиренное предметное стекло в каплю разведенной сыворотки вносят 2-суточную культуру мутностью 50 МЕ. Капли на стекле соединяют путем легкого покачивания, которое продолжают до окончания наблюдения.

Контролем служит капля взвеси штамма, внесенная в каплю 0,9%-го раствора натрия хлорида.

Учет реакции визуально:

+++ — быстрое образование больших хлопьев, полное завершение агглютинации в пределах 3-х мин.;

++ — полное завершение агглютинации в течение 5 мин.;

+ — медленное образование мелких хлопьев, неполное завершение агглютинации в течение 5 мин.;

• - отсутствие агглютинации в течение 5 мин.

Микробная суспензия с 0,9%-м раствором натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 не должна давать агглютинации.

Все штаммы, давшие отрицательные результаты, считаются условно не содержащими агглютиногены.

6.2.3. Развернутая реакция агглютинации с сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба в пробирках

Коклюшные культуры должны агглютинироваться соответствующими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 не ниже 1:1280.

В ампулу с сухими адсорбированными типоспецифическими сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 добавляют 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 для получения разведения 1:10 (с учетом исходного разведения сыворотки при адсорбции в 5 раз). В ампулу с сухой адсорбированной типоспецифической сывороткой к паракоклюшному агглютиногену 14 добавляют 0,1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2 для получения разведения сыворотки 1:10 (с учетом исходного разведения сыворотки при адсорбции в 10 раз). Содержимое ампулы несколько раз перемешивают пипеткой до однородного состояния.

Для постановки развернутой РА готовят двукратные разведения сыворотки от 1:10 до 1:5120 на 0,9%-м растворе натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2.

В ряд пробирок, за исключением первой, наливают 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2. Затем в первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл разведения сыворотки 1:10. После тщательного перемешивания содержимого второй пробирки 0,5 мл полученного разведения 1:20 переносят в третью, где получают разведение 1:40, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки ряда, содержащей предельное разведение сыворотки, 0,5 мл жидкости удаляют для сохранения общего объема.

В ряд агглютинационных пробирок с двукратными разведениями сыворотки в объеме 0,5 мл вносят равный объем микробной взвеси с мутностью 10 МЕ. Одновременно проводят контроль сыворотки и антигена в тех же объемах на отсутствие спонтанной агглютинации:

• сыворотка в разведении 1:10 с 0,9%-м раствором натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2;
• микробная взвесь с 0,9%-м раствором натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2.

Содержимое пробирок перемешивают путем встряхивания штатива. Затем штатив помещают на 2 ч в термостат при температуре (36 +/- 1) °С, после чего оставляют на 18 — 20 ч при температуре от (5 +/- 3) °С.

Результаты реакции агглютинации учитывают визуально до встряхивания пробирок, а затем для более точного учета — в агглютиноскопе при осторожном встряхивании осадка путем медленного наклона пробирки.

Учет реакции:

++++ — полная агглютинация — большой плотный осадок, четко виден зонтик, полное просветление надосадочной жидкости, после легкого встряхивания — крупные хлопья в прозрачной надосадочной жидкости;

+++ — осадок большой рыхлый, надосадочная жидкость еще прозрачна, слегка опалесцирует, после легкого встряхивания — средние хлопья в слегка опалесцирующей надосадочной жидкости;

++ — мелкие нестойкие хлопья, осадок небольшой рыхлый, надосадочная жидкость непрозрачна, после легкого встряхивания — мелкие нестойкие хлопья;

+ — следы агглютинации — в центре небольшой осадок, надосадочная жидкость непрозрачная;

• - отрицательная реакция — осадка нет или небольшой компактный осадок в центре дна пробирки, взвесь равномерно мутная.

6.2.4. Развернутая реакция агглютинации с сыворотками к агглютиногенам 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 паракоклюшного микроба (макро- или микрометодом) в планшетах

Каждую сыворотку разводят двукратно 0,9%-м раствором натрия хлорида (pH 7,0 +/- 0,2), начиная с разведения 1:10 до 1:10240 — 1:20480. Разведения сывороток в объеме 0,1 — 0,2 мл или 0,025 — 0,05 мл вносят в полистироловые пластины и к ним добавляют равный объем коклюшной или паракоклюшной суспензии мутностью 10 МЕ или 20 МЕ микробных клеток в 1 мл. Пластины встряхивают в шуттель-аппарате в течение 5 мин. при комнатной температуре (20 +/- 2) °С, а затем выдерживают в течение 20 мин. в холодильнике при температуре (5 +/- 3) °С. При отсутствии шуттель-аппарата содержимое лунок перемешивают встряхиванием пластин (постукивая кончиками пальцев с разных сторон пластины) в течение 5 мин., а затем пластины помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °С на 2 — 2,5 ч. При необходимости пластины выдерживают дополнительно при комнатной температуре до получения четкой реакции в контрольных лунках.

Учет реакции в обоих случаях при отрицательном ответе в контрольных лунках проводят с помощью лупы МБС-I. Титр — последнее удвоенное разведение сыворотки, дающее агглютинацию на 2+, выраженное обратной величиной.

