МУК 4.1.4168-25. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спироксамина в зерне и соломе гороха методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания по методам контроля
(утв. Роспотребнадзором 25.07.2025)
Примечание
Документ введен в действие с 25.10.2025.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 25 июля 2025 года
Дата введения 25 октября 2025 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ СПИРОКСАМИНА В ЗЕРНЕ И СОЛОМЕ ГОРОХА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ МУК 4.1.4168-25
1. Разработаны ФГБОУ ВО РГАУ — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр «Агроэкология пестицидов и агрохимикатов» Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Е.Н. Тестова).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 25 июля 2025 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее — МУК) описывают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ-МС) для определения массовых концентраций спироксамина в зерне гороха в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг и в соломе гороха в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Спироксамин — N-[(8-третбутил-1,4-диоксапиро[4.5]декан-3-ил)метил]-N-этилпропил-1-амин <1>. Брутто-формула: C18H35NO2. Молекулярная масса: 297,5 г/моль.
<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).
2.2 Физические и химические свойства.
Бесцветная или бледно-желтая жидкость без запаха. Давление насыщенного пара при температуре плюс 20 °C: 3,5 мПа. Температура кипения плюс 120 °C (с разложением). Коэффициент распределения в системе октанол/вода при температуре плюс 20 °C и pH 7: КowLogP = 2,89. Растворимость в воде при температуре плюс 20 °C 405 мг/дм3. Растворимость в органических растворителях при температуре плюс 20 °C (г/дм3): ацетон, н-гексан, метанол, толуол — более 200.
В полевых условиях период полураспада (ДТ50) в почве составляет 19 — 146 дней.
2.3 Краткая токсикологическая характеристика.
Острая оральная токсичность для мышей более 460 мг/кг, дермальная токсичность для крыс более 1068 мг/кг, ингаляционная токсичность для крыс (при экспозиции в течение 4 часов) 2770 мг/м3 воздуха.
2.4 Область применения.
Спироксамин — системный фунгицид из группы ингибиторов биосинтеза стеринов. Подавляет возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза и пятнистостей на зерновых злаковых культурах и оидиума на винограде.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении условий проведения анализа и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность <2> (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
<2> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст (далее — ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002).
Диапазон определяемых концентраций спироксамина, значение показателя точности измерений
IV. Метод измерений
4.1. Измерения массовых концентраций спироксамина выполняют методом ВЭЖХ-МС.
4.2. Определение спироксамина в зерне и соломе гороха проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, вымораживания экстракта в морозильной камере и очистки аликвоты экстракта на концентрирующих патронах № 1 с неполярным гидрофобным сорбентом с привитыми октадецильными группами.
4.3 Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы 0,0025 нг.
4.4. Идентификация спироксамина проводится по времени удерживания, наличию характеристичных фрагментарных ионов и соотношению интенсивностей (площадей) пиков этих ионов. Количественное определение спироксамина проводится методом абсолютной калибровки.
4.5. В условиях проведения анализа и методики, изложенной в настоящих МУК, метод специфичен. Специфичность метода достигается за счет использования масс-спектрометрического детектора.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| Хроматограф жидкостной с масс-спектрометрическим детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I), ГОСТ Р 53228-2008 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,3 г, класс точности средний (III), ГОСТ Р 53228-2008 |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-25-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2 и 2-1000-2, ГОСТ 1770-74 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 и 1-2-2-10, ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2, ГОСТ 1770-74 |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Спироксамин аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 95,0% |
| Азот газообразный | Особо чистый, ГОСТ 9293-74 |
| Ацетонитрил | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144-2018 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501-2005 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Калий марганцовокислый | Чистый для анализа, ГОСТ 20490-75 |
| Кальций хлористый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Кислота муравьиная для анализа | Содержание основного вещества не менее 98% |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофобным сорбентом с привитыми октадецильными группами (C18E) с размером частиц 55 мкм (объем 6 см3, масса сорбента 0,5 г) |
| Спирт метиловый (метанол) | Химически чистый, ГОСТ 6995-77 |
| Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей. | |
Вспомогательное оборудование, устройства и материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Аллонж прямой стеклянный | Тип АО, ГОСТ 25336-82 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 Гц |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 20 см3 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В, ГОСТ 25336-82 |
| Колбы конические стеклянные | Тип П или Кн, ГОСТ 25336-82 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К, Гр или О, ГОСТ 25336-82 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 100 мм x 4,6 мм, размер частиц 3,5 мкм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум до 10 мбар |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсатором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур плюс 20 — 100 °C |
| Предколонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 12,5 мм x 2,1 мм, размер частиц 5 мкм |
| Стаканы лабораторные стеклянные | Тип В, номинальная вместимость 100 — 800 см3, ГОСТ 25336-82 |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры обеззоленные нейтральные быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Холодильная/морозильная камера | ГОСТ 26678-85 |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3, ГОСТ 22967-90 |
| Примечание: допускается использование вспомогательного оборудования, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2017, а также требования, изложенные в технической документации на комплекс жидкостного хроматографа с масс-спектрометрическим детектором.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009-83. Организуется обучение работников безопасности труда.
