МУК 4.1.3959-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 в зеленой массе растений, в корнеплодах моркови, зерне бобовых культур (горох, нут), зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах (кукурузное, подсолнечное) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания
Актуально на 01.11.2026.
Как цитировать: "МУК 4.1.3959-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 в зеленой массе растений, в корнеплодах моркови, зерне бобовых культур (горох, нут), зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах (кукурузное, подсолнечное) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания". МУК 4.1.3959-23. https://bukva.ai/docs/muk-4-1-3959-23
(утв. Роспотребнадзором 06.07.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 06.10.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 6 июля 2023 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИФЛОКСИСТРОБИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ЦГА 321113 В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ РАСТЕНИЙ, В КОРНЕПЛОДАХ МОРКОВИ, ЗЕРНЕ БОБОВЫХ КУЛЬТУР (ГОРОХ, НУТ), ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ, СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА И РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЛАХ (КУКУРУЗНОЕ, ПОДСОЛНЕЧНОЕ) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3959-23
Дата введения 6 октября 2023 года
1. Разработаны ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет — МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр „Агроэкология пестицидов и агрохимикатов“ Минсельхоза России (А.В. Довгилевич, Е.В. Довгилевич, Н.В. Устименко, Е.Н. Тестова).»
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 6 июля 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения уровня остаточных количеств трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 в зеленой массе растений в диапазоне 0,05 — 0,50 мг/кг каждого вещества, а также в корнеплодах моркови, зерне гороха и кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах (кукурузное, подсолнечное) в диапазоне 0,01 — 0,10 мг/кг каждого вещества.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. Физико-химические свойства
2.1 Физико-химические свойства трифлоксистробина.
Название вещества по ИЮПАК: метил(E)-метоксиимино-{(E)- \alpha -[1-( \alpha,\alpha,\alpha -трифтор-m-толил)этилиденаминоокси]-o-толил}ацетат.
Эмпирическая формула: C20H19F3N2O4.
Агрегатное состояние: белое кристаллическое твердое вещество.
Цвет, запах: белый, без запаха.
Давление насыщенного пара при плюс 25 °C: 3,4 x 10-3 мПа.
Температура плавления: 72,9 °C.
Растворимость в воде (в г/дм3 при плюс 25 °C): 0,0006.
Растворимость в органических растворителях (в г/дм3 при плюс 25 °C): метанол — 76; н-гексан — 11; ацетон, толуол, дихлорметан, этилацетат > 500.
Стабильность к гидролизу (pH 9 при плюс 20 °C): ДТ50 1,1 дня.
При попадании в почву, воду и растительные объекты быстро гидролизуется, образуя довольно устойчивый метаболит — (E,E)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденаминооксиметил]фенил}-уксусную кислоту (ЦГА 321113).
В биологически активных почвах в анаэробных условиях трифлоксистробин быстро разрушается: ДТ90 = 4 — 8 дней.
2.2. Трифлоксистробин относится к малоопасным веществам по острой оральной (ЛД50 для крыс более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД50 для крыс более 2000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК50 для крыс (4 часа) более 4646 мг/м3 воздуха). Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика.
2.3. Трифлоксистробин — синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Sirobilurus tenacellus. Высокоэффективен против возбудителей болезней плодовых культур и плодов при хранении.
2.4. Физико-химические свойства метаболита трифлоксистробина ЦГА 321113.
Название вещества по ИЮПАК: (E)-метоксиимино-{(E)- \alpha -[1-( \alpha,\alpha,\alpha -трифтор-m-толил)этилиденаминоокси]-o-толил}ацетат.
Эмпирическая формула: C19H17F3N2O4.
Агрегатное состояние: белое кристаллическое твердое вещество.
Цвет, запах: белый, без запаха.
В биологически активных почвах в аэробных условиях метаболит ЦГА 321113 достаточно стабилен: ДТ50 = 110 дней, ДТ90 = 279 дней.
3.1. Метод основан на определении трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 методом ВЭЖХ с использованием диодно-матричного детектора.
3.2. Определение трифлоксистробина в зеленой массе растений проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонках с флорисилом и окисью алюминия.
