МУК 4.2.2304-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения. Методические указания

(утв. Постановлением Роспотребнадзора от 30.11.2007 № 80)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["МУК 4.2.1902-04"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-1902-04" "МУК 4.2.1902-04. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) рас"
  n1["МУК 4.2.1913-04"]:::rst
  click n1 "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-1913-04" "МУК 4.2.1913-04. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного пр"
  n2["МУК 4.2.2304-07"]:::doc
  click n2 "https://bukva.ai/docs/muk-4-2-2304-07" "МУК 4.2.2304-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов ра"
  n1 --> n2
  n0 --> n2
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ

И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2304-07

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, О.В. Анисимова, Н.А. Кашина); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Г.Г. Онищенко, Л.П. Гульченко, Г.Е. Иванов); ФГУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (И.В Брагина, Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова, Т.Ф. Авдеенко, С.Ю. Терехова, М.В. Зароченцев); ТУ Роспотребнадзора по г. Москве (Н.Н. Филатов, И.И. Пискарева, Н.Я. Салова, Е.В. Сизых); Московской медицинской академией им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России (Б.П. Суханов); ФГУЗ Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Г.А Шипулин, С.Б. Яцышина); ГУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (А.В. Кузубов, Я.И. Алексеев, Д.А. Варламов, С.В. Боровская); Центром «Биоинженерия» РАН (К.Г. Скрябин, Б.Б. Кузнецов); ГОУВ Московским государственным университетом прикладной биотехнологии Минобрнауки России (И.А. Рогов, Н.Г. Кроха, А.Ф. Валихов); Инновационной корпорацией «Биозащита» (И.В. Панкин).

2. Утверждены Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации Г.Г. Онищенко 30.11.2007 № 80. Зарегистрированы в Министерстве юстиции Российской Федерации 6 февраля 2008 года, регистрационный номер 11117.

3. Введены в действие с 30.11.2007.

4. Введены взамен МУК 4.2.1902-04 «Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции»; МУК 4.2.1913-04 «Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания».

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы идентификации и количественного определения генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах.

1.2. Представлены скрининговые методы, направленные на выявление и количественное определение рекомбинантной ДНК: промотора 35S из вируса мозаики цветной капусты, терминатора NOS из Agrobacterium tumefaciens и маркерных генов, позволяющие проводить предварительную проверку пищевой продукции.

1.3. Представлены методы, направленные на идентификацию и количественное определение рекомбинантной ДНК, характерной для генетических конструкций и уникальных трансформационных событий, для осуществления окончательной идентификации линии ГМО растительного происхождения.

2. АППАРАТУРА, ИНСТРУМЕНТЫ, ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА, РЕАКТИВЫ

2.1. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используется следующая аппаратура и инструменты:

• амплификаторы типа ABI Prism 7000, iCycler iQ, Rotor Gene-3000 (6000), AHK-32, «Терцик МС-2» и другие;
• комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа «ДЕРМИГЕН-001»;
• прибор для горизонтального электрофореза типа «Mini-Sub Cell GT System» с комплектом кювет и гребенок;
• источник напряжения типа «Power Pac 300» с диапазоном регулируемого напряжения 50 — 300 В;
• трансиллюминатор типа Т12 с защитным экраном, диапазон излучения 300 — 400 нм;
• видеосистема типа «Gel Doc 2000^{\text{тм}} », предназначенная для ввода в компьютер, анализа и документирования изображений люминесцирующих следов ДНК в гелях, окрашенных бромистым этидием, чувствительность — не менее 10 нг ДНК (по бромистому этидию);
• холодильник бытовой электрический типа «Электролюкс», с температурой морозильной камеры минус 20 °C;
• микроцентрифуга настольная типа Эппендорф (частота вращения не менее 13000 об./мин);
• термостат типа «TERMO 24-15» под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °C, количество гнезд — не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры — 0,2 °C, разность температур между соседними ячейками — не более 0,5 °C;
• термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 42 °C, рабочий диапазон от 20 до 60 °C, точность поддержания температуры +/- 1 °C;
• аппарат для встряхивания типа «Вортекс», скорость вращения 250 — 3000 об./мин;
• печь микроволновая (мощностью не менее 400 W);
• весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г;
• анализатор потенциометрический типа МР 220, погрешность измерений pH +/- 0,01;
• гомогенизатор перистальтического типа «Стомайкер» или других моделей;
• облучатель бактерицидный настенный типа ОБН-150;
• дозаторы с переменным объемом дозирования: 0,2 — 2,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 1,2%; 0,5 — 10,0 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%; 2 — 20 мкл с шагом 0,01 мкл, с точностью +/- 0,8%; 20 — 200 мкл с шагом 0,1 мкл, с точностью +/- 0,6%; 100 — 1000 мкл с шагом 1 мкл, с точностью +/- 3%; 2 — 10 мл с шагом 0,1 мл, с точностью +/- 0,5%.

2.2. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используется следующая лабораторная посуда:

• цилиндры мерные лабораторные вместимостью 10, 25, 100, 1000 мл, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Z 327263-2 EA, Z 327301-2 EA, Z 327379-2 EA, Z 327476-2 EA;
• колбы мерные лабораторные вместимостью 25, 50, 100, 250, 1000 мл, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Z 329517-1 EA, Z 32 9525-1 EA, Z 329533-1 EA, Z 329541-1 EA, Z 329576-1 EA;
• пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2, 0,5, 1,5 мл;
• наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до: 10; 20; 200; 1000 мкл; 10 мл.

2.3. Для проведения идентификации и количественного определения ГМО растительного происхождения используются следующие реактивы:

• кислота соляная, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № H 1758;
• кислота борная, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № B 7901;
• натрий едкий, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № 221465;
• натрий хлористый, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № S 3014;
• этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № E 5134;
• гексадецилтриметиламмоний бромид (СТАВ), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № H 5882;
• трис(оксиметил)аминометан, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № T 6791;
• альбумин бычий сывороточный сухой (БСА), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № B 4287;
• этидий бромистый, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № E 4391;
• спирт этиловый, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № 459836;
• спирт изопропиловый, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № 19516;
• хлороформ, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № 151823;
• вода деионизированная, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № W 4502;
• вода дистиллированная, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № W 3500;
• 2-меркаптоэтанол, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № M 3148;
• термостабильный фермент Taq-полимераза, оптимум работы в области 70 — 72 °C, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Д 1806;
• буфер для ПЦР с MgCl_{2} корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № P 2192;
• агароза для электрофореза (тип П), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № A 6877;
• маркер молекулярной массы ДНК, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № P 1473;
• стандартный образец состава генетически немодифицированного организма растительного происхождения, корпорация «Сигма Алдрич» (Fluka), кат. № 53198;
• стандартный образец состава ГМО растительного происхождения, корпорация «Сигма Алдрич» (Fluka), кат. № 44386;
• 2'-дезоксиаденозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (АТФ), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Д 4788;
• 2'-дезоксицитидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ЦТФ), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Д 4913;
• 2'-дезоксигуанозин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ГТФ), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Д 5038;
• 2'-дезокситимидин-5'трифосфорной кислоты тетранатриевая соль, тригидрат (ТТФ), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № Т 9656;
• праймеры ЗАО «Синтол», (Россия);
• натрия додецилсульфат (SDS), корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № L 4390;
• 3%-й раствор перекиси водорода, корпорация «Сигма Алдрич» (Sigma), кат. № 7722.