6.3. Работа с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <3>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<3> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Ростехнадзора от 15.12.2020 № 536 (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).
6.4. Измерения в соответствии с настоящими МУК может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором проводят в условиях, рекомендованных технической документацией на прибор.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения спироксамина на концентрирующих патронах, установление градуировочной характеристики.
8.2 Подготовка и очистка органических растворителей.
8.2.1 Ацетонитрил.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,0 — 82,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,0 — 82,0 °C, отбрасывают.
8.2.2 Бидистиллированная вода.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов. Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 99,5 — 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 99,5 — 100,0 °C, отбрасывают.
8.3 Приготовление рабочих растворов.
8.3.1 Приготовление компонента A подвижной фазы.
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки бидистиллированной водой. Получают 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты, который используют как компонент подвижной фазы A. Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более пяти дней.
8.3.2 Приготовление компонента B подвижной фазы.
В мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 500 см3 метанола, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем доводят до метки метанолом. Получают 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле, который используют как компонент подвижной фазы B. Приготовленный раствор хранят при комнатной температуре не более пяти дней.
8.3.3 Приготовление 0,2%-го водного раствора муравьиной кислоты.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,2 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем в колбе доводят до метки бидистиллированной водой. Раствор используют при очистке экстракта на концентрирующих патронах № 1 и готовят непосредственно перед использованием.
8.3.4. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 ацетонитрила, прибавляют 0,1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают, объем в колбе доводят до метки ацетонитрилом. Раствор используют при очистке экстракта на концентрирующих патронах № 1 и готовят непосредственно перед использованием.
8.3.5. Приготовление смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1 (по объему).
В коническую колбу объемом 250 см3 помещают 100 см3 метанола, 100 см3 бидистиллированной воды, 0,2 см3 муравьиной кислоты и перемешивают. Раствор используется для приготовления градуировочных стандартов и разведения проб и хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
8.4 Приготовление растворов аналитического стандарта спироксамина.
8.4.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией спироксамина 100,0 мкг/см3.
Взвешивают (0,0100 +/- 0,0010) г спироксамина в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в метаноле и объем в колбе доводят до метки метанолом при перемешивании. Полученный стандартный раствор № 1 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
8.4.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией спироксамина 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и объем в колбе доводят до метки метанолом при перемешивании. Полученный стандартный раствор № 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
8.4.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией спироксамина 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и объем в колбе доводят до метки метанолом при перемешивании. Стандартный раствор № 3 используют для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
8.4.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией спироксамина 100,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 4 используют для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
8.4.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией спироксамина 20,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 2,0 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 5 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
8.4.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией спироксамина 10,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 4 отбирают пипеткой 2,5 см3, помещают в мерную колбу объемом 25 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 6 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
8.4.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией спироксамина 5,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 5,0 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 7 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
8.4.8. Стандартный раствор № 8 с концентрацией спироксамина 2,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 2,0 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 8 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
8.4.9. Стандартный раствор № 9 с концентрацией спироксамина 1,0 нг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 1,0 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 9 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
8.4.10. Стандартный раствор № 10 с концентрацией спироксамина 0,5 нг/см3.
Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 5,0 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3. Объем в колбе доводят до метки смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и перемешивают. Стандартный раствор № 10 используют для установления градуировочной характеристики и хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C в течение 30 дней.
8.4.11. Стандартные растворы спироксамина с концентрацией 1,0; 0,5; 0,25; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы матриц.
Методом последовательного разведения метанолом из стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,25; 0,2; 0,1; 0,05 и 0,01 мкг/см3, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы зерна и соломы гороха. Стандартные растворы для внесения хранят в холодильнике при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
8.5. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
8.5.1 Установление градуировочной характеристики.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость отклика фрагментарного иона, используемого для количественного определения, от концентрации спироксамина в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 6 растворам для градуировки с концентрацией 0,5; 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 нг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 5 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 10.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
Производят расчет параметров градуировочной характеристики (при помощи программного обеспечения): формулы зависимости отклика фрагментарного иона от концентрации спироксамина в растворе, коэффициента корреляции, который должен быть не менее 0,995, и регрессионных остатков, которые не должны превышать 20% для каждого уровня градуировочной характеристики.
Если линейность градуировочной характеристики была продемонстрирована, то при анализе серий образцов допускается устанавливать градуировочную характеристику методом абсолютной калибровки при однократном измерении по 5 и более уровням концентраций, охватывающим весь диапазон измерений. Данные для построения градуировочной зависимости набираются перед началом серии анализов и после ее окончания (рамочная калибровка; не менее 10 измерений не менее чем по пяти уровням концентраций). По полученным данным производят расчет параметров градуировочной характеристики. Рекомендуется в серию анализов образцов включать не более 12 инъекций.
8.5.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики <4>.
<4> Примечание: в случае, если градуировочная характеристика устанавливается при анализе каждой серии образцов по п. 8.5.1, контроль стабильности градуировочной характеристики не проводится.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание спироксамина в которых должно охватывать весь диапазон концентраций градуировочной характеристики.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1):
\frac{|X - C| \times 100}{C} \leq 20, (1)
где: X — концентрация спироксамина контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора спироксамина в смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см3;
20 — допустимая величина расхождения градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спироксамина, предусмотренных настоящими МУК. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 8.5.1.
8.6. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения спироксамина на них.
8.6.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 см3 смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.
8.6.2. Проверка хроматографического поведения спироксамина на концентрирующих патронах № 1.
В стеклянную виалу объемом 20 см3 вносят 5 см3 стандартного раствора спироксамина с концентрацией 0,01 мкг/см3 в ацетонитриле, прибавляют 5 см3 0,2%-го водного раствора муравьиной кислоты, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3 и упаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Виалу обмывают тремя порциями 0,1%-й муравьиной кислоты в ацетонитриле объемом по 5 см3 каждая и последовательно вносят их на патрон. Каждую порцию собирают в отдельную отгонную колбу объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 10 см3 смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5, и анализируют на содержание спироксамина в условиях согласно п. 10.3.
Определяют фракции, содержащие спироксамин, полноту смывания с концентрирующего патрона и необходимый объем элюентов.
Проверку хроматографического поведения спироксамина на концентрирующих патронах № 1 следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.
8.7. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 40 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой (смесь компонентов A и B, приготовленных по п. 8.3, в соотношении 70:30), при скорости подачи растворителя 0,4 см3/мин.
IX. Отбор и хранение проб
9.1. Отбор проб производится в соответствии с документами по стандартизации <5>, а также методическими документами <6>.
<5> ГОСТ 28674-2019 «Горох. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 15.10.2019 № 998-ст; ГОСТ 13586.3-2015 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб», введенный приказом Росстандарта от 31.08.2015 № 1236-ст; ГОСТ ISO 6497-2014 «Корма. Отбор проб», введенный в действие приказом Росстандарта от 18.05.2016 № 353-ст.
