МУК 4.1.4073-24. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуазаиндолизина и его метаболитов (IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31) в плодоовощной продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания по методам контроля
(утв. Роспотребнадзором 25.12.2024)
Примечание
Документ введен в действие с 25.03.2025.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 25 декабря 2024 года
Дата введения 25 марта 2025 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУАЗАИНДОЛИЗИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТОВ (IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31) В ПЛОДООВОЩНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ МУК 4.1.4073-24
1. Разработаны ФБУН «ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (С.В. Кузьмин, Н.Е. Федорова, С.Д. Добрев, А.А. Ивченкова).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 25 декабря 2024 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания по методам контроля (далее — МУК) описывают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (далее — МС/МС) для определения массовой концентрации флуазаиндолизина и его метаболитов (IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31) в плодоовощной продукции (в плодоносящих овощах (бахчевых культурах), например, в томатах, перце, огурцах, тыкве, арбузе; корнеплодах и клубнеплодах, например, в картофеле, моркови, редисе; в листовых овощах, например, в сельдерее, капусте, листовом салате, в ягодах — земляника) в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг без учета разбавления и 0,01 — 10,00 мг/кг с учетом разбавления в 100 раз.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1. Флуазаиндолизин — 8-хлор-N-((2-хлор-5-метоксифенил)сульфонил)-6-(трифторметил)имидазол(1,2-a)пиридин-2-карбоксамид <1>. Брутто-формула C16H10Cl2F3N3O4S. Молекулярная масса 468,2.
<1> В соответствии с классификацией Международного союза теоретической и прикладной химии (ИЮПАК) (англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC) (далее — ИЮПАК).
2.2 Физические и химические свойства флуазаиндолизина.
Белый порошок. Температура плавления плюс 218,5 °C. Температура деградации плюс 260 °C. Коэффициент распределения н-октанол/вода: Kow logP = минус 0,16 (при pH = 7, температуре плюс 25 °C). Плотность 0,619 г/кг. Растворимость в воде 2,148 г/дм3 (при температуре плюс 20 °C). Растворимость в органических растворителях (в г/дм3 при температуре плюс 20 °C): ацетонитрил — 35,05, метанол — 3,4, ацетон — 99,76, этилацетат — 27,62.
2.3 Краткая токсикологическая характеристика.
Острая пероральная токсичность (ЛД50) для крыс (самки) 1187 мг/кг, острая дермальная токсичность (ЛД50) для крыс (самцы, самки) > 5000 мкг/кг. Острая ингаляционная токсичность (ЛК50) для крыс (самцы, самки) > 5800 мг/м3 (экспозиция 4 часа).
2.4 Область применения.
2.5. IN-F4106 — метаболит флуазаиндолизина. 2-Хлор-метоксибензолсульфонамид <2>. Брутто-формула C7H8ClNO3S. Молекулярная масса 221,66.
2.6. IN-A5760 — метаболит флуазаиндолизина. 2-Хлор-5-гидроксибензолсульфонамид <3>. Брутто-формула C6H6ClNO3S. Молекулярная масса 207,64.
2.7. IN-UNS90 — метаболит флуазаиндолизина. Калиевая соль 3-[[(2-Хлор-5-гидроксифенил)сульфонил]амино]-(2R)-гидроксипропановой кислоты <4>. Брутто-формула C9H9ClNO6SK. Молекулярная масса 333,8.
2.8. IN-TMQ-01 — метаболит флуазаиндолизина. 3-[[(2-Хлор-5-метоксифенил)сульфонил]амино]-(2R)-гидроксипропановая кислота, калиевая соль <5>. Брутто-формула C10H11ClNO6SK. Молекулярная масса 347,8.
2.9. IN-QZY47 — метаболит флуазаиндолизина. 3-[[(2-Хлор-5-метоксифенил)сульфонил]амино]-L-аланин гидрохлорид <6>. Брутто-формула C10H14ClN2O5SCl. Молекулярная масса 345,2.
2.10. IN-UJV12 — метаболит флуазаиндолизина. 3-[[(2-Хлор-5-гидроксифенил)сульфонил]амино]-L-аланина гидрохлорид <7>. Брутто-формула C9H12ClN2O5SCl. Молекулярная масса 331,2.