6.3. Определение гемагглютинирующей и гемолизирующей активности

Коклюшная и паракоклюшная суспензии мутностью 10 МЕ должны агглютинировать эритроциты человека 0 группы крови, куриные или гусиные эритроциты не менее чем на 2 креста.

6.3.1 Агглютинация эритроцитов

Суспензию готовят из 48-часовой культуры 2 или 3 пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу или КУА. Из суспензии мутностью 20 МЕ/мл делают двукратные разведения, которые в объеме 0,25 — 0,5 мл (макрометод) или 0,025 — 0,05 мл (микрометод) вносят в полистироловые пластины. Затем к ним добавляют равный объем 0,5% или 0,1 — 0,2% взвеси куриных, гусиных эритроцитов или эритроцитов человека 0 группы крови. Смесь встряхивают и оставляют на 2 — 2,5 ч при комнатной температуре (20 +/- 2) °С. В качестве контроля используют взвесь эритроцитов, добавленную к равному объему физиологического раствора. Титр — последнее разведение суспензии, которое агглютинирует эритроциты на 2+. В контрольных лунках не должно быть склеивания эритроцитов.

При отборе штамма для производства выбирают колонии, агглютинирующие эритроциты на 4 креста при предварительном испытании на стекле (1 капля 0,5% взвеси эритроцитов соединяют с 1 каплей микробной взвеси, приготовленной из посевов колоний на сектора).

6.3.2 Определение гемолизирующей активности

Единичные колонии культур 2 — 3 пассажа рода Bordetella на 1 — 2 сутки роста в тонком слое (1,5 — 2,0 мм) среды Борде-Жангу должны быть окружены зоной гемолиза.

Культуру 2 — 3 пассажа засевают штрихом на среду Борде-Жангу, содержащую 10 — 30% крови, разлитую тонким слоем на чашки Петри, инкубируют в термостате при температуре (36 +/- 0,5) °С в течение 48 — 72 ч (коклюшный микроб) или 24 ч (паракоклюшный и бронхисептикозный микроб). Гемолизирующую активность штаммов определяют ежедневно. При селекции единичных колоний необходимо отбирать колонии с зоной интенсивного гемолиза (1,5 — 2 мм) на 1 — 2-е сутки роста.

6.4. Определение дермонекротических свойств

Коклюшная и бронхисептикозная микробная суспензия, содержащая 1 МЕ в объеме 0,2 мл, должна вызывать у кроликов геморрагический некроз размером от 0,5 до 2 см в диаметре, у морских свинок — от 0,3 до 1,0 см, паракоклюшная микробная суспензия той же мутности у кроликов должна вызывать геморрагический некроз размером от 0,5 до 1,5 см.

48-часовую культуру коклюшного микроба или 24-часовую культуру паракоклюшного (бронхисептикозного) микроба 2-го или 3-го пассажа, выращенную на среде Борде-Жангу или КУА, смывают физиологическим раствором и разводят с таким расчетом, чтобы опытная доза содержалась в объеме 0,2 мл. Несколько разведений суспензии (не менее 3-х разведений мутностью: 2 МЕ, 1 МЕ, 0,5 МЕ) вводят внутрикожно двум белокожим кроликам породы шиншилла массой 1,5 — 2,5 кг или морским свинкам массой 300 — 400 г в объеме 0,2 мл. Результат учитывают через 48 — 96 ч. Коклюшная и бронхисептикозная микробная суспензия, содержащая 1 МЕ в объеме 0,2 мл, должна вызывать у кроликов геморрагический некроз размером от 0,5 до 2 см в диаметре, у морских свинок — от 0,3 до 1,0 см, паракоклюшная микробная суспензия той же мутности у кроликов должна вызывать геморрагический некроз размером от 0,5 до 2 см. Следует иметь в виду, что вследствие неодинаковой чувствительности некоторые кролики могут не давать характерной реакции. В таком случае опыт необходимо повторить на том же количестве животных.

6.5. Методика определения вирулентности при интраназальном заражении

    Коклюшная   культура   должна   быть   вирулентной   для   мышей:   при
интраназальном  заражении  ЛД    должна  быть  в  пределах  10  -  200 млн.

                         50

микробных  клеток,   а  при   внутримозговом  заражении - не  выше  25 млн.
микробных клеток;  для  паракоклюшной  культуры  LD   должна  быть  не выше

                                               50

200 млн. микробных клеток.

Суспензию готовят из 48-часовой коклюшной или 24-часовой паракоклюшной культуры 2 или 3 пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу или КУА. Из исходной суспензии делают несколько разведений (кратные 2 или 5), например: 200, 100, 50 и 25 млн., с таким расчетом, чтобы опытная доза содержалась в объеме 0,05 мл. Из каждого разведения суспензии заражают по 5 — 6 мышей. Заражение мышей производят под легким оглушающим наркозом. Для наркоза применяют смесь 2-х частей эфира (для наркоза) с одной частью хлороформа (для наркоза). В стеклянную банку на дно кладут вату, смоченную указанной смесью, и сверху накрывают слоем сухой ваты, затем в банку помещают мышь. Как только мышь после периода возбуждения засыпает и не реагирует на покачивание банки, ее вынимают из банки, и, держа в левой руке двумя пальцами за шейную складку, вводят суспензию в нос шприцем с тонкой иглой, поднесенной непосредственно к ноздре (сначала к одной, а затем к другой).