<6> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79; Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Общая часть, утвержденные Научно-техническим советом Минсельхоза России, протокол от 08.05.2024 № 12.
9.2. Отобранные пробы зерна и соломы гороха подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов, и (или) в соответствии с нормативно-технической документацией на продукт.
X. Выполнение измерений
10.1 Зерно гороха.
10.1.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна гороха массой (5 +/- 0,3) г помещают в плоскодонную стеклянную колбу объемом 100 см3, прибавляют 25 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в мерный цилиндр объемом 50 см3 через бумажный фильтр низкой плотности «красная лента». Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 25 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют с предыдущим в мерном цилиндре объемом 50 см3. Объем экстракта в мерном цилиндре доводят ацетонитрилом до метки 50 см3.
10.1.2 Очистка экстракта вымораживанием.
Экстракт переносят в плоскодонную колбу объемом 100 см3, перемешивают и помещают на 30 минут в морозильную камеру (температура не выше минус 18 °C). По истечении времени охлажденный экстракт фильтруют в плоскодонную колбу объемом 100 см3 через бумажный фильтр низкой плотности «красная лента» и выдерживают при комнатной температуре в течение 40 — 60 минут. Затем отбирают аликвоту экстракта объемом 5 см3 (1/10 часть по объему), помещают в стеклянную виалу объемом 20 см3 и проводят очистку на концентрирующих патронах № 1.
10.1.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
К аликвоте экстракта объемом 5 см3 (1/10 часть) прибавляют 5 см3 0,2%-го водного раствора муравьиной кислоты, перемешивают и вносят на подготовленный по п. 8.6.1 концентрирующий патрон № 1. Элюат отбрасывают.
Виалу последовательно обмывают двумя порциями 0,1%-й муравьиной кислоты в ацетонитриле объемом по 5 см3 каждая и вносят их на патрон. Элюаты собирают, объединяют в отгонной колбе объемом 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
10.1.4. Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5. Затем пробу переносят в виалу объемом 2 см3 и анализируют на содержание спироксамина в условиях согласно п. 10.3.
10.2 Солома гороха.
10.2.1 Экстракция.
Образец измельченной соломы гороха массой (2 +/- 0,3) г помещают в плоскодонную стеклянную колбу объемом 100 см3, прибавляют 25 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в мерный цилиндр объемом 50 см3 через бумажный фильтр низкой плотности «красная лента». Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 25 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют с предыдущим в мерном цилиндре объемом 50 см3. Объем экстракта в мерном цилиндре доводят ацетонитрилом до метки 50 см3.
Далее проводят очистку экстракта в соответствии с пп. 10.1.2 и 10.1.3.
Сухой остаток после очистки растворяют в 10 см3 смеси метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5. Затем пробу переносят в виалу объемом 2 см3 и анализируют на содержание спироксамина в условиях согласно п. 10.3.
10.3 Хроматографические и масс-спектрометрические условия.
10.3.1. Измерения выполняют на жидкостном хроматографе с тандемным масс-спектрометрическим детектором типа тройной квадруполь при следующих режимных параметрах <7>.
<7> Примечание: параметры хроматографирования и масс-спектрометрические условия могут различаться в зависимости от марки и модели прибора.
10.3.2 Хроматографические условия:
- колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18;
- предколонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18;
- температура колонки плюс 40 °C;
- объем вводимой пробы 5 мм3;
- скорость потока элюента 0,4 см3/мин;
- подвижная фаза: компонент A — 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты (приготовлен по п. 8.3.1), компонент B — 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле (приготовлен по п. 8.3.2);
- режим элюирования градиентный, приведен в табл. 10.1.
Градиентный режим элюирования при определении спироксамина
| Время (минуты) | Компонент A, % | Компонент B, % |
|---|---|---|
| 0 | 70 | 30 |
| 4 | 0 | 100 |
| 8 | 0 | 100 |
| 8.1 | 70 | 30 |
| 15 | 70 | 30 |
10.3.3 Масс-спектрометрические условия:
- источник ионов — электроспрей;
- газ-осушитель — азот с температурой плюс 300 °C, расход 10 м3/мин;
- расход газа периферийного слоя 11 м3/мин;
- температура газа периферийного слоя плюс 300 °C;
- давление в распылителе 241,3 кПа;
- напряжение на входе в капилляр 1300 В;
- режим ионизации положительный;
- режим сканирования — мониторинг множественных реакций (англ. multiple reaction monitoring, MRM).