2.11. IN-QEK31 — метаболит флуазаиндолизина. 3-[[(2-Хлор-5-гидроксифенил)сульфонил]амино]-L-аланина гидрохлорид <8>. Брутто-формула C9H4ClF3N2O2. Молекулярная масса 264,6.
III. Погрешность измерений
3.1. При соблюдении условий проведения анализа и методики, изложенной в настоящих МУК, погрешность <9> (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 3.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
<9> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст (далее - ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002).
Метрологические характеристики
IV. Метод измерений
4.1. Методика основана на определении флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 с использованием ВЭЖХ-МС/МС.
4.2. Экстракцию флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 из образцов выполняют метанолом.
4.3 Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы — 25 пг.
4.4. Количественное определение проводится методом матричной калибровки.
V. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование, устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Весы лабораторные аналитические | Предел допустимой погрешности не более +/- 0,0005 г, ГОСТ Р 53228-2008 |
| Весы лабораторные общего назначения | Предел допустимой погрешности нс более +/- 0,01 г, ГОСТ Р 53228-2008 |
| Дозаторы лабораторные одноканальные механические 0,5 — 10, 10 — 100, 100 — 1000 мм3 | Внесено в Реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором: тройной квадруполь, снабженный автоматическим пробоотборником и термостатом колонки | Внесено в Реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Колбы мерные | 2-го класса точности 2-(10, 100, 500)-2, ГОСТ 1770-74 |
| Меры массы | ГОСТ OIML R 111-1-2009 |
| Пипетки градуированные | Тип (1, 2, 3, 5)-(1, 2)-2-(1, 10), ГОСТ 29227-91 |
| Приборы для измерения атмосферного давления, температуры и относительной влажности воздуха | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками. | |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Флуазаиндолизин | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-F4106 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-A5760 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-UNS90 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-TMQ-01 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-QZY47 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-UJV12 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Метаболит флуазаиндолизина IN-QEK31 | Аналитический стандартный образец с содержанием основного компонента не менее 95% |
| Азот/Аргон | В зависимости от требований производителя масс-спектрометра |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Чистота не менее 99,9% |
| Вода для лабораторного анализа (деионизованная) | ГОСТ Р 52501-2005 |
| Магний сернокислый (сульфат магния) | Безводный химически чистый |
| Метанол | Химически чистый, ГОСТ 6995-77 |
| Муравьиная кислота | Концентрация не менее 99,7%, чистая для анализа, ГОСТ 5848-73 |
| Натрий сульфат (сульфат натрия) | Безводный химически чистый, ГОСТ 4166-76 |
| Натрий хлористый (хлорид натрия) | Химически чистый, ГОСТ 4233-77 |
| Примечание: допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующей дополнительной очистки растворителей. | |
Вспомогательное оборудование, устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
| 1 | 2 |
| Шейкер — вихревой | Диапазон регулировки оборотов до 3000 об/мин, орбита до 10 мм |
| Виалы стеклянные с крышками и септами | Объем 2 см3 |
| Мельница лабораторная (гомогенизатор) | - |
| Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками | Вместимостью 15, 50 см3 |
| Фильтры мембранные | Для фильтрации проб с помощью шприца, размер пор 0,45 мкм, мембрана — политетрафторэтилен (ПТФЭ) |
| Холодильник/морозильник бытовой | Поддерживающая температуру плюс 2 — 6 °C для холодильной камеры и температуру не выше минус 18 °C для морозильной камеры, ГОСТ 26678-85 |
| Хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2 мм, модифицированная полярная C18 с TMS (триметилсиланол) эндкеппингом, зернением 4 мкм | - |
| Центрифуга лабораторная, роторная | Скорость вращения не менее 3000 об/мин |
| Шприцы медицинские однократного применения | Вместимостью 2 см3, ГОСТ ISO 7886-1-2011 |
| Примечание: допускается использование вспомогательного оборудования, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
VI. Требования безопасности
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2017, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостные хроматографы с масс-спектрометрическим детектированием.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения в соответствии с ГОСТ 12.4.009-83. Организуется обучение работников безопасности труда.