Примечание.

Здесь и далее для заражения мышей опытной дозой используют 0,5 или 1,0 мл шприцы с ценой деления 0,01 мл и абсолютной погрешностью измерения дозы +/- 0,005 мл.

    При   этом  дыхание  мыши  должно  быть  ровным,  тогда  суспензия  без
разбрызгивания  легко  втягивается  в  нос. Гибели мышей в период заражения
быть  не  должно.  После  заражения  за  мышами наблюдают в течение 14 сут.
Гибель  животных учитывают ежедневно. Мыши, погибшие в первые три дня после
заражения,  при  подсчете  ЛД    исключаются (неспецифическая гибель). Всех

                         50

погибших  мышей  вскрывают  для  определения  характерных  макроскопических
изменений  в  легких  (очаговое  или  полное  красное  опеченение  легких).
Специфическая   гибель  подтверждается  выделением  коклюшных  микробов  из
легких.  Для  посева  легкие растирают в стерильной баночке с бусами или со
стерильным  песком  и суспензию засевают на чашки со средой Борде-Жангу или
КУА.  Для  вычисления ЛД   применяют метод Кербера или метод пробит-анализа

                    50

(Прилож. 2).

6.6. Оценка остаточной токсичности коклюшной вакцины

Для оценки остаточной токсичности, лейкоцитозстимулирущей, гистамин-сенсибилизирующей и иммуногенной (защитной) активностей из каждого штамма готовят коклюшную вакцину (КВ). Культуру выращивают на среде КУА в течение 36 — 48 ч, смывают 0,9%-м раствором хлорида натрия, мутность взвеси доводят до 80 — 100 МЕ в 1 мл и добавляют формалин до концентрации 0,1%. Взвесь встряхивают в течение 20 — 25 мин. и оставляют при комнатной температуре (20 +/- 2) °С на 22 — 24 ч. Затем суспензию доводят до мутности 40 — 60 МЕ в 1 мл, после чего добавляют мертиолят до конечной концентрации (100 +/- 20) мкг в 1 мл. Суспензию встряхивают в течение 10 мин. и помещают в холодильник при температуре (5 +/- 3) °С. Через 7 сут. из суспензии берут пробы для контроля специфической стерильности (не должно быть роста на среде Борде-Жангу или КУА).

Токсические свойства формалинизированной коклюшной вакцины проверяют через 3 месяца после обезвреживания.

6.6.1 Оценка токсичности коклюшной вакцины в тесте изменения массы тела мышей

6.6.1.1 Подготовка к применению ОСО 42-28-89-01П и испытуемых КВ

Токсичность КВ, приготовленной из штамма, проверяют в сравнении с ОСО 42-28-89-01П коклюшной вакцины. Содержимое двух ампул ОСО растворяют в 6 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2. Для этого в каждую ампулу добавляют 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. После полного растворения таблетки (1 — 2 мин.) содержимое тщательно отбирают тонкой пастеровской пипеткой в небольшой флакон (10 мл). Затем в каждую ампулу снова (2 раза) вносят по 1 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида, тщательно отбирают той же пипеткой содержимое ампул и переносят в тот же флакон. Полученное рабочее разведение содержит в 1 мл 20 МЕ коклюшных бактерий.

Испытуемую КВ предварительно проверяют визуально по физическим свойствам и доводят ее мутность до 20 МЕ в 1 мл.

6.6.1.2 Условия и порядок применения

Для оценки токсичности коклюшной вакцины в тесте изменения массы тела мышей используют животных, равномерно прибавляющих массу тела в течение 3 — 4 сут. наблюдения. Ежесуточный прирост массы тела мышей должен быть от 0,5 до 1 г.

Группы из 10 белых мышей, где каждая особь имеет массу (15 +/- 1) г, должны иметь свободный доступ к воде и пище не менее чем за 2 ч до инъекции. Групповую массу тела мышей определяют непосредственно перед введением препарата. Каждой мыши вводят внутрибрюшинно испытуемую вакцину или ОСО 42-28-89-01П в объеме 0,5 мл (10 МЕ) шприцем вместимостью 1 мл с иглой № 0625-1. Контрольные животные получают внутрибрюшинно по 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2. За животными наблюдают в течение 7 сут. Групповую массу определяют через 72 ч и через 7 сут. после инъекции.

6.6.1.3 Оценка результатов

Рассчитывают абсолютный и относительный прирост массы тела мышей. Абсолютный прирост массы тела мышей — разница массы тела мышей на 7 сут. после введения препарата по сравнению с первоначальным (до введения). Относительный прирост массы тела мышей — отношение массы тела мышей, получивших вакцину, к массе тела контрольных животных или животных, получивших ОСО 42-28-89-01П, выраженное в процентах.

