МУК 4.2.2233-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток и спор Bacillus subtilis 24Д — действующего вещества микробиологического фунгицида «Интеграл» в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 06.08.2007)

6 августа 2007 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК И СПОР BACILLUS SUBTILIS 24Д — ДЕЙСТВУЮЩЕГО ВЕЩЕСТВА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ФУНГИЦИДА «ИНТЕГРАЛ» В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2233-07

1 октября 2007 года

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. № 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

3. Разработаны ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».

4. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций 10 — 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе производственных помещений биотехнологического цеха и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ «Методики выполнения измерений».

2. Биологическая характеристика штамма Bacillus subtilis 24Д

Штамм Bacillus subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) является действующим веществом микробиологического фунгицида «Интеграл». Выделен из растений хлопчатника. Идентифицирован в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины.

Штамм Bacillus subtilis 24Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими свойствами: грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На МПА, сусло-агаре, среде Громыко и картофельном агаре культура растет обильно. На МПА образует складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии неправильной формы. На картофельном агаре — колонии светло-телесного цвета, блестящие, вязкой консистенции края ровные. На сусло-агаре и среде Громыко — колонии телесного цвета, складчатые, с возвышающимся центром, края — изрезанные, консистенция — вязкая.

В мазках 18-часовой культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 1,9 x 0,5 мкм, расположенные одиночно, реже цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры эллипсовидные — 0,9 x 0,5 мкм, в клетке расположены центрально.

Штамм Bacillus subtilis 24Д ферментирует глюкозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты; не разлагает дульцит, рамнозу; дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатин, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат; пропионат не использует. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли-бета-оксимасляной кислоты на МПА с глюкозой; не обладает летициназной активностью; индол и сероводород не образует. Штамм не патогенен.

Штамм Bacillus subtilis 24Д проявляет антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов классов фикомицеты, базидиомицеты класса несовершенных грибов, бактерий родов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas.

Штамм Bacillus subtilis 24Д размножают и хранят на МПА, сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре. Рост при температуре 32 — 34 °C в течение 24 ч.

Для обнаружения штамма применяют посев проб на агаризованные питательные среды с последующим тестированием культуры по типичным морфологическим признакам.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации основан на аспирации микробных клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д из воздуха на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

5.1 Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы <*>

---

<*> Допускается использование аналогичных средств измерений и вспомогательных устройств с техническими характеристиками не ниже, чем у указанных в п. 5.1 данной методики и разрешенных к применению в соответствии с утвержденными в установленном порядке методическими указаниями по методам контроля.

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Термостат электрический суховоздушный ГОСТ 9586-75

Автоклав электрический

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Водяная баня или водяной термостат

Ареометр-сахарометр АСТ 5-15

pH-метр

Газовая горелка или спиртовка лабораторная

Чашки Петри плоскодонные стеклянные, диаметром 10 мм ГОСТ 25336-92

Петли бактериологические

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 29227-91

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 29227-91

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                                   ГОСТ 9586-75
Барометр                                                     ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2 Реактивы, питательные среды и их компоненты <*>

---

<*> Допускается использование питательных сред и их компонентов, изготовленных по другой нормативной документации, при условии аналогичного состава и качественных показателей не ниже, чем у указанных в п. 5.2 данной методики.

Концентрат сусла пивного неохмеленного ТУ 10-04.06.114-88

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Натрия гидроокись, ч. ГОСТ 4328-77

Амфотерицин B ФС 42-2051-99

Мясо-пептонный бульон ГОСТ 20730-75

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны соблюдают правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

• правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу, при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Проведение измерения

8.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова (п. 5, примечание 1) со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время отбора одной пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В период отбора пробы воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или другой стерильной емкости.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора пробы с указанием места, времени и условий отбора.

8.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 — 4-е сут. после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.

Подготавливают питательную среду: сусло-агар или среду Громыко. Сусло-агар готовят по общепринятой методике из концентрата сусла пивного неохмеленного (п. 5.2) путем разбавления его дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10° Баллинга), pH 7,0 — 7,2 (при необходимости pH доводят до необходимого значения путем добавления 10%-го раствора гидроокиси натрия) с добавлением 2,0 — 2,5% агар-агара. Среду Громыко готовят по общепринятой методике из мясо-пептонного бульона и сусла пивного неохмеленного с концентрацией сахаров 7% (7° Баллинга), взятых в соотношении 1:1, с добавлением 2,0 — 2,5% агар-агара, pH-среды 7,0 — 7,2. Общую концентрацию сахаров в сусле определяют по ареометру.

Подготовленную среду расплавляют на водяной бане, остужают до 50 — 60 °C и добавляют в нее раствор амфотерицина B в стерильной дистиллированной воде из расчета 10 мкг амфотерицина В на 1 мл питательной среды для подавления посторонней воздушной микофлоры.

У каждой партии подготовленной питательной среды проверяют ростовые свойства. Используемые питательные среды должны обеспечивать рост микроорганизмов Bacillus subtilis 24Д при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток не позднее 24 ч при температуре 32 — 34 °C.

Готовую питательную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри, установленные на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 30 — 35 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

Культивирование проб воздуха, отобранных согласно п. 8.1, ведут в течение 24 ч при температуре 32 — 34 °C с последующим учетом выросших типичных колоний штамма Bacillus subtilis 24Д. При необходимости выросшую культуру подвергают микроскопической идентификации (окраска мазков — по Граму).

9. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

К = (П x 1000) x С x Т,

где:

К — концентрация штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе, кл./куб. м;

П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

С — скорость аспирации воздуха, л/мин.;

Т — время аспирации, мин.

10. Оформление результатов измерений

Протокол N __ оценки содержания микроорганизма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны

1. <a id="p100090"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________

2. <a id="p100091"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________

3. <a id="p100092"></a>Место отбора пробы (название  и  адрес  организации,   производство,

технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________

---

4. <a id="p100093"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________

5. <a id="p100094"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора  проб

---

6. <a id="p100095"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________

7. <a id="p100096"></a>Количественная  и   качественная   характеристика  выросших  колоний

(количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Граму)

---

8. <a id="p100097"></a>Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ________

---

9. <a id="p100098"></a>Результаты расчета концентрации Bacillus subtilis 24Д ______________

---

10. <a id="p100099"></a>Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК    _______________
                                                    Р.З.

---

11. <a id="p100100"></a>Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) ___________

---

12. <a id="p100101"></a>Идентификация     штамма      и расчет     концентрации   проведены

(Ф.И.О., должность, дата, подпись) ________________________________________

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

---