6.3. Работа с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), осуществляется в соответствии с законодательством Российской Федерации <10>. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив в нем понижающий редуктор.
<10> Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением, утвержденные приказом Федеральной службы по экологическому, технологическому и атомному надзору от 15.12.2020 № 536 (зарегистрирован Минюстом России 31.12.2020, регистрационный № 61998).
6.4. Измерения в соответствии с настоящими МУК может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе с масс-спектрометрическим детектором, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
VII. Условия измерений
7.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C и относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на высокоэффективном жидкостном хромато-масс-спектрометре проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
VIII. Подготовка к выполнению измерений
8.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: приготовление растворов, градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы, установление градуировочных характеристик, приготовление смеси солей для экстракции и смеси солей и сорбентов для очистки экстрактов, подготовка проб к анализу.
8.2. Приготовление компонента А подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 500 см3 добавляют 200 см3 деионизованной воды, вносят 0,5 см3 муравьиной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор муравьиной кислоты с концентрацией 0,1%. Хранят при комнатной температуре в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.
8.3. Приготовление раствора ацетонитрил — вода в соотношении 80:20. В колбу вместимостью 500 см3 добавляют 400 см3 ацетонитрила и 100 см3 деионизованной воды. Получают раствор с объемным соотношением компонентов 80:20. Хранят при комнатной температуре не более месяца.
8.4 Кондиционирование хроматографической колонки.
Промывают колонку подвижной фазой при соотношении компонентов А и Б (компонент А приготовлен в соответствии с п. 8.2, компонент Б — ацетонитрил) 90:10 по объему и скорости подачи растворителя 0,4 см3/мин не менее 20 минут.
8.5 Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения.
8.5.1. Исходные растворы флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 для градуировки (концентрация 1000 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 10 см3 раздельно для каждого компонента помещают по (0,0100 +/- 0,0005) г флуазаиндолизина или метаболитов, добавляют 5 — 7 см3 раствора ацетонитрил — вода в объемном соотношении 80:20 (см. п. 8.3), перемешивают, доводят тем же раствором до метки, вновь перемешивают. Растворы готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой таре в морозильной камере при температуре не выше минус 16 °C не более 12 месяцев.
Раствор № 1 (Микс 1) для градуировки, концентрацией 10 мкг/см3 каждого компонента, готовят объемным методом путем смешивания и разбавления исходных растворов для градуировки.
8.5.2. Раствор № 1 (Микс 1) для градуировки (концентрация 10 мкг/см3 каждого компонента). В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают по 0,1 см3 исходного раствора каждого вещества с концентрацией 1000 мкг/см3 (см. п. 8.5.1), доводят раствором ацетонитрил — вода в объемном соотношении 80:20 (см. п. 8.3) до метки, перемешивают. Раствор готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой стеклянной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 16 °C не более 1 месяца.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов методом «добавок».
8.5.3. Раствор № 2 (Микс 2) для градуировки (концентрация 1 мкг/см3 каждого компонента). В мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора № 1 (Микс 1) с концентрацией каждого компонента 10 мкг/см3 (см. п. 8.5.2), доводят раствором ацетонитрил — вода в объемном соотношении 80:20 (см. п. 8.3) до метки, перемешивают. Раствор хранят в герметично закрытой стеклянной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 16 °C не более 1 недели.
Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов методом «добавок».
8.6. Рабочие растворы № 3 — 8 для градуировки (концентрация 0,005 — 0,125 мкг/г). Для приготовления матричных градуировочных растворов отбирают 6 навесок холостого образца репрезентативной культуры по 10 г в полипропиленовые пробирки, вместимостью 50 см3. В пробирки помещают по 0,05; 0,1 см3 градуировочного раствора № 2 (Микс 2) с концентрацией 1,0 мкг/см3 каждого компонента (см. п. 8.5.3) и 0,025; 0,05; 0,1 и 0,125 см3 градуировочного раствора № 1 (Микс 1) с концентрацией 10,0 мкг/см3 каждого компонента (см. п. 8.5.2). Проводят пробоподготовку в соответствии с п. 10.1, получают матричные градуировочные растворы № 3 — 8 с концентрацией 0,005; 0,01; 0,025; 0,05; 0,1 и 0,125 мкг/г каждого компонента соответственно <11>.