2.4. Допускается использование другой аппаратуры, инструментов и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше, отечественного и зарубежного производства, разрешенные для применения в установленном порядке.

3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ

3.1 Приготовление растворов:

• для приготовления 1М ТРИС — HCl (pH 7,5) в мерной колбе на 100 мл растворить 12,11 г трис(оксиметил)аминометана в 80 мл дистиллированной воды, довести pH концентрированной соляной кислотой до 7,5, довести объем раствора до метки деионизованной водой, перемешать, хранить при температуре -20 °C не более года;
• для приготовления 5М NaCl растворить 29,22 г натрия хлористого в 100 мл дистиллированной воды, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года;
• для приготовления 30%-й NaOH растворить 3 г натрия гидроокиси в 7 мл дистиллированной воды;
• для приготовления 0,5М ЭДТА (pH 8,0) в мерной колбе на 100 мл растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты в 80 мл дистиллированной воды, раствором 30%-й натрия гидроокиси довести pH раствора до 8,0, дистиллированной водой объем раствора довести до метки, перемешать, хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3.2 Приготовление хлороформа, насыщенного водой:

• смешать 100 мл хлороформа с 20 мл деионизированной воды и оставить на 24 ч для насыщения;
• срок хранения при температуре от 4 до 5 °C — не более 6 мес.

3.3 Приготовление 70%-го раствора этилового спирта:

• смешать 70 мл 96%-го этилового спирта с 26 мл деионизированной воды;
• срок хранения при температуре от 4 до 5 °C — не более 2 мес.

3.4 Приготовление раствора БСА (20 мкг/ мл):

• растворить 0,002 г сухого альбумина бычьего сывороточного в 1 мл деионизированной воды, 10 мкл полученного раствора смешать с 990 мкл деионизированной воды;
• срок хранения в морозильной камере при температуре минус 20 °C — не более 6 мес.

3.5 Приготовление лизирующего буфера (2%-го «СТАВ»):

• растворить 0,5 г гексадецилтриметиламмония бромида в 10 мл деионизированной воды, добавить 2,5 мл 1М Трис — HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, довести объем раствора деионизированной водой до 25 мл, перемешать;
• срок хранения при температуре от 4 до 5 °C — не более 6 мес.

3.6 Приготовление 1x ТВЕ буфера для электрофореза:

• в мерной колбе на 1000 мл растворить 10,8 г трис(оксиметил)- аминометана, 5,5 г борной кислоты и 0,92 г этилендиаминтетрауксусной кислоты, довести дистиллированной водой до метки, перемешать до полного растворения;
• срок хранения 1х раствора — 10 дней.

3.7 Приготовление раствора бромистого этидия — C_{21}H_{20}N_{3}Br (10 мг/мл):

• растворить 1 г бромистого этидия в 100 мл дистиллированной воды;
• срок хранения в посуде темного стекла при температуре от 4 до 5 °C — 12 мес.

3.8 Приготовление осаждающего буфера СТАВ:

• в мерную колбу внести 1 г СТАВ, 0,5 г NaCl, добавить 100 мл деионизированной воды, довести раствором 30%-й натрия гидроокиси pH раствора до 8,0, довести объем деионизированной водой до 200 мл;
• хранить при 4 °C не более 6 мес.

3.9 Приготовление 1,2М NaCl:

• растворить 7,0 г NaCl в 100 мл деионизированной воды, перемешать;
• хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

3.10 Приготовление 10%-го раствора SDS:

• растворить 10 г SDS в 90 мл дистиллированной воды;
• хранить при комнатной температуре не более 1 года.

4. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК

4.1 Метод выделения ДНК с помощью СТАВ:

• навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 мл;
• добавить 300 мкл деионизированной воды, перемешать шпателем;
• добавить 500 мкл лизирующего СТАВ-буфера с меркаптоэтанолом, тщательно перемешать шпателем;
• инкубировать при 65 °C 90 мин;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин;
• перенести 500 мкл супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
• добавить 500 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 с;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин;
• перенести 500 мкл верхней фракции в чистую пробирку, добавить 500 мкл хлороформа, перемешать;
• центрифугировать 5 мин при 13000 об./мин;
• перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа;
• добавить 2 объема СТАВ-осаждающего буфера, перемешать пипетированием;
• инкубировать 60 мин при комнатной температуре;
• центрифугировать 5 мин при 13000 об./мин;
• удалить супернатант;
• растворить осадок в 350 мкл NaCl (1,2 М);
• добавить 350 мкл хлороформа, перемешать на вортекс 30 с;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин;
• перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
• добавить 0,6 объема изопропилового спирта, перемешать;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин;
• удалить супернатант;
• добавить 500 мкл 70%-го раствора этилового спирта и перемешать на вортекс;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин;
• удалить супернатант;
• подсушить осадок не более 5 мин при 65 °C для удаления капель спирта;
• растворить осадок в 100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая, полученный раствор ДНК готов для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР);
• хранить при минус 20 °C.

4.2 Сорбционный метод выделения ДНК:

• в центрифужные пробирки типа Эппендорф на 1,5 мл внести 300 мг бисера и 70 — 80 мг анализируемого материала, добавить 0,5 мл 5 мМ Na_{2} - \text{соль} ЭДТА И термостатировать 30 — 60 мин при 65 °C;
• к содержимому пробирки добавить 400 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до максимально однородного состояния, термостатировать при 65 °C 60 — 120 мин;
• перемешать на вортекс, добавить 500 мкл бидистиллированной воды, перемешать на вортекс;
• центрифугировать 1 мин при 12000 об./мин, прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку;
• добавить 20 мкл сорбента, пробирку поместить на ротатор или перемешивать на вортекс 10 мин при 10000 — 20000 об./мин;
• центрифугировать 10 с при 12000 об./мин;
• удалить супернатант, к осадку добавить 200 мкл лизирующего реагента, перемешать на вортекс до однородного состояния, центрифугировать 10 с при 12000 об./мин;
• удалить супернатант, к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 — 10 раз, центрифугировать 10 с при 12000 об./мин;
• удалить супернатант, не задевая осадка;
• к осадку добавить 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортекс, центрифугировать 10 с при 12000 об./мин, удалить супернатант;
• повторить предыдущий пункт еще раз;
• подсушить осадок при 65 °C в течение 4 — 5 мин;
• к осадку добавить 50 мкл экстракционного раствора, отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы;
• суспендировать содержимое пробирки на вортекс 5 — 10 с до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 мин при 65 °C;
• повторно суспендировать пробу на вортекс, центрифугировать 1 мин при 12000 об./мин;
• раствор ДНК перенести в чистую пробирку, хранить при минус 20 °C.