Определение трифлоксистробина в корнеплодах моркови проводится после его экстракции из образцов этилацетатом и дальнейшей очистки экстракта на колонках с флорисилом.
Определение трифлоксистробина в зерне гороха и кукурузы проводится после его экстракции из образцов этилацетатом, дальнейшей очистки экстракта на колонках с флорисилом и окисью алюминия, а затем на концентрирующих патронах № 1.
Определение трифлоксистробина в семенах подсолнечника проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом, дальнейшей очистки экстракта на колонках с флорисилом и окисью алюминия, а затем на концентрирующих патронах № 1.
Определение трифлоксистробина в растительных маслах проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом и дальнейшей очистки экстракта на колонках с флорисилом и окисью алюминия.
3.3. Определение ЦГА 321113 в зеленой массе растений проводится после его экстракции из образцов этилацетатом и дальнейшей очистки экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Определение ЦГА 321113 в зерне кукурузы и гороха, корнеплодах моркови, в семенах подсолнечника, а также в растительных маслах проводится после его экстракции из образцов ацетонитрилом и дальнейшей очистки экстракта на концентрирующих патронах № 2 и 3.
3.4. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.
3.5. В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.
IV. Метрологические характеристики
4.1. При соблюдении всех условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 4.1 для соответствующих диапазонов концентраций.
Метрологические характеристики
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 5.1 - 5.3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| Хроматограф жидкостный с диодно-матричным детектором | Внесено в реестр «Утвержденные типы средств измерений» Федерального информационного фонда по обеспечению единства измерений |
| Весы аналитические | Наибольший предел взвешивания 110 г, дискретность 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228 |
| Весы лабораторные | Наибольший предел взвешивания 400 г, предел допустимой погрешности +/- 0,5 г, класс точности средний (III) по ГОСТ Р 53228 |
| Иономер (pH-метр) | Диапазон измерения 0 ... 14 pH; предел абсолютной погрешности +/- 0,01 ед. pH |
| Колбы мерные лабораторные стеклянные | Тип 2-10-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2 и 2-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные лабораторные стеклянные | Тип 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 и 1-2-2-10 по ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные лабораторные стеклянные | Тип 1-10-2, 1-25-2, 1-50-2, 1-100-2, 1-250-2, 1-500-2, 1-1000-2 по ГОСТ 1770 |
| Наименование реактивов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Трифлоксистробин, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 99,0% |
| ЦГА 321113, аналитический стандарт | Содержание основного вещества не менее 98,0% |
| Алюминий окись | Нейтральная, размер частиц 50 — 200 мкм |
| Ацетон химически чистый | ГОСТ 2603 |
| Ацетонитрил химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99,8% |
| Ацетонитрил для ВЭЖХ | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| Вода дистиллированная | ГОСТ Р 58144 |
| Вода для лабораторного анализа | ГОСТ Р 52501 |
| Гелий очищенный | Содержание основного вещества не менее 99,9% |
| н-Гексан химически чистый | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Калий марганцовокислый чистый для анализа | ГОСТ 20490 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный чистый | ГОСТ 2493 |
| Кальций хлористый чистый для анализа | Содержание основного вещества не менее 99% |
| Кислота муравьиная для анализа | Содержание основного вещества не менее 98% |
| Кислота ортофосфорная химически чистая | Содержание основного вещества не менее 85% |
| Кислота уксусная химически чистая ледяная | ГОСТ 61 |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 1) | Заполнены гидрофобным сорбентом с размером частиц 63 — 200 мкм с привитыми октильными (C8) группами (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 2) | Заполнены гидрофильным слабокислым сорбентом (C) с размером частиц 63 — 200 мкм (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Концентрирующие патроны для твердофазной экстракции (патрон № 3) | Заполнены гидрофобным сорбентом с размером частиц 63 — 200 мкм с привитыми гексадецильными (C16) группами (объем — 1 см3, масса сорбента — 0,6 г) |
| Натрий гидроксид чистый для анализа | ГОСТ 4328 |
| Натрий сернокислый химически чистый | ГОСТ 4166 |