<11> Примечание: для уменьшения объема используемого матричного градуировочного раствора допускается применение стеклянных вставок в виалы объемом 150 — 400 мм3. Репрезентативными культурами являются: плодоносящие овощи (бахчевые культуры), например, томаты, перец, арбуз; корнеплоды и клубнеплоды, например, картофель, морковь; листовые — капуста; ягодные — земляника.
Матричные градуировочные растворы готовят при температуре плюс 20 °C и хранят в герметично закрытой стеклянной таре в морозильной камере при температуре не выше минус 16 °C не более недели.
8.7. Установление градуировочных характеристик. Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика от концентрации флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 в образце (мкг/г) устанавливают методом матричной градуировки.
В инжектор хроматографа вводят по 5 мм3 каждого градуировочного раствора (см. п. 8.6) и анализируют в условиях хроматографирования (см. п. 10.2). Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31.
8.8. Контроль стабильности градуировочных характеристик. Контроль стабильности градуировочных характеристик проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
Проводят измерения не менее двух образцов рабочих растворов для градуировки растворов, содержание анализов в которых соответствует диапазону концентраций от 0,005 до 0,125 мкг/г.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение (1), (2):
A = \frac{|X - C|}{C} \times 100; (1)
где: A — величина расхождения, %;
X — концентрация флуазаиндолизина или его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 в пробе при контрольном измерении, мкг/г;
C — известная концентрация градуировочного раствора, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/г;
B — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, % (равен 20% при P = 0,95).
Если величина расхождения (A) превышает 20%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31, предусмотренными настоящими МУК. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново в соответствии с п. 8.7.
IX. Отбор и условия хранения проб
9.1. Отбор проб осуществляется в соответствии с методическими документами <12>, а также документами по стандартизации <13>.
<12> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
<13> ГОСТ 32284-2013 «Морковь столовая свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 17.12.2013 № 2281-ст; ГОСТ 34325-2017 «Перец сладкий свежий. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 14.12.2017 № 1978-ст; ГОСТ 33953-2016 «Земляника свежая. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 29.11.2016 № 1851-ст; ГОСТ 33932-2016 «Огурцы свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 29.11.2016 № 1849-ст; ГОСТ 34298-2017 «Томаты свежие. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 14.12.2017 № 1956-ст; ГОСТ 7975-2013 «Тыква продовольственная свежая. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 05.12.2013 № 2198-ст; ГОСТ 7176-2017 «Картофель продовольственный. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 28.11.2017 № 1843-ст; ГОСТ 7177-2022 «Арбузы продовольственные свежие. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 30.05.2022 № 425-ст; ГОСТ 34216-2017 «Редис свежий. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 14.12.2017 № 1970-ст; ГОСТ Р 51809-2001 «Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 12.09.2001 № 382-ст; ГОСТ 33985-2016 «Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 31.10.2016 № 1528-ст; ГОСТ 34320-2017 «Сельдерей свежий. Технические условия», введенный приказом Росстандарта от 12.12.2017 № 1925-ст.
9.2. Образцы плодоовощной продукции, не имеющие следов порчи, можно хранить при температуре плюс 2 — 6 °C в течение недели, для более продолжительного срока образцы хранят при температуре не выше минус 16 °C.
X. Выполнение определения
10.1. Навеску измельченной пробы массой 10 г помещают в центрифужную полипропиленовую пробирку вместимостью 50 см3. Добавляют к пробам 10 см3 метанола, ставят на вихревой шейкер на 15 минут.
Образец центрифугируют 5 минут при скорости вращения не менее 3000 об/мин.
Отбирают не менее 3 см3 экстракта (верхний слой в пробирке после центрифугирования) в чистую полипропиленовую пробирку объемом 15 см3 и вымораживают не менее 6 часов при температуре не выше минус 16 °C.