5. ПЦР С ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

5.1 Идентификация видоспецифичной растительной ДНК

5.1.1 Идентификация ДНК сои, ген лектина:

• праймеры:

1) 5' GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 3',

2) 5' GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 118 пар нуклеотидов, Прилож. 1.

5.1.2 Идентификация ДНК кукурузы, ген зеина:

• праймеры:

1) 5' TGC TTG CAT TGT TCG CTC TCC TAG 3',

2) 5' GTC GCA GTG ACA TTG TGG CAT 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 329 пар нуклеотидов, Прилож. 2.

5.1.3 Идентификация ДНК картофеля, ген фосфоенолпируват карбоксилазы:

• праймеры:

1) 5' GTC TCC TTG GCT TGT CAT TTT ATG C 3',

2) 5' CAA GTT AGC TGC CAT CAT TCT GGC C 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 1149 пар нуклеотидов, Прилож. 3.

5.2 Скрининговый анализ

5.2.1 Метод идентификации промотора 35 S:

• праймеры:

1) 5' GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 3',

2) 5' GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 195 пар нуклеотидов, Прилож. 4.

5.2.2 Метод идентификации терминатора NOS:

• праймеры:

1) 5' GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3',

2) 5' TTA TCC TAG TTT GCG CGC TA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 180 пар нуклеотидов, Прилож. 5.

5.2.3 Метод идентификации маркерного гена npt II:

• праймеры:

1) 5' GGA TCT CCT GCT ATC T 3',

2) 5' GAT CAT CCT GAT CGA C 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 173 пары нуклеотидов, Прилож. 6.

5.3 Идентификация линий ГМО

5.3.1 Метод идентификации сои линии 40-3-2:

• 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG 3',

2) 5' CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы поместить на холод, хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда;
• 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' ATC CCA CTA TCC TTC GCA AGA 3',

4) 5' TGG GGT TTA TGG AAA TTG GAA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза, продукт амплификации — 169 пар нуклеотидов, Прилож. 7.

5.3.2 Метод идентификации сои линии А2704-12:

• праймеры:

1) 5' GGC GTT CGT AGT GAC TGA GG 3',

2) 5' GTT TTA CAA CGT CGT GAC TGG 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 185 пар нуклеотидов, Прилож. 8.

5.3.3 Метод идентификации сои линии А5547-127:

• праймеры:

1) 5' TGT GGT TAT GGC GGT GCC ATC 3',

2) 5' TGC TAC AGG CAT CGT GGT GTC 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 150 пар нуклеотидов, Прилож. 9.

5.3.4 Метод идентификации кукурузы линии Bt 176:

• 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' CGG CCC CGA GTT CAC CTT 3',

2) 5' CTG CTG GGG ATG ATG TTG TTG 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы поместить на холод, хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда;
• 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' CCG CAC CCT GAG CAG CAC 3',

4) 5' GGT GGC ACG TTG TTG TTC TGA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 189 пар нуклеотидов, Прилож. 10.

5.3.5 Метод идентификации кукурузы линии MON 810:

• 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' TAT CTC CAC TGA CGT AAG GGA TGA C 3',

2) 5' TGC CCT ATA ACA CCA ACA TGT GCT T 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' ACT ATC CTT CGC AAG ACC CTT CCT C 3',

4) 5' GCA TTC AGA GAA ACG TGG CAG TAA C 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об./мин), при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 149 пар нуклеотидов, Прилож. 11.

5.3.6 Метод идентификации кукурузы линии MON 863:

• праймеры:

1) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3',

2) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации 84 пары нуклеотидов, Прилож. 12.

5.3.7 Метод идентификации кукурузы линии NK 603:

• праймеры:

1) 5' AGT AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3',

2) 5' AAG AGA TAA CGA GAT CCA CTC AAA CAC T 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла:
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 108 пар нуклеотидов, Прилож. 13.

5.3.8 Метод идентификации кукурузы линии Bt 11:

• праймеры:

1) 5' CCA TTT TTC AGC TAG GAA GTT C 3',

2) 5' TCG TTG ATG TTK GGG TTG TTG TCC 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 110 пар нуклеотидов, Прилож. 14.

5.3.9 Метод идентификации кукурузы T 25:

• праймеры:

1) 5' GCC AGT TAG GCC AGT TAC CCA 3',

2) 5' TGA GCG AAA CCC TAT AAG AAC CCT 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 149 пар нуклеотидов, Прилож. 15.

5.3.10 Метод идентификации кукурузы линии GA 21:

• праймеры:

1) 5' ACG GTG GAA GAG TTC AAT GTA TG 3',

2) 5' TCT CCT TGA TGG GCT GCA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс и центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 270 пар нуклеотидов, Прилож. 16.

5.3.11 Метод идентификации кукурузы линии MIR 604:

• праймеры:

1) 5' GGT ACC CAT TTG GCG CCG AT 3',

2) 5' CAG CGT TGC GGT TCT GTC AG 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР:

• состав буферной смеси:

• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 895 пар нуклеотидов, Прилож. 17.

5.3.12 Метод идентификации кукурузы линии MON 88017:

• праймеры:

1) 5' GAG CAG GAC CTG CAG AAG CT 3',

2) 5' TCC GGA GTT GAC CAT CCA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР:

• состав буферной смеси:

• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации — 94 пары нуклеотидов, Прилож. 18.

5.3.13 Метод идентификации сахарной свеклы линии H7-1:

• праймеры:

1) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3',

2) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации 110 пар нуклеотидов, Прилож. 19.

5.3.14 Метод идентификации риса LL 62:

• праймеры:

1) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3',

2) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле, продукт амплификации 88 пар нуклеотидов, Приложение 20.

5.3.15. Метод идентификации картофеля, устойчивого к колорадскому жуку сортов Рассет Бурбанк Ньюлив, Супериор Ньюлив, Елизавета 2904/1 kgs, Луговской 1210 amk:

• 1-й раунд, внешние праймеры:

1) 5' CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC 3',

2) 5' ATG CAC TCA CGT AGT CCT CC 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, добавить 1,0 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• хранение не более одного часа в холодильнике до проведения 2-го раунда;
• 2-й раунд, внутренние праймеры:

3) 5' CTA CCA CTA AGG ATG TTA TCC 3',

4) 5' TTG TAT AGA AGC TCA CGA GG 3';

• реакционная смесь для проведения ПЦР, рассчитанная на 10 проб:

• реакционную смесь перемешать на вортекс, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, добавить 0,5 мкл раствора ДНК в каждую пробирку, перемешать, центрифугировать 30 с при 3000 об./мин, при использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла;
• условия амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза, продукт амплификации — 102 пары нуклеотидов, Прилож. 21.

6. ПРОВЕДЕНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В АГАРОЗНОМ ГЕЛЕ

6.1 Приготовление 2%-го агарозного геля:

• к 1 г агарозы добавить 50 мл 1x буфера ТВЕ, тщательно перемешать;
• полученный раствор поместить в микроволновую печь на 2 — 5 мин или прокипятить на водяной бане 15 мин до полного расплавления агарозы;
• расплавленную агарозу охладить до 56 °C, добавить 5 мкл бромистого этидия, тщательно перемешать, разлить в подготовленную форму, толщина геля 0,5 — 0,7 см, через 30 — 40 мин удалить гребенку;
• готовый гель использовать сразу или хранить в 1x ТВЕ буфере в холодильнике при 4 °C.

6.2 Проведение электрофореза:

• 10 мкл реакционной смеси после амплификации внести в лунку геля, в одну из лунок внести маркер молекулярной массы;
• поместить заполненный гель в камеру для электрофореза с буфером 1x ТБЕ, толщина слоя буфера над поверхностью геля ~ 2 — 3 мм;
• провести электрофорез в режиме постоянного напряжения 100 V 70 — 90 мин;
• гель (без формы) поместить на экран трансиллюминатора;
• документировать результат фореза при помощи гель-документирующей системы, фотокопию геля приложить к отчету по идентификации.

7. ПЦР С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ

7.1 Используются следующие праймеры:

• на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты:

5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.),

5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);

• на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli:

5' ACC GTA CTT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.),

5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 Н.о.);

• на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.),

5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

• на маркерный ген nptII из транспозона Тn5 бактериального происхождения:

5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.),

5' ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.);

• на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens:

5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.),

5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

7.2 Набор реактивов для асимметричной мультиплексной ПЦР (амПЦР) включает:

• сухие смеси, включающие Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты, хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 млМ, оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР;
• растворитель;
• минеральное масло;
• «+» контроль амплификации — 1 пробирка, 0,5 мл.

7.3 Проведение реакции:

• необходимое количество микропробирок с сухими реактивами промаркировать соответствующим образом: «-» контроль», «исследуемые пробы», «+» контроль»;
• добавить во все пробирки по 5 мкл праймеров, 10 мкл растворителя;
• в пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 мкл деионизированной воды, в опытные пробирки — по 5 мкл раствора исследуемой ДНК, в пробирку с положительным контролем — 5 мкл раствора контрольной ДНК;
• добавить во все пробирки по 20 мкл минерального масла;
• пробы готовы для проведения амплификации;
• запустить программу амплификации:

• после проведения амплификации пробы готовы для осуществления гибридизации.

7.4 Гибридизация ДНК, ферментный анализ на биологическом микрочипе и сканирование результатов:

• набор реактивов для ДНК гибридизации и ферментного анализа содержит 20 x SSC — 50 мл, диаминобензидин (ДАБ) — 100 таблеток, конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином — 0,1 мл с концентрацией 1 мг/мл, 1 пробирка;
• приготовить рабочие разведения раствора 20 x SSC (3М NaCl, 0,3М цитрат натрия, pH 7,4): 2 x SSC, 0,1% SDS; 0,1 x SSC; 0,1 x SSC, 0,1% SDS; 0,01 x SSC.
• схема приготовления 100 мл раствора:

• микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 — 2 с для сбора пробы на дне пробирки, добавить в каждую микропробирку 5 мкл 20 x SSC и 0,2 мкл 10% SDS, перемешать, центрифугировать 1 — 2 с при 3000 об./мин, распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов;
• поместить микрочип во влажную камеру, поставить на 1 ч в воздушный термостат с температурой 42 °C;
• по окончании реакции капли смыть буфером 2 x SSC, 0,1% SDS, тщательно промыть чип растворами 2 x SSC, 0,1% SDS — 1 раз 5 мин, 0,1 x SSC, 0,1% SDS — 2 раза по 5 мин, 0,1 x SSC — 5 раз по 1 мин, 0,01 x SSC в течение 10 с.

7.5 Проведение ферментного анализа:

• исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1 x SSC, содержащим 1% БСА (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 мкл на микрочип;
• нанести 25 — 30 мкл разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 мин во влажную камеру при комнатной температуре;
• смыть конъюгат раствором 1 x SSC;
• залить микрочип раствором 2 x SSC, промыть 5 мин;
• промыть микрочип раствором 1 x SSC;
• непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата — диаминобензидина (ДАБ), для этого растворить таблетку ДАБ в 1 см3 буфера 0,1 x SSC, добавить 30 мм3 3%-го раствора пероксида водорода и перемешать, раствор использовать немедленно;
• залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата, выдержать от 2 до 10 мин при комнатной температуре;
• в случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата;
• промыть микрочип дистиллированной водой, стряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °C на 5 — 10 мин, после сушки микрочип с окрашенными зонами хранить в темном месте.

7.6 Сканирование биологических микрочипов:

• осуществлять с применением аппаратно-программного комплекса для анализа биологических микрочипов типа «ДЕГМИГЕН-001» и компьютерной программы для анализа изображений;
• в соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом, подготовить сканер микрочипов к работе;
• поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку;
• запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора;
• после завершения сканирования микрочипа сохранить изображение, присвоив файлу соответствующее имя.

7.7 Анализ изображений биочипов:

• запустить программу обработки изображения микрочипа, ввести оцифрованное изображение в программу, для этого выбрать опцию «Файл», открыть изображение, в появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, изображение появится в основном окне программы;
• провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию «Анализ», «Разметка матрицы»;
• разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов, для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки, затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла;
• в результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы, чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу «Принять»;
• после завершения базовой разметки провести автоматическую коррекцию положения зондов, для этого в меню выбрать опцию «Настройки/Автоматическая подстройка»;
• для анализа результатов нужно выбрать опцию меню «Анализ» — «Показать результаты», по окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний, для этого нужно выбрать опцию меню «Файл» и затем «Заполнить протокол», после этого появится окно с формой для заполнения, после того как она будет заполнена, нажать кнопку «Выход».

7.8 Интерпретация результатов:

• появление регистрируемого компьютерной программой оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце;
• отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на отсутствие рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец не имеет ГМО растительного происхождения;
• появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноположительного результата, причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования, в этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ;
• отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата, причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе, в этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ.

8. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

8.1 Метод количественного определения генетически модифицированной сои:

• метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий сои в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;
• анализ проводится по гену лектина, который присутствует в геноме всех линий сои, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий сои;
• праймеры на ген лектина:

1) 5' TCC ACC CCC ATC CAC ATT T 3',

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3',

3) 5'- FAM-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3',

длина ампликона 81 пара нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC TCT GCC GAC AGT GGT 3',

5) 5' AAG ACG TGG TTG GAA CGT CTT C 3',

6) 5'-FAM-CAA AGA TGG ACC CCC ACC CAC G-TAMRA-3',

длина ампликона 82 пары нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной сои;
• условия амплификации:

• результаты исследования, Приложение 22.