6.6.1.4 Критерии оценки

Вакцина может считаться безвредной, если:

а) через 72 ч групповая масса тела мышей не ниже их массы тела перед введением препарата;

б) через 7 сут. после введения препарата относительный прирост массы тела мышей, получивших испытуемую вакцину, составляет не менее 60% прироста массы тела контрольных мышей, и не менее абсолютного и относительного прироста массы тела мышей, получивших ОСО 42-28-89-01П;

в) относительный прирост массы тела мышей, получивших ОСО 42-28-89-01П, соответствует установленному показателю.

Если при проведении опыта одно из указанных условий нарушается, опыт повторяется на удвоенном количестве животных при тех же условиях учета опыта. Допускается гибель не более 5% от общего числа животных.

6.6.2 Оценка остаточного содержания термолабильного (дермонекротического) токсина

Определяют при подкожном введении испытуемых КВ в затылочную область мышей-сосунков или при внутрикожном введении белокожим кроликам породы шиншилла.

КВ, содержащая 1 МЕ в объеме 0,05 мл, не должна вызывать изменения кожных покровов у мышей-сосунков.

КВ, содержащая 4 МЕ в объеме 0,2 мл, не должна вызывать у кроликов некроза; допускается гиперемия диаметром не более 10 мм. На месте введения живой культуры — некроз размером 0,5 — 2 см в диаметре.

6.6.3 Оценка лейкоцитозстимулирующей активности

6.6.3.1 Подготовка к применению ОСО 42-28-89-01П и испытуемого препарата

Содержимое одной ампулы ОСО 42-28-89-01П растворяют в 3 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2 — рабочее разведение.

Мутность используемой коклюшной вакцины предварительно доводят до 20 МЕ в 1 мл.

6.6.3.2 Условия и порядок применения

Для оценки лейкоцитозстимулирующей активности в коклюшной вакцине, приготовленной из штамма, используют мышей массой (15 +/- 1) г. Оценку лейкоцитозстимулирующей активности проводят параллельно с ОСО 42-28-89-01П.

Формируют 3 группы животных по 10 мышей в каждой. Животным в 1 и во 2 группах вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл (10 МЕ в дозе) испытуемого препарата и ОСО 42-28-89-01П соответственно. Контрольным животным вводят по 0,5 мл апирогенного 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2.

6.6.3.3 Оценка результатов

Через 72 — 96 ч у опытных и контрольных животных берут кровь из хвостовой вены. Для лучшего счета лейкоцитов кровь разводят 3%-м раствором уксусной кислоты, подкрашенной 1%-м раствором генцианвиолета. Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева.

Вычисление количества лейкоцитов в 1 куб. мм крови проводят по формуле:

                               а 4000 y

Х = --------, б

где:
Х - число лейкоцитов в 1 куб. мм крови;
а - общее число клеток в "б" квадратах;
y - разведение крови.

Для сравнительной оценки лейкоцитозстимулирующей активности разных серий вакцин рассчитывают индекс ЛСА (лейкоцитозстимулирующей активности): отношение количества лейкоцитов опытных мышей к числу лейкоцитов животных, получивших ОСО 42-28-89-01П.

6.6.3.4 Критерии оценки

Опыт можно считать удовлетворяющим требованиям, если количество лейкоцитов контрольных животных находится в пределах нормы (от 5000 до 12000).

Вакцину следует считать слаботоксичной, если индекс ЛСА по отношению к ОСО 42-28-89-01П составляет 0,5 и меньше; средней токсичности, если индекс ЛСА находится в пределах от 0,5 до 1,0; с выраженной токсичностью, если индекс ЛСА более 1,0.

Для производства коклюшного компонента комплексных вакцин используют штаммы со слабой и средней токсичностью.

6.6.4 Оценка гистаминсенсибилизирующей активности

Определение гистаминсенсибилизирующей активности штаммов проводят параллельно с ОСО 42-28-87-02П.

6.6.4.1 Подготовка к применению ОСО 42-28-87-02П и коклюшной вакцины

Во флакон с ОСО, содержащим лиофилизированные коклюшные бактерии, эквивалентные 150 МЕ, добавляют 7,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2. Мутность коклюшной вакцины, приготовленной из штамма, доводят до 20 МЕ в 1 мл.

Определение гистаминсенсибилизирующей дозы (ГСД) штаммов проводят параллельно с ОСО 42-28-87-02П. В опыте используют мышей-самок или поровну животных обоего пола тех линий, которые чувствительны к коклюшному токсину. На каждый препарат берут три группы мышей (по 10 — 20 мышей в каждой) массой 14 — 16 г.

Для определения ГСД ОСО 42-28-87-02П вакцины каждой группе животных 50

вводят  однократно  внутрибрюшинно  по  0,5  мл  препарата соответствующего
пятикратного  разведения  препарата  (при испытании на беспородных животных

первое разведение должно содержать 20 или 10 МЕ в объеме 0,5 мл).

Контрольным животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2. Через 4 — 5 дней опытным и контрольным животным вводят внутрибрюшинно по 2 мг гистамина дигидрохлорида, разведенного так, чтобы опытная доза содержалась в 0,5 мл.

6.6.4.2 Оценка результатов

Гибель мышей учитывают через 2 и 24 ч. ГСД рассчитывают по методу 50 Кербера (Прилож. 2). Животные, получившие 0,9%-й раствор натрия хлорида, должны остаться живыми.