- 298,3 \rightarrow 144,1 — количественный переход, энергия соударения 20 В;
- 298,3 \rightarrow 100,1 — качественный переход, энергия соударения 30 В.
Энергия фрагментации 132 В, время сканирования 200 мс, напряжение на ускорителе ячейки 5 В.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартные растворы спироксамина с концентрацией 20,0 нг/см3, соответственно разбавляют смесью метанола с водой и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:0,1, приготовленной по п. 8.3.5 (не более чем в 50 раз). В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания спироксамина в пробах.
XI. Обработка результатов анализа
11.1. Концентрацию спироксамина в пробах (X1, мг/кг) рассчитывают по формуле (2) <8> без учета полноты извлечения вещества из проб:
X_{1} = \frac{A \cdot V \cdot K \cdot K_{\text{р}}}{m \cdot 1000} , (2)
где: A — концентрация спироксамина в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площадей хроматографических пиков, нг/см3;
V — объем раствора, подготовленного для хроматографирования, см3 (для зерна гороха равен 5 см3, для соломы гороха равен 10 см3);
m — масса анализируемого образца, г;
K — коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа (для зерна и соломы гороха K = 10);
1000 — коэффициент перевода нг/см3 в мг/кг;
Kр — коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).
<8> Примечание: идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.
11.2 Проверка приемлемости результатов параллельных определений.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости, формула (3):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (3)
где: X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 13.1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов измерений
12.1 Результат анализа представляют в виде формулы 4:
(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг, при вероятности P = 0,95, (4)
где: \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг, рассчитанная по формуле (5):
\Delta = \delta \cdot \overline{X}/100, (5)
где: \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 3.1), %.
Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «Содержание спироксамина в зерне гороха менее 0,01 мг/кг, в соломе гороха — менее 0,05 мг/кг» <9>.
<9> Примечание: 0,01 мг/кг и 0,05 мг/кг — пределы количественного определения концентрации спироксамина в зерне и соломе гороха соответственно.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с документами по стандартизации <10>.
<10> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002; ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике», введенный в действие постановлением Госстандарта России от 23.04.2002 № 161-ст.
Периодичность и формы контроля определяются системой менеджмента качества лаборатории.
13.2. Показатели повторяемости и воспроизводимости, пределы повторяемости и воспроизводимости при P = 0,95 приведены в табл. 13.1.
Метрологические характеристики
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением.
3. ГОСТ Р 8.563-2009 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
4. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
5. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
6. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».
7. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений».
8. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений».
9. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
10. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
11. ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
12. ГОСТ 12.1.004-91 «Пожарная безопасность. Общие требования».
13. ГОСТ 12.4.009-83 «Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
14. ГОСТ 12.0.004 «Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
15. ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
16. ГОСТ OIML R 111-1-2009 «Гири классов E1, E2, F1, F2, M1, M1-2, M2, M2-3 и M3. Часть 1. Метрологические и технические требования».
17. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
18. ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
19. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
20. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
21. ГОСТ Р 58144-2018 «Вода дистиллированная. Технические условия».
22. ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
23. ГОСТ 5556-81 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
24. ГОСТ 22967-90 «Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний».
25. ГОСТ 9293-74 «Азот газообразный и жидкий. Технические условия».
26. ГОСТ 20490-75 «Калий марганцовокислый. Технические условия».
27. ГОСТ 6995-77 «Метанол-яд. Технические условия».
28. ГОСТ 28674-2019 «Горох. Технические условия».
29. ГОСТ 13586.3-2015 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
30. ГОСТ Р ИСО 6497-2014 «Корма. Отбор проб».
31. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.
32. Методические указания по регистрационным испытаниям пестицидов в части биологической эффективности. Общая часть.