8.2 Метод количественного определения генетически модифицированной кукурузы:

• метод позволяет количественно определить рекомбинантную ДНК, характерную для генетически модифицированных линий кукурузы, в пищевых продуктах методом ПЦР в реальном времени;
• анализ проводится по гену инвертазы кукурузы, который присутствует в геноме всех линий кукурузы, и универсальной последовательности 35 S промотора вируса мозаики цветной капусты, который присутствует в геноме всех генетически модифицированных линий, за исключением GA 21;
• праймеры на ген инвертазы кукурузы;

1) 5' CAC TCC ATC GTG GAG AGC TT 3',

2) 5' GGC GTT GTT GAA GAG GAA GA 3',

3. 5'-FAM-TAC CCC ACA CGA GCC ATC TAC GAC T-TAMRA-3', длина ампликона 111 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CGT CТТ CAA AGC AAG TGG ATT G 3',

5) 5' TCT TGC GAA GGA TAG TGG GAT T 3',

6) 5'-FAM-TCT CCA CTG ACG TAA GGG ATG ACG CA-TAMRA-3',

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• при проведении исследования использовали стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы;
• условия амплификации:

• результат исследований, Прилож. 23.

8.3 Метрологические характеристики метода:

• границы интервала, в котором погрешность определения находится с доверительной вероятностью P = 0,95, составляют от 0,1% до 5,0%, нижнюю и верхнюю границы погрешности определяют с использованием сертифицированных стандартных образцов состава и свойств, стандартные отклонения повторяемости результатов (\delta) составляют от 0,067 (для стандарта 0,1%) до 0,540 (для стандарта 5%), что соответствует погрешности сертифицированных стандартных образцов состава ГМО растительного происхождения;
• результаты анализа образцов принимают, если коэффициент корреляции калибровочной прямой, построенной по сертифицированным стандартным образцам состава ГМО растительного происхождения, по методу наименьших квадратов (R^{2})>0,97 .

8.4 Метод количественного определения сои линии 40-3-2:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена лектина и генетической конструкции, характерной для сои линии 40-3-2;
• используются зонды, специфичные к трансгену и гену лектина, меченые красителями FAM и VIC соответственно;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои: 5,0, 2,0, 1,0, 0,5 и 0,0%;
• праймеры на ген лектина сои:

1) 5' TCC ACC CCC АTC CАC ATT T 3',

2) 5' GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA 3',

3) 5'-VIC-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-TAMRA-3';

• на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT 3'

5) 5' GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C 3'

6) 5'-FAM-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-TAMRA-3'

• реакционная смесь для проведения ПЦР:

• условия амплификации:

8.5 Метод количественного определения сои линии А2704-12:

• основан на ПЦР в реальном времени, с определением гена лектина и области ДНК, специфичной трансформационному событию А2704-12;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сои А2704-12: 0,1, 0,4, 0,9, 2,0, 3,3%;
• праймеры на ген лектина сои:

1) 5' CAC CTT TCT CGC ACC AAT TGA CA 3',

2) 5' TCA AAC TCA ACA GCG ACG AC 3',

3) 5'-FAM-CCA CAA ACA CAT GCA GGT TAT CTT GG-TAMRA-3',

длина ампликона 105 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCA AAA AAG CGG TTA GCT CCT 3',

5) 5' ATT CAG GCT GCG CAA CTG TT 3',

6) 5'-FAM-CGG TCC TCC GAT CGC CCT TCC-TAMRA-3',

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сои:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.6 Метод количественного определения кукурузы линии MON 810:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез группы белков, присущих для всех линий кукурузы (hmg) и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 810, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: < 0,02, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0%;
• праймеры на ген hmg:

1) 5' TTG GAC TAG AAA TCT CGT GCC CA 3',

2) 5' GCT ACA TAG GGA GCC TTG TCC T 3',

3) 5'-FAM-CAA TCC ACA CAA ACG CAC GCG TA-TAMRA-3',

длина ампликона 79 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TCG AAG GAC GAA GGA CTC TAA CGT 3',

5) 5' GCC ACC TTC CTT TTC CAC TAT CTT 3',

6) 5'-FAM-AAC ATC CTT TGC CAT TGC CCA GC-TAMRA-3',

длина ампликона 92 пары нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.7 Метод количественного определения кукурузы линии MON 863:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию MON 863, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,01, 1,0, 5,0, 10,0%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3',

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3',

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-3',

длина ампликона 84 пары нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GTA GGA TCG GAA AGC TTG GTA C 3',

5) 5' TGT TAC GGC CTA AAT GCT GAA CT 3',

6) 5'-FAM-TGA ACA CCC ATC CGA ACA AGT AGG GTC A-TAMRA-3',

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.8 Метод количественного определения кукурузы линии NK 603:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной трансформационному событию NK 603, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,10, 0,49, 0,98, 1,96, 4,91%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3',

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3',

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT ТСС CT-3',

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ATG AAT GAC CTC GAG TAA GCT TGT TAA 3',

5) 5' AAG AGA TAA CAG GAT CCA CTC AAA CAC T 3',

6) 5'-FAM-TGG TAC CAC GCG ACA CAC TTC CAC TC-TAMRA-3',

длина ампликона 108 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.9 Метод количественного определения кукурузы линии Bt 11:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной трансформационному) событию Bt 11, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,1, 0,3, 0,7, 1,0, 1,3, 2,0%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3',

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3',

3) 5'-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3';

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG GAA CCC CTA TTT GTT TA 3',

5) 5' TCC AAG AAT CCC TCC ATG AG 3',

6) 5'-FAM-AAA TAC ATT CAA ATA TGT ATC CGC TCA-TAMRA-3'

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.10 Метод количественного определения кукурузы линии T 25:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной трансформационному событию T 25, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,15, 0,40, 0,90, 2,00, 3,30%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CCT 3',

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3',

3) 5-FAM-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' ACA AGC GTG TCG TGC TCC AC 3',

5) 5' GAC ATG ATA CTC CTT CCA CCG 3',

6) 5'-FAM-TCA TTG AGT CGT TCC GCC ATT GTC G-TAMRA-3',

длина ампликона 102 пары нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.11 Метод количественного определения кукурузы линии GA 21:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы и области ДНК, специфичной трансформационному событию GA 21, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной кукурузы: 0,10, 0,49, 0,98, 1,3, 1,71, 4,26%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CCA GCC TCA TGG CCA AAG 3',

2) 5' CCT TCT TGG CGG CTT ATC TG 3',

3) 5'-FAM-CTT AGG GGC AGA CTC CCG TGT TCC CT-TAMRA-3',

длина ампликона 70 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' CTT ATC GTT ATG CTA TTT GCA ACT TTA GA 3',