Для проведения сравнительного анализа штаммов по гистаминсенсибилизирующим свойствам рассчитывают индекс ГСА:

                                ГСД
                                   50В

                             И    = --------,
                              ГСА   ГСД

                                   50ОСО

где:
ГСД     -  доза  вакцины,  при  которой  погибло  50%  иммунизированных
   50В

животных после введения гистамина; ГСД — доза ОСО 42-28-87-02П, при которой погибло 50% 50ОСО иммунизированных животных после введения гистамина.

6.6.4.3 Критерии оценки

КВ следует считать слаботоксичной, если индекс ГСА по отношению к ОСО 42-28-87-02П будет равен 0,5 или меньше; среднетоксичной, если индекс ГСА будет находиться в пределах от 0,5 до 1,0; и с выраженными гистаминсенсибилизирующими свойствами, если индекс ГСА будет 1,0 и более.

Для производства коклюшного компонента комплексных вакцин используют штаммы со слабой и средней токсичностью.

6.7. Методика определения защитных свойств штаммов коклюшных бактерий

Защитные свойства вакцин определяют по количеству международных защитных единиц (МЗЕ). Для получения ориентировочной информации о специфической защитной активности штамма используют метод оценки по выживаемости зараженных животных. В частности, этот метод используют при изучении свежевыделенных штаммов.

В испытании необходимо использовать те линии животных, которые способны давать адекватный иммунный ответ (например, популяцию скрещенных линий F1 (C57BL/6Jx СВА).

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайным должно быть и расположение клеток на полках, порядок иммунизации и порядок введения разрешающей дозы.

    В  опыт  берут  здоровых  мышей одного штамма и одного пола или поровну
каждого  пола  во  всех  группах  массой 10 - 12 г. Одновременно из этой же
партии  оставляют  40  мышей для титрования ЛД   культуры, используемой для

                                          50

заражения вакцинированных мышей. Перед иммунизацией за ними наблюдают 3 — 4 сут. При гибели более 10% животных всю партию мышей бракуют.

    Коклюшная  вакцина,  приготовленная  из каждого штамма, при однократном
внутрибрюшинном  введении  мышам  в  дозе,  содержащей  микробные  клетки в

                     9

концентрации  0,75  х  10 ,  при  заражении животных вирулентным штаммом B.
pertussis N 18323 должна  обеспечивать выживаемость не менее 70%. Суспензия
мутностью  20 МЕ должна содержать не менее 10 международных защитных единиц

(МЗЕ).

6.7.1 Определение защитных свойств по выживаемости

Испытуемую вакцину разводят 0,9%-м раствором натрия хлорида до мутности 15 МЕ микробных клеток в 1 мл (по расчету, исходя из обозначенного количества микробных клеток), а затем еще в 10 раз.

Пример: 1 разведение — 0,9 мл 20 МЕ/мл вакцины + 0,3 мл физиологического раствора = 1,2 мл (15 МЕ/мл), 2 разведение (рабочее) — 1 мл вакцины + 9 мл физиологического раствора = 10 мл (1,5 МЕ/мл), т.е. 0,5 мл содержит 0,750 МЕ.

Приготовленным разведением вакцины 0,750 МЕ в 0,5 мл внутрибрюшинно однократно иммунизируют 20 мышей.

Если гибель мышей в период между вакцинацией и заражением превышает 10% от общего числа взятых в опыт животных, опыт не подлежит учету.

Спустя 14 — 17 сут. после иммунизации мышей заражают интрацеребрально культурой B. pertussis № 18323. По морфологическим, культуральным, агглютинабельным, дермонекротическим и вирулентным свойствам этот штамм должен соответствовать всем требованиям, изложенным в разделе 1.

Для сохранения постоянства вирулентности заражающего штамма его хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5 +/- 3) °С. Для заражения штамм восстанавливают из высушенного состояния и используют только 2 или 3 пассаж. Суспензию для заражения готовят из 20 — 24-часовой культуры (которая была засеяна из быстрорастущей культуры возрастом не более 30 ч), выращенной при температуре (36,0 +/- 0,5) °С на свежей среде Борде-Жангу или КУА с добавлением 10% крови (срок хранения крови не более 2 сут.). Продолжительность работы со взвесью не должна превышать 2,5 ч с момента смыва культуры. При разведении и в процессе заражения взвесь необходимо хранить на льду.

Микробную массу снимают со среды стеклянной петлей, проверяют на морфологию (мазок, окрашенный по Граму) и суспендируют в 0,9%-м растворе натрия хлорида, для чего стенку стандартной пробирки смачивают 0,9%-м раствором натрия хлорида. Затем стеклянной петлей снимают небольшое количество культуры и тщательно растирают на смоченном участке пробирки до гомогенной массы. Культуру, осторожно смачивая содержимым пробирки, смывают со стенки. Операцию повторяют до получения мутности взвеси, равной 10 МЕ в 1 мл. Полученная суспензия должна быть гомогенной. В случае обнаружения комочков культуры суспензию фильтруют через стерильную вату, помещенную в пробирку с культурой, и доводят ее мутность до 10 МЕ в 1 мл. Все дальнейшие разведения делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% натрия хлорида pH 7,1 +/- 0,2. Каждую серию гидролизата казеина предварительно проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 дней.