Вымороженный экстракт фильтруют через мембранный шприцевой фильтр (размер пор не более 0,45 мкм) в стеклянную хроматографическую виалу и анализируют в условиях хроматографирования (см. п. 10.2).
10.2. Условия хроматографирования. Измерения выполняют методом ВЭЖХ-МС/МС: тройной квадруполь с источником ионизации при следующих режимных параметрах <14>:
- режим ионизации: электроспрей (англ. Electrospray Ionization, ESI), электростатическое напряжение плюс 5500 В;
- полярность: положительная;
- режим работы: мониторинг множественных реакций (англ. Multiple Reaction Monitoring, далее — MRM), параметры масс-спектрометрического детектора приведены в табл. 10.1;
- скорость сканирования: 100 мс;
- давление газовой завесы: 25 psi;
- давление газа 1: 50 psi;
- давление газа 2: 70 psi;
- температура осушающего газа: плюс 400 °C.
<14> Примечание: параметры масс-спектрометрического детектора могут различаться в зависимости от марки и модели прибора.
Параметры масс-спектрометрического детектора
| Наименование аналита | Материнский ион, масса/заряд (m/z) | Напряжение на фрагментаторе/Потенциал декластеризации (DP), В | Дочерний ион, масса/заряд (m/z) | Энергия соударения (CE), В |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| Флуазаиндолизин | 466 | 50 | 157 <*> | 27 |
| 466 | 50 | 142 | 36 | |
| IN-A5760 | 206 | 70 | 142 <*> | 15 |
| 206 | 70 | 106 | 15 | |
| 206 | 70 | 122 | 14 | |
| IN-F4106 | 220 | 30 | 156 <*> | 15 |
| 220 | 30 | 78 | 22 | |
| 220 | 30 | 141 | 18 | |
| IN-UNS90 | 294 | 30 | 206 <*> | 19 |
| 294 | 30 | 78 | 32 | |
| 294 | 30 | 142 | 29 | |
| IN-TMQ-01 | 308 | 70 | 220 <*> | 18 |
| 308 | 70 | 141 | 29 | |
| 308 | 70 | 156 | 25 | |
| IN-QZY47 | 307 | 90 | 220 <*> | 17 |
| 307 | 90 | 141 | 30 | |
| 307 | 90 | 156 | 26 | |
| IN-UJV12 | 293 | 60 | 206 <*> | 18 |
| 293 | 60 | 78 | 29 | |
| 293 | 60 | 142 | 26 | |
| IN-QEK31 | 265 | 50 | 184 <*> | 35 |
| 265 | 50 | 157 | 42 | |
| 265 | 50 | 219 | 29 | |
| Примечание: <*> — MRM переходы для количественного расчета. | ||||
- хроматографическая колонка стальная, длиной 50 мм, внутренним диаметром 2 мм, модифицированная полярная C18 с TMS (триметилсиланол) эндкеппингом, зернением 4 мкм;
- температура колонки: плюс 40 °C;
- скорость потока элюента: 0,3 см3/мин;
- объем вводимой пробы: 5 мм3;
- подвижная фаза: компонент А: 0,1% муравьиная кислота (см. п. 8.2); компонент Б: ацетонитрил.
Режим элюирования: градиентный, приведен в табл. 10.2.
| Компонент А, % | Суммарный расход элюентов, см3/мин | Время, мин |
|---|---|---|
| 95 | 0,3 | 0 |
| 95 | 0,3 | 2,0 |
| 5 | 0,3 | 7,0 |
| 5 | 0,3 | 11,0 |
| 95 | 0,3 | 12,0 |
| 95 | 0,3 | 15,0 |
Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,1 мкг/г, разбавляют ацетонитрилом (не более чем в 100 раз).
XI. Обработка результатов анализа
11.1. Содержание флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 в плодоовощной продукции (Xп, мг/кг) рассчитывают по формуле (3):
где: Cп — концентрация вещества, полученная по градуировочному графику в соответствии с площадью хроматографического пика, мкг/г;
Kрп — коэффициент разбавления (если экстракт подвергался разбавлению).