5) 5' TGG CTC GCG ATC CTC CT 3',

6) 5'-FAM-CAT ATA CTA ACT CAT ATC TCT TTC TCA ACA GCA GGT GGG T-TAMRA-3',

длина ампликона 112 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.12 Метод количественного определения кукурузы линии MIR 604:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез алкогольдегидрогеназы 1 (adhl 1), присущей для всех линий кукурузы, и области ДНК, специфичной трансформационному событию MIR 604, на границе генома кукурузы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM и VIC;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава и свойств генетически модифицированной кукурузы: менее 0,09, 0,10, 0,98, 9,85%;
• праймеры на ген adhl 1:

1) 5' CGT CGT TTC CCA TCT CTT CCT CC 3',

2) 5' CCA CTC CGA GAC CCT CAG TC 3',

3) 5'-VIC-AAT CAG GGC TCA TTT TCT CGC TCC TCA-TAMRA-3',

длина ампликона 136 пар нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' GCG CAC GCA ATT CAA CAG 3',

5) 5' GGT CAT AAC GTG ACT CCC TTA ATT CT 3',

6) 5'-FAM-AGG CGG GAA ACG ACA ATC TGA TCA TG-TAMRA-3',

длина ампликона 76 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК кукурузы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.13 Метод количественного определения риса линии LL 62:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез фосфолипазы Д (PLD), присущей для всех линий риса, и области ДНК, специфичной трансформационному событию LL 62, на границе генома риса и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM;
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированного риса: менее 0,09, 0,45, 0,90, 1,80, 3,60%;
• праймеры на ген PLD:

1) 5' TGG TGA GCG TTT TGC AGT CT 3',

2) 5' CTG ATC CAC TAG CAG GAG GTC C 3',

3) 5'-FAM-TGT TGT GCT GCC AAT GTG GCC TG-TAMRA-3',

длина ампликона 64 пары нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG G 3',

5) 5' TGC TAA CGG GTG CAT CGT CTA 3'

6) 5'-FAM-CGC ACC GAT TAT TTA TAC TTT TAG TCC ACC-TAMRA-3',

длина ампликона 88 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК риса:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

8.14 Метод количественного определения сахарной свеклы линии H7-1:

• основан на ПЦР в реальном времени с определением гена, кодирующего синтез глютамин синтетазы (GS), присущей для всех линий сахарной свеклы, и области ДНК, специфичной трансформационному событию H7-1, на границе генома сахарной свеклы и элемента генетической конструкции;
• используются зонды, меченые красителем FAM:
• для построения калибровочной прямой используются стандартные образцы состава генетически модифицированной сахарной свеклы: менее 0,1, 0,5, 0,9, 2,0, 5,0%;
• праймеры на ген GS:

1) 5' GAC CTC CAT ATT ACT GAA AGG AAG 3',

2) 5' GAG TAA TTG CTC CAT CCT GTT CA 3',

3) 5'-FAM-CTA CGA AGT TTA AAG TAT GTG CCG CTC-TAMRA-3',

длина ампликона 121 пара нуклеотидов;

• праймеры на целевую последовательность ГМО:

4) 5' TGG GAT CTG GGT GGC TCT AAC T 3',

5) 5' AAT GCT GCT AAA TCC TGA G 3',

6) 5-FAM-AAG GCG GGA AAC GAC AAT CT-TAMRA-3',

длина ампликона 110 пар нуклеотидов;

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение ДНК сахарной свеклы:

• реакционная смесь для проведения ПЦР, количественное определение рекомбинантной ДНК:

• условия амплификации:

9. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМО С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕСТ-СИСТЕМ

9.1. Метод количественного определения генно-инженерно-модифицированной сои и кукурузы с использованием наборов «TaqMan GMO Soy Detection Kit» и «TaqMan GMO Maize Detection Kit»:

• наборы реактивов предназначены для количественного определения в пищевых продуктах генно-инженерно-модифицированной кукурузы или сои;
• метод основан на ПЦР в реальном времени;
• амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий кукурузы или сои, и участок рекомбинантной ДНК в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;
• регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;
• относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава, путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий сои или кукурузы;
• выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов «ДНК-сорб-С».

9.2. Метод идентификации и количественного определения ГМО с использованием наборов «Ампликвант ГМ соя», «Ампликвант ГМ кукуруза», «АмплиСенс ГМ соя FTR», «АмплиСенс ГМ кукуруза FTR», разработанных ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора.

9.2.1 Набор реактивов «Ампликвант ГМ соя»:

• предназначен для количественного определения генно-инженерно- модифицированной сои;
• метод основан на ПЦР в реальном времени;
• амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий сои, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;
• регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;
• относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава, путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий сои;
• выделение ДНК из стандартных образцов состава и из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов «ДНК-сорб-С».

9.2.2 Набор реактивов «Ампликвант ГМ кукуруза»:

• предназначен для количественного определения генно-инженерно- модифицированной кукурузы;
• метод основан на ПЦР в реальном времени;
• амплифицируется участок эндогенной ДНК, характерной для всех линий кукурузы, и участок рекомбинантной ДНК, промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты, в ходе двух независимых реакций с использованием соответствующих праймеров и зондов, меченых флуоресцентным красителем;
• регистрация флуоресценции красителей осуществляется приборами типа ABI-PRISM 7000, Rotor Gene 3000 и анализируется с использованием программного обеспечения приборов;
• относительное содержание ГМО в пищевом продукте рассчитывается с использованием стандартных образцов состава путем сравнения результатов измерения флуоресценции красителя FAM, специфичного для ГМО, с результатами измерения флуоресценции красителя VIC, специфичного для всех линий кукурузы;
• выделение ДНК из стандартных образцов состава из исследуемых образцов осуществляется одновременно одним методом с помощью СТАВ или набора реактивов «ДНК-сорб-С».

9.2.3 Набор реактивов «АмплиСенс ГМ соя FRT»:

• предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной сои в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в реальном времени;
• анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке, для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый флуоресцентными красителями зонд;
• в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные для промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации эндогенной ДНК, специфичной для всех линий сои;
• выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора реактивов «ДНК-сорб-С».

9.2.4 Набор реактивов «АмплиСенс ГМ кукуруза FRT»:

• предназначен для идентификации генно-инженерно-модифицированной кукурузы в пищевых продуктах и растительном сырье методом ПЦР в реальном времени;
• анализ представляет собой проведение трех ПЦР в одной пробирке, для каждой из которых используются специфичные праймеры и меченый флуоресцентными красителями зонд;
• в двух реакциях выявляются последовательности ДНК, специфичные для промотора 35 S из вируса мозаики цветной капусты и терминатора NOS из Agrobactetium tumefaciens, третья предназначена для амплификации эндогенной ДНК, специфичной для всех линий кукурузы;
• выделение ДНК осуществляется с помощью СТАВ или набора реактивов «ДНК-сорб-С».