| Флорисил (магния силикат) для колоночной хроматографии | Размер частиц 60 — 100 меш |
| Этилацетат чистый для анализа | ГОСТ 22300 |
Вспомогательные устройства, материалы
| Наименование вспомогательного оборудования, устройств, материалов | Обозначение и наименование документов, технические характеристики |
|---|---|
| 1 | 2 |
| Аллонж прямой стеклянный | Тип АО по ГОСТ 25336 |
| Банки полипропиленовые с крышками для экстракции | Объем 250 см3 |
| Ванна ультразвуковая | Рабочая частота 50 кГц |
| Вата медицинская гигроскопическая хлопковая нестерильная | ГОСТ 5556 |
| Виалы, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой, для жидких проб | Объем 2 см3 |
| Виалы стеклянные с крышкой с тефлоновой прокладкой | Объем не менее 40 см3 |
| Воронки делительные | Тип ВД по ГОСТ 25336 |
| Воронки лабораторные стеклянные | Тип В по ГОСТ 25336 |
| Колбы конические стеклянные | Тип Кн по ГОСТ 25336 |
| Колбы круглодонные стеклянные | Тип К по ГОСТ 25336 |
| Колонка хроматографическая стальная | Заполнена сорбентом с привитыми неполярными группами C18; линейные размеры 250 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм |
| Колонки хроматографические стеклянные или пластиковые | Длина 150 — 250 мм, диаметр 15 мм |
| Насос мембранный вакуумный | Обеспечивающий вакуум — до 10 мбар |
| Ротационный вакуумный испаритель | Снабжен ручным подъемником, с диагональным конденсатором и объемом испарительной колбы от 50 до 3000 см3, с изменяемой скоростью вращения штока испарителя от 5 до 240 об/мин, с водяной баней с антикоррозионным покрытием объемом не менее 5 дм3 и с диапазоном температур 20 — 100 °C |
| Стаканы лабораторные стеклянные | Тип В, номинальная вместимость (100 — 800 см3) по ГОСТ 25336 |
| Установка для перегонки растворителей | С круглодонной колбой объемом 4000 см3 и приемной конической колбой объемом 1000 см3 |
| Фильтры обеззоленные нейтральные, быстро фильтрующие | Диаметр 11 см, зольность одного фильтра 0,00072 г |
| Фильтры мембранные для очистки растворителей | Диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм |
| Центрифуга с набором полипропиленовых банок | Максимальное рабочее число оборотов 4000 об/мин, рабочий объем ротора 200 см3 x 4 ячейки, выбираемый временной диапазон работы от 0 до 100 минут. Объем банок 200 см3 |
| Шприц инъекционный многократного применения | Объем 10 см3 по ГОСТ 22967 |
Примечание. Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, а также посуды, реактивов и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам.
6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.
6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.
8.1. Отбор проб производится в соответствии с правилами <1>.
<1> Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов, утвержденные заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.1979 № 2051-79.
Пробы зеленой массы растений и корнеплодов моркови хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре плюс (4 +/- 2) °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18 °C.
Отобранные пробы зерна бобовых культур (горох, нут) и кукурузы, а также семян подсолнечника подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.
Пробы растительного масла хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре плюс (4 +/- 2) °C не более 10 суток.
IX. Условия проведения измерений
9.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 — 30 °C, относительной влажности не более 80%;
- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.
X. Подготовка к выполнению измерений
10.1. Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с флорисилом, окисью алюминия и концентрирующих патронах № 1, проверка хроматографического поведения ЦГА 321113 на концентрирующих патронах № 2 и № 3, установление градуировочных характеристик.
Подготовка органических растворителей.
10.1.1 Очистка ацетонитрила.
Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Ацетонитрил перегоняют при температуре плюс 81,0 — 82,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 81,0 — 82,0 °C, отбрасывают.
10.1.2 Очистка ацетона.
Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/дм3.
Ацетон перегоняют при температуре плюс 56,0 — 56,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 56,0 — 56,5 °C, отбрасывают.
10.1.3 Очистка гексана.
Гексан, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем гексан сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Гексан перегоняют при температуре плюс 68,5 — 69,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 68,5 — 69,0 °C, отбрасывают.