    Микробную  суспензию  мутностью  10 МЕ микробных тел в 1 мл (разведение
А в табл. 3)  разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу,
содержащую  100000  микробных клеток (рабочая суспензия), в объеме 0,03 мл.
Из  рабочей  суспензии  делают  разведения  1/10,  1/50, 1/250 и 1/1250 для
определения ЛД   штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии.

          50

Из 8 пробирки сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки со свежеприготовленной средой Борде-Жангу (без конденсата) или с КУА с кровью. Растирают культуру стерильным шпателем и помещают в термостат с температурой (36,0 +/- 0,5) °С.

    Культуру  в  биксе  (пробирки  N  4, 5, 6, 7, 8) переносят в виварий. В
течение  всего  периода  заражения  культура  должна  находиться в холодной
водяной  бане (вода со льдом). Каждой мыши вводят без наркоза в объеме 0,03
мл   рабочей   суспензии   (пробирка   N   4)   в  височно-теменную область
туберкулиновым  шприцем  с  тонкой  острой иглой (N 27) с коротким срезом и
муфтой.  Длина  свободного  конца иглы от края муфты до начала среза должна
быть  3  мм.  Для  определения  величины  LD    разведения  заражающей дозы

                                        50

(пробирки № 5, 6, 7, 8) также интрацеребрально вводят контрольным мышам.

За зараженными мышами наблюдают 14 дней с ежедневной регистрацией их гибели в опытной и контрольной группах. Мышей, погибших в течение 72 ч после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель).

В день учета результатов в число погибших включают также всех явно парализованных мышей.

Вычисление ЛД культуры производят по методу Кербера (Прилож. 2) или 50 используя пробит-анализ. 1 LD не должна превышать 1000 микробных клеток. 50 5

    Заражающая  доза  10   микробных  клеток  должна содержать не менее 100
LD  .

50

    Штамм   считают   пригодным  для  дальнейшего  изучения,  если  вакцина
обеспечивает  выживаемость  более  70%  мышей при заражении их не менее 100
ЛД   вирулентной коклюшной культурой.

50

3 чашки с культурой, высеянной из пробирки № 8, находятся в термостате 3 — 4 сут. После подсчета колоний на 3-х чашках полученное число делят на 10. В 0,03 мл этого разведения должно быть не менее 10 и не более 50 колониеобразущих единиц.

6.7.2 Определение количества международных защитных единиц (МЗЕ)

Количество МЗЕ в суспензии определяют по результатам опытов на мышах, одновременно поставленных с испытуемой вакциной, и ОСО иммуногенности коклюшной вакцины, откалиброванному по Международному стандарту коклюшной вакцины (ОСО 42-28-89-01П).

При проверке защитных свойств штаммов с определением международных защитных единиц (МЗЕ) вакцина мутностью 20 МЕ в 1 мл должна содержать не менее 10 МЗЕ.

Для каждой вакцины берут три группы по 18 — 20 здоровых мышей (масса тела (11 +/- 1) г) одной линии (например, F1 (C57BL/6J х СВА) и одного пола или в равных количествах каждого пола во всех группах. Одновременно для контроля заражающей суспензии берут четыре группы по 10 мышей.

6.7.2.1 Разведение вакцин

В стерильных условиях делают три пятикратных разведения испытуемой вакцины и ОСО 42-28-89-01П на 0,9%-м растворе натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2

так,   чтобы  вводимая  иммунизирующая  доза  содержалась  в  0,5  мл.  Все
разведения  испытуемой  вакцины должны иметь такое же количество МЗЕ, что и
соответствующие  разведения  стандартной  вакцины.  С  этой  целью  вакцину
разводят   в   10,  12  или  14  раз  для  того,  чтобы  в  одной  вводимой
иммунизирующей  дозе содержалось 0,5 МЗЕ. При этом ЕД   вакцины должна быть

                                                 50

в пределах избранных разведений.

6.7.2.2 Подготовка к применению ОСО 42-28-89-01П

Одна ампула ОСО содержит 30 МЗЕ. Содержимое ампулы с ОСО растворяют в 30 мл стерильного 0,9%-го раствора натрия хлорида pH 7,0 +/- 0,2 из расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЗЕ (разведение 1). В ампулу с ОСО вначале вносят 2 мл растворителя. После того, как таблетка растворилась (1 — 2 мин.), тонкой пастеровской пипеткой тщательно отбирают содержимое в стерильный флакон (емкостью не менее 30 мл). Затем в ампулу повторно (2 — 3 раза) вносят по 2 мл растворителя той же пипеткой и тщательно отбирают содержимое ампулы той же пастеровской пипеткой в вышеуказанный флакон. Остальное количество растворителя добавляют во флакон до нужного объема (30 мл) пипеткой (разведение 1). Из первого разведения ОСО делают два последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 4).