Для выражения содержания метаболита IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 в эквиваленте действующего вещества полученное содержание IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12 или IN-QEK31 умножают соответственно на коэффициент, равный соотношению молекулярных масс действующего вещества и метаболита:
- IN-F4106 468,2/221,7 = 2,1;
- IN-A5760 468,2/207,6 = 2,3;
- IN-UNS90 468,2/294,7 = 1,6;
- IN-TMQ-01 468,2/308,7 = 1,5;
- IN-QZY47 468,2/308,7 = 1,5;
- IN-UJV12 468,2/294,7 = 1,6;
- IN-QEK31 468,2/264,6 = 1,8.
При необходимости представления результата в виде содержания флуазаиндолизина с учетом его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31, выраженное в эквиваленте действующего вещества — флуазаиндолизина, результаты суммируют.
11.2 Проверка приемлемости результатов параллельных определений.
За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости и удовлетворяет условие (4):
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (4)
где: X1, X2 — результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 3.1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .
При невыполнении условия (4) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
XII. Оформление результатов
12.1 Результат количественного анализа представляют в виде формулы (5):
(X \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг}, (5)
где: X — результат определения, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг, рассчитанная по формуле (6):
\Delta = \delta \cdot X/100, (6)
где: \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 3.1), %.
Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.
Если содержание флуазаиндолизина либо его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «менее 0,01 мг/кг <15>».
<15> Примечание: 0,01 мг/кг — предел количественного определения флуазаиндолизина и его метаболитов IN-F4106, IN-A5760, IN-UNS90, IN-TMQ-01, IN-QZY47, IN-UJV12, IN-QEK31 в плодоовощной продукции.
XIII. Контроль качества результатов измерений
13.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с методическими документами <16>. Периодичность и формы контроля определяются системой менеджмента качества лаборатории.
<16> ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002; ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст; ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике», введенный в действие постановлением Госстандарта Российской Федерации от 23.04.2002 № 161-ст.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 19.07.1997 № 109-ФЗ «О безопасном обращении с пестицидами и агрохимикатами».
3. Технический регламент таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011).
4. Единые санитарно-эпидемиологические и гигиенические требования к продукции (товарам), подлежащей санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю).
5. Правила промышленной безопасности при использовании оборудования, работающего под избыточным давлением.
6. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».
7. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений».
8. ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений».
9. ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений».
10. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений».
11. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
12. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
13. ГОСТ Р 53228-2008 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
14. ГОСТ 1770-74 «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
15. ГОСТ OIML R 111-1-2009 «Гири классов E(1), E(2), F(1), F(2), M(1), M(1-2), M(2), M(2-3) и M(3). Часть 1. Метрологические и технические требования».
16. ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
17. ГОСТ 6995-77. «Реактивы. Метанол-яд. Технические условия».
18. ГОСТ 4233-77 «Натрий хлористый. Технические условия».
19. ГОСТ 4166-76 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
20. ГОСТ ISO 7886-1-2011 «Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования».
21. ГОСТ 26678-85 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
22. ГОСТ 12.1.007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
23. ГОСТ 12.1.019-2017 «Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
24. ГОСТ 12.1.004-91 «Пожарная безопасность. Общие требования».
25. ГОСТ 12.4.009-83 «Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
26. ГОСТ 5848-73 «Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия».
27. ГОСТ 29227-91 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
28. ГОСТ 32284-2013 «Морковь столовая свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия».
29. ГОСТ 34325-2017 «Перец сладкий свежий. Технические условия».
30. ГОСТ 33953-2016 «Земляника свежая. Технические условия».
31. ГОСТ 33932-2016 «Огурцы свежие, реализуемые в розничной торговле. Технические условия».
32. ГОСТ 34298-2017 «Томаты свежие. Технические условия».
33. ГОСТ 7975-2013 «Тыква продовольственная свежая».
34. ГОСТ 7176-2017 «Картофель продовольственный. Технические условия».
35. ГОСТ 7177-2022 «Арбузы продовольственные свежие. Технические условия».
36. ГОСТ 34216-2017 «Редис свежий. Технические условия».
37. ГОСТ Р 51809-2001 «Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия».
38. ГОСТ 33985-2016 «Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия».
39. ГОСТ 34320-2017 «Сельдерей свежий. Технические условия».
40. Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.