9.2.5 Выделение ДНК с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-С»:

• буфер для лизирующего реагента и раствор для отмывки 1 прогреть при 64 °C до полного растворения кристаллов;
• в каждую пробирку внести по 400 мкл буфера для лизирующего реагента и по 17 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать;
• инкубировать при 64 °C 1 ч, периодически встряхивая на вортекс;
• центрифугировать 5 мин при 12000 — 14000 об./мин;
• отобрать и перенести надосадочную жидкость в объеме 200 — 350 мкл в чистые пробирки;
• центрифугировать 5 с при 5000 об./мин;
• тщательно ресуспендировать сорбент на вортекс, в каждую пробирку добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешать на вортекс, оставить в штативе на 10 — 15 мин, перемешивая каждые 2 мин;
• центрифугировать 1 мин при 5000 об./мин, удалить супернатант;
• добавить по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1 мин при 5000 об./мин;
• удалить супернатант;
• добавить по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортекс до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировать 1 мин при 10000 — 12000 об./мин, отобрать супернатант;
• повторить процедуру отмывки, отобрать супернатант полностью, поместить пробирки в термостат 64 °C на 5 — 10 мин для подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты;
• добавить по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, перемешать на вортекс;
• поместить в термостат 64 °C на 5 — 8 мин, периодически встряхивая на вортекс;
• центрифугировать 1 мин при 12000 — 14000 об./мин;
• раствор ДНК хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °C и в течение 1 года — при температуре минус 20 °C.

9.3. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863, разработанные Центром «Биоинженерия» РАН.

9.3.1. Наборы реактивов для количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии GA 21, кукурузы линии NK 603, кукурузы линии MON 863 методом ПЦР в реальном времени:

• в состав каждого набора входят 2 пробирки матричной реакционной смеси, 1 пробирка с термостабильной полимеразой, 8 пробирок со стандартными разведениями рекомбинантной ДНК;
• реакционная смесь на одну пробу содержит 9,25 мкл матричной реакционной смеси, 0,75 мкл термостабильной полимеразы, 32,0 мкл деионизированной воды, конечный объем каждой пробы — 50 мкл;
• реакционную смесь разлить в пробирки по 42 мкл на пробу;
• добавить 8 мкл раствора ДНК в следующем порядке — контроль без ДНК, ДНК 0%, ГМО 0,5%, ГМО 100%, исследуемые образцы;
• центрифугировать;
• условия амплификации: 94 °C — 9 мин — 1 цикл, (94 °C 30 с) + (62 °C — 30 с) + (72 °C — 1 мин) — 40 циклов;
• наборы реактивов оптимизированы для работы на амплификаторах типа ABI Prism 7000/7700.

9.3.2 Метод выделения ДНК с применением технологии Wizard, Promega:

• навеску исследуемого продукта массой 100 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
• добавить 300 мкл — буфера I (50 мМ Трис HCl, pH 8,0; 10 мМ ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатической РНКазы свободной от ДНКаз, 3 М гуанидин тиоцианата) при комнатной температуре;
• растереть пробу в пробирке пестиком до гомогенного состояния;
• добавить 400 мкл буфера II (2% додецилсульфат натрия, 0,2М NaOH) и перемешать на вортекс;
• инкубировать при 65 °C 30 мин, перемешать на вортекс, охладить до комнатной температуры;
• добавить 400 мкл буфера III (5М ацетат калия, pH 4,5), перемешать на вортекс 2 мин;
• центрифугировать 10 мин при 13000 об./мин.;
• надосадок отобрать и перенести в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, добавить смолу Wizard MaxiPreps из расчета 100 мкл смолы на 200 мкл надосадочной жидкости и перемешать на вортекс;
• при помощи стерильного шприца емкостью 2 мл прокачать смесь через микроцентрифужную колонку;
• стерильным шприцем емкостью 2 мл прокачать через микроцентрифужную колонку 2 мл промывочного буфера (0,2М NaCl, 20 мМ Трис HCl, pH 8,0, 5мМ ЭДТА смешать в соотношении 5:7 с 96%-м этанолом);
• поместить микроколонку в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
• центрифугировать 1 мин при 13000 об./мин;
• поместить микроколонку в чистую микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл;
• добавить в колонку 100 мкл деионизированной воды, нагретой до 65 °C, центрифугировать 15 с при 13000 об./мин;
• измерить концентрацию раствора ДНК и довести ее до 10 нг/мкл;
• раствор ДНК хранить при минус 20 °C.

9.4. Количественное определение сои линии 40-3-2, кукурузы линий GA 21, MON 810, Т-25, Bt-176, Bt-11 с использованием наборов реагентов GeneScan Analytics GmbH.

9.4.1. Наборы реактивов для определения сои линии 40-3-2, (GMO-Quant Roundup Ready^{\text{тм}} Soy), кукурузы линии Bt-176, (GMOQuant Maximizer^{\text{тм}} Bt 176 CoN), кукурузы линии Bt-11 (GMOQuant Bt-11 Corn), кукурузы линии МО 810 (GMOQuant YieldCard^{\text{тм}} MON 810), кукурузы линии T-25 (GMOQuant LibertyLink^{\text{тм}} T25 Corn), кукурузы линии GA 21, (GMOQuant Roundup Ready^{\text{тм}} GA 21 Corn):

• используется реакционная смесь, позволяющая амплифицировать участок эндогенной ДНК, характерной для кукурузы или сои, и реакционная смесь, позволяющая амплифицировать участок рекомбинантной ДНК;
• каждая реакционная смесь содержит соответствующие праймеры и зонд, меченый флуоресцентным красителем FAM, специфичный для ГМО и VIC, специфичный для сои или кукурузы;
• интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением программного обеспечения приборов.

9.4.2 Метод выделения ДНК с помощью набора реагентов «GENESpin»:

• набор «GENESpin» предназначен для выделения геномной ДНК из пищевых продуктов;
• исследуемый образец пищевого продукта гомогенизировать, добавить лизирующий буфер, содержащий денатурирующие агенты и детергенты;
• лизат центрифугировать;
• добавить связывающий буфер и этанол для создания оптимальных условий осаждения ДНК на фильтре со специально подобранным силикагелем;
• промыть буфером для удаления потенциальных ингибиторов ДНК-полимеразы;
• ДНК элюировать водой или буфером, хранить при минус 20 °C.

9.5. Методы количественного определения сои линии 40-3-2, кукурузы линии MON 810, разработанные ГУ ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН:

9.5.1 Принцип методов:

• для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке, одна реакция позволяет обнаруживать ДНК сои или кукурузы, другая — последовательность, специфичную для сои линии 40-3-2 или кукурузы линии MON 810;
• для обнаружения ДНК сои или кукурузы используется зонд, меченый красителем R6G, для обнаружения генетической конструкции — красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора;
• интенсивность флуоресценции измеряют с помощью приборов типа АНК-32, ABI-PRISM 7000, iCycler iQ и анализируют с применением программного обеспечения приборов;
• определение процентного содержания ГМО осуществляется с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0%) и ДНК ГМО (100%) в определенном процентном соотношении, разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых пробах.