ОСО в разведении 1:30 может быть использован в двух опытах, если интервал между опытами не превышает 1 месяц. Остаток разведенного ОСО хранят в холодильнике при температуре (5 +/- 3) °С.

6.7.2.3 Подготовка к применению испытуемого препарата

К 1 мл испытуемого препарата, содержащего 20 МЕ коклюшных бактерий, добавляют 13 мл физиологического раствора — разведение 1 (при разведении вакцины 1:14). Из разведения 1 делают два последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 5).

Если фактическое ЕД испытуемой вакцины будет больше избранной, то 50 необходимо изменить разведение 1: исходную вакцину развести в 10 или 8 раз. Два последующих разведения делать по вышеприведенной схеме.

6.7.2.4 Иммунизация и заражение животных

Трем группам мышей, предназначенных для иммунизации препаратом ОСО, внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл 1-го, 2-го и 3-го разведений ОСО соответственно.

Трем группам мышей, предназначенных для иммунизации испытуемым препаратом КВ, также внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл 1-го, 2-го и 3-го разведений КВ соответственно.

Заражение проводят по методике, описанной в п. 6.7.1.

6.7.2.5 Оценка результатов

Величину ЕД ОСО иммуногенности и испытуемого препарата определяют по 50 методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США для п = 16 (Прилож. 4). В таблице по вертикальной оси слева

находят  величину,  выражающую  сумму  выживших  мышей  от  всех  трех  доз
препарата  (А),  по  горизонтальной  -  величину,  выражающую разницу между
числом  мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыте (В).
В  месте  пересечения прямых, проведенных от соответствующих величин А и В,
находят  ЕД    (верхняя  цифра)  и  ее стандартные отклонения, выраженные в

       50

процентах (нижние цифры). Это величина ЕД для средней иммунизирующей 50 дозы, равной 100 мл. Для определения величины ЕД в опыте найденную в 50 таблице ЕД разделить на 100 и умножить на среднюю иммунизирующую дозу в 50 данном конкретном опыте. Результаты опыта можно считать достоверными, если стандартные отклонения будут не ниже 64% и не выше 157%.

                         71,3 х 0,0033

                   ЕД      = ------------- = 0,00235 мл,
                     50ОСО        100

                          0,00235 х 139

                  ЕД        = ------------- = 0,00327 мл,
                    50макс.       100

                         0,00235 х 72

                  ЕД       = ------------ = 0,00169 мл,
                    50мин.       100

                         111,75 х 0,0071

                 ЕД        = --------------- = 0,00793 мл,
                   50вакц.         100

                           0,00793 х 139

                   ЕД        = ------------- = 0,011 мл,
                     50макс.        100

                          0,00793 х 72

                   ЕД       = ------------ = 0,0057 мл.
                     50мин.       100

Количество МЗЕ в 1 мл вакцины определяется по формуле:

            ЕД

                  50ОСО                    0,00235
           Х = --------- х 30    МЗЕ ОСО = ------- х 30 = 8,9 МЗЕ
               ЕД                          0,00793

             50вакц.

Доверительный интервал МЗЕ в 1 мл препарата рассчитывают по формуле:

R = R / К, мин./макс.

где:
R - количество МЗЕ в 1 мл препарата;
К - доверительный коэффициент.

                                     ______

                                        /2    2
                          К = анти lg \/S  + S ,
                                         1    2

где:

    S  = (lg ЕД  )      - lg ЕД   - для более иммуногенного  препарата  при
     1         50 макс.        50

избранном уровне существенности различия — 95 или 99%;

    S  = lg ЕД   - (lg ЕД  )     - для менее иммуногенного препарата.
     2        50         50 мин.

Для нашего примера:

                 ______________________________________________

                    /                    2                        2
      К = анти lg \/[-2,4855 - (-2,6289)]  + [-2,1007 - (-2,2441)]  =

                  _______________             ______

  = анти lg \/0,0206 + 0,0206 = анти lg \/0,0412 = анти lg 0,203;

К = 1,6

Отсюда:

R = R / К; т.е. 8,9 МЗЕ / 1,6 = 5,6 МЗЕ, мин.

R = R х К; т.е. 8,9 МЗЕ х 1,6 = 14,2 МЗЕ мин.

Таким образом, в 1 мл КС серии Х содержится 8,9 МЗЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,2 МЗЕ.

6.7.2.6 Критерии оценки активности

Коклюшная вакцина (20 МОЕ/мл) будет считаться отвечающей требованиям, если в прививочной дозе (0,5 мл) будет содержаться не менее 5 МЗЕ.

    Если  в  первом  опыте  вакцина не будет соответствовать требованиям по
активности,  опыт  повторяют.  Если  опыт  повторяют  2  -  3  раза, то при
вычислении  количества  МЗЕ  в  препарате  необходимо учитывать данные всех
опытов. При этом учету подлежат только те опыты, в которых отклонения ЕД  ,

                                                                    50

выраженные в процентах, находятся в пределах от 64 до 157%.

Пример расчета средней величины МЗЕ в 1 мл препарата:

Иммуногенность коклюшного компонента в АКДС вакцине серии У определили в двух опытах. В первом опыте в 1 мл препарата было определено 6 МЗЕ, во втором опыте — 10,8 МЗЕ.