9.5.2 Метод выделения ДНК «Сорб-ГМО»:

• измельченные навески образцов перенести в одноразовые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 или 2,0 мл;
• внести в каждую пробирку по 600 мкл лизирующего буфера и 10 мкл лизирующего реагента, тщательно перемешать, инкубировать 50 — 60 мин при 65 °C, периодически перемешивая на вортекс;
• внести в каждую пробирку по 500 мкл хлороформа, интенсивно перемешать, центрифугировать 10 мин при 12000 — 14000 об./мин;
• верхнюю водную фазу в объеме 300 мкл аккуратно, не захватывая хлороформ и межфазный слой, перенести в пробирку с сорбентом, интенсивно перемешать на вортекс до полного ресуспензирования сорбента, инкубировать при комнатной температуре 10 мин, периодически встряхивая;
• центрифугировать суспензию при 10000 об./мин 1 мин, удалить супернатант;
• добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора А, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента, инкубировать при комнатной температуре 2 — 3 мин, периодически встряхивая;
• центрифугировать при 7000 об./мин 30 с, удалить супернатант;
• добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора Б, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;
• центрифугировать суспензию при 7000 об./мин 30 с, удалить супернатант;
• добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора В, перемешать на вортекс до максимального ресуспензирования сорбента;
• центрифугировать при 7000 об./мин 30 с, удалить супернатант;
• поместить пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре 65 °C на 5 мин для испарения жидкости;
• к сухому осадку добавить 100 мкл ТЕ буфера, перемешать на вортекс, инкубировать 10 мин при температуре 65 °C, перемешивая каждые 2 мин;
• центрифугировать при 12000 — 14000 об./мин 2 мин;
• чистую надосадочную жидкость перенести в чистую пробирку объемом 0,5 — 1,5 мл, не захватывая сорбент.

9.5.3 Порядок проведения исследований:

• взять необходимое количество пробирок с реакционной смесью из тест-системы из расчета N + 8, где N — количество анализируемых образцов;
• после размораживания реакционной смеси центрифугировать пробирки 30 — 60 с при более 4000 об./мин;
• внести в пробирки по 2 мкл исследуемых образцов и в последнюю очередь калибровочных образцов сои или кукурузы в двух повторах, перемешать многократным пипетированием, поместить пробирки в амплификатор;
• программа амплификации для сои: 10 мин/95 °C, 20 с/95 °C, 50 с/62 °C съемка 50 циклов, 25 °C — хранение;
• программа амплификации для кукурузы: 10 мин/95 °C, 20 с/95 °C, 50 с/60 °C съемка 50 циклов, 25 °C — хранение.

9.6. Для определения ГМО растительного происхождения допустимо использование тест-систем с техническими характеристиками, аналогичными указанным выше и разрешенными для использования в установленном порядке.

ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК СОИ (ГЕН ЛЕКТИН)

Продукт ПЦР — 118 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

3. Контроль качества реакционной смеси — ПЦР в отсутствие матричной ДНК.

4 — 7. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из продуктов переработки сои.

ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК КУКУРУЗЫ (ГЕН ЗЕИН)

Продукт ПЦР — 329 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

2 — 5. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян нетрансгенной кукурузы.

6. Контроль качества реакционной смеси — ПЦР в отсутствие матричной ДНК.

Продукт ПЦР — 1 149 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней нетрансгенного картофеля.

Продукт ПЦР — 195 пар нуклеотидов.

1 — 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии 40-3-2.

4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

5. Контроль качества реакционной смеси — ПЦР в отсутствие матричной ДНК.

6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 180 пар нуклеотидов.

1 — 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии 40-3-2.

4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

5. Контроль качества реакционной смеси — ПЦР в отсутствие матричной ДНК.

6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 173 пары нуклеотидов.

1. Контроль качества реакционной смеси — ПЦР в отсутствие матричной ДНК.

2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MON 863.

Продукт ПЦР — 169 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

2. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

3 — 4. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии 40-3-2.

Продукт ПЦР — 185 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., Лаборатория Био-Рад).

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

3 — 6. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из семян сои линии А 2704-12.

Продукт ПЦР — 150 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян сои линии А5547-127.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян нетрансгенной сои.

3. Маркер молекулярной массы (100 п. н., Лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 189 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии Bt-176.

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

Продукт ПЦР — 149 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MON 810.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MON 810.

Продукт ПЦР — 84 пары нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MON 863.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 108 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии NK 603.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 110 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии Bt 11.

Продукт ПЦР — 149 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии Т 25.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 270 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии GA 21.

Продукт ПЦР — 894 пары нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

2. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MIR 604.

4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

Продукт ПЦР — 94 пары нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна нетрансгенной кукурузы.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из зерна кукурузы линии MON 88017.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 110 пар нуклеотидов.

1. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

2 — 3. Продукты ПЦР, полученные на препаратах ДНК из корнеплодов сахарной свеклы линии H7-1.

4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из корнеплодов нетрансгенной сахарной свеклы.

Продукт ПЦР — 88 пар нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян риса линии LL 62.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из семян нетрансгенного риса.

3. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Продукт ПЦР — 102 пары нуклеотидов.

1. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля сорта Рассет Бурбанк Ньюлив.

2. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля сорта Супериор Ньюлив.

3. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля сорта Елизавета 2904/kgs.

4. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней картофеля сорта Луговской 1210 amk.

5. Продукт ПЦР, полученный на препаратах ДНК из клубней нетрансгенного картофеля.

6. Маркер молекулярной массы (100 п.н., лаборатория Био-Рад).

Приложение 22

Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества циклов ПЦР для гена лектина.

Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества циклов ПЦР для рекомбинантной ДНК.

Расчет количества рекомбинантной ДНК.

По кривой амплификации определяется пороговый цикл для каждой ПЦР (Ct). Рассчитывается разность между Ct, специфичным для 35 S промотора, и Ct, специфичным для гена лектина. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:

где \Delta Ctsam — разность между значениями Ct для 35 S промотора и гена лектина в исследуемом образце;

\Delta Ctref — разность между значениями Ct для 35 S промотора и гена лектина в стандартном образце;

c ref — концентрация стандартного образца.

Приложение 23

Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества циклов ПЦР для гена зеина.

Зависимость величины сигнала флуоресценции (Rn) от количества циклов ПЦР для рекомбинантной ДНК.

Расчет количества рекомбинантной ДНК.

По кривой амплификации определяется пороговый цикл для каждой ПЦР (Ct). Рассчитывается разность между Ct, специфичным для 35 S промотора, и Ct, специфичным для гена зеина. Относительное количество рекомбинантной ДНК в пробе определяется по формуле:

где \Delta Ctsam — разность между значениями Ct для 35 S промотора и гена лектина в исследуемом образце;

\Delta Ctref — разность между значениями Ct для 35 S промотора и гена лектина в стандартном образце;

c ref — концентрация стандартного образца.