1-й метод расчета:

                                   n __

Хгеом. = /Пх,

где:
Пх - произведение осредняемых величин;
n - число единичных определений.

                             ________

Хгеом. = /6 х 10,8 = 8,05 МЗЕ,

2-й метод расчета:

              lg 6 + lg 10,8   0,7782 + 1,0334

Х = -------------- = --------------- = 0,9058. 2 2

Хгеом. = анти lg 0,9058 = 8,05 МЗЕ.

Количество МЗЕ в испытуемой КВ можно также определять по методу пробит-анализа.

7. Возможность обновления производственных штаммов

Новые штаммы, предназначенные для изготовления коклюшного компонента ассоциированных вакцин, производства диагностических препаратов, аттестует Федеральное государственное учреждение науки научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича).

ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича хранит коллекцию всех производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. Новые изученные штаммы для пополнения коллекции производственных штаммов должны поступать в ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича с соответствующей характеристикой (Прилож. 3).

Новые штаммы коклюшных бактерий, отбираемые для пополнения коллекции производственных штаммов, должны быть изучены по всем вышеуказанным свойствам.

Приложение 1

Среда Борде-Жангу

Приготовление картофельного отвара

К 1 л дистиллированной воды прибавляют 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и 40 мл глицерина, кипятят в закрытой посуде до размягчения картофеля. Затем доливают дистиллированную воду до прежнего объема, процеживают через марлю.

К 500 мл фильтрата прибавляют 1,5 л солевого раствора, в состав которого входят следующие соли:

    K HPO  - 2,25 г;
     2   4
    KH PO  - 0,75 г;
      2  4

KCl — 1,5 г;

MgSO — 0,075 г; 4

NaCl — 7,5 г.

Солевой раствор должен иметь pH 7,4 — 7,5.

Затем прибавляют 60 г агара и кипятят на асбестовой сетке при перемешивании до полного растворения агара. Устанавливают pH 7,1 — 7,2, фильтруют через марлю с толстым слоем ваты. Затем разливают в стерильную посуду и стерилизуют при 110 °С 30 мин.

Среда КУА

Пропись среды на 1 л

Гидролизат казеина — (170 +/- 5) мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержалось аминного азота 150 — 160 мг %);

Дрожжевой диализат — (90 +/- 10) мл;

    KH PO  - 0,5 г;
      2  4
    MgCl  - 0,4 г;

    2

Крахмал растворимый — 1,5 г;

CaCl — 0,01 г; 2

    FeSO  х 7H O - 0,01 г;
        4     2
    CuSO  х 5H O;
        4     2

Цистеин — 0,03 г;

Агар — (27,5 +/- 2,5) г;

Уголь активированный — 2 г.

В среде содержание хлоридов должно составлять (0,75 +/- 0,15)%, аминного азота (155 +/- 10) мг %, pH доводят до (7,0 +/- 0,1).

ПОДСЧЕТ ЛД ПО МЕТОДУ КЕРБЕРА 50

ЛД — дозу, вызывающую гибель 50% взятых в опыт животных, 50 рассчитывают по следующей формуле:

                  lg ЛД   = lg D  - дельта (SUM   - 0,5),
                       50       N              L

                                            i

где:
D  - максимальная из испытанных доз;
 N
дельта - логарифм отношения каждой  последующей дозы к предыдущей, т.е.

логарифм кратности испытуемых разведений; L — отношение числа животных, погибших от введения данной дозы к i общему числу животных, которым эта доза была введена; SUM — сумма значений, найденных для всех испытанных доз. L i

Пример:

lg ЛД = lg 10000 — lg 5 (2,2 — 0,5) = 4,0 — 0,699 х 50

                  х 1,7 = 4,0 - 1,1883 = 2,8117.

ЛД = 648 микробных клеток. 50

Таким образом, ЛД в данном примере составляет 648 микробных клеток. 50

ПАСПОРТ НА ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ШТАММ

Название штамма

№ и особое обозначение штамма _________________________________________

Дата и порядковой номер сушки _________________________________________

Получен из ____________________________________________________________

Дата получения ______________ выделен _________________________________

Характеристика штамма

Морфология ____________________________________________________________

Подвижность ___________________________________________________________

Форма колоний ______________ окраска по Грамму ________________________

Рост на мясо пептонном агаре

Гемолиз

Серологические свойства

Титр:

Приложение 4

Разница выживших от наибольшей и наименьшей дозы

Таблица используется при подсчете 50-процентной эффективной дозы при применении метода Вильсона-Вустер <*>. Значения в таблице применимы к опыту

с  3-мя  дозами, по 16 мышей на каждую дозу и 5-кратным шагом между дозами.
Значение  ЕД   -  верхнее число каждой клетки таблицы для опыта  со средней

        50

дозой, равной 100. Для других средних доз величину ЕД делят на 100 и 50 умножают на величину использованной дозы. Две цифры ниже значения ЕД 50 указывают лимиты одного стандартного отклонения в процентах.

<*> Nat. Acad. Sc. Proc. 1943, v. 29, р. 207 — 212.