10.1.4 Очистка этилацетата.
Этилацетат, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм3. Выдерживают его над осушителем в течение 5 — 6 часов. Затем этилацетат сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 аппарата для перегонки растворителей.
Этилацетат перегоняют при температуре плюс 76,5 — 77,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 76,5 — 77,5 °C, отбрасывают.
10.1.5 Приготовление бидистиллированной воды.
Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 см3 от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм3 и кипятят в течение 6 часов.
Собирают фракции, отогнанные при температуре плюс 99,5 — 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше плюс 99,5 — 100,0 °C, отбрасывают.
10.2 Приготовление растворов для проведения анализа.
10.2.1 Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ.
10.2.1.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ при определении трифлоксистробина.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и бидистиллированную воду, предварительно профильтрованные через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 650 см3 ацетонитрила и 350 см3 бидистиллированной воды. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.1.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ при определении метаболита трифлоксистробина ЦГА 321113.
Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и 0,1%-й водный раствор ортофосфорной кислоты, которые предварительно фильтруют через мембранные фильтры для очистки растворителей.
В плоскодонную колбу объемом 1000 см3 помещают 400 см3 0,1% водного раствора ортофосфорной кислоты и 600 см3 ацетонитрила. Смесь тщательно перемешивают.
При использовании градиентного режима хроматографирования компоненты подвижной фазы помещают в разные емкости.
В случае отсутствия в составе хроматографической системы автоматического дегазатора через раствор подвижной фазы пропускают газообразный гелий со скоростью 20 см3/мин в течение 5 минут, после чего его помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.
Приготовленный раствор подвижной фазы хранится при комнатной температуре не более пяти дней.
10.2.2 Приготовление рабочих растворов.
10.2.2.1 Приготовление 0,1% водного раствора ортофосфорной кислоты.
В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 бидистиллированной воды и 1 см3 ортофосфорной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки бидистиллированной водой. Раствор используется в качестве компонента подвижной фазы и хранится при комнатной температуре не более десяти дней.
10.2.2.2 Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия.
20 г гидроокиси натрия переносят в термостойкий химический стакан на 500 см3, добавляют 200 — 300 см3 дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают (осторожно при растворении щелочи раствор сильно нагревается) и после охлаждения раствор переносят в мерную колбу объемом 500 см3, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой). Приготовленный раствор хранится при комнатной температуре в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 12 месяцев.
10.2.2.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия.
Взвешивают 11,4 г K2HPO4 x 3H2O и переносят в мерную колбу объемом 1000 см3, добавляют 500 — 600 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения солей, проверяют pH полученного раствора. Если pH раствора менее 9, доводят его до указанного значения с помощью 1 М раствора гидроокиси натрия, контролируя pH. После достижения нужного значения pH объем доводят водой до метки. Приготовленный раствор хранится при комнатной температуре в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 12 месяцев.
10.2.2.4 Приготовление 0,5%-го водного раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 0,5 см3 ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки. Раствор используется для приготовления 0,005%-го водного раствора уксусной кислоты и хранится при комнатной температуре не более 14 суток.
10.2.2.5 Приготовление 0,005%-го водного раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 бидистиллированной воды, прибавляют 1 см3 0,5%-го водного раствора уксусной кислоты, перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
10.2.2.6. Приготовление 0,2%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле.
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 ацетонитрила, прибавляют 0,2 см3 ледяной уксусной кислоты, перемешивают и доводят ацетонитрилом объем в колбе до метки. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
10.2.2.7. Приготовление смеси гексана с этилацетатом и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:1 (по объему).
В мерную колбу объемом 100 см3 помещают 50 см3 гексана, 50 см3 этилацетата, прибавляют 1,0 см3 муравьиной кислоты. Раствор в колбе перемешивают и используют при очистке экстракта на концентрирующих патронах № 2. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
10.2.3 Приготовление градуировочных растворов трифлоксистробина.
10.2.3.1. Стандартный раствор № 1 с концентрацией трифлоксистробина 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг трифлоксистробина в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 1 хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.3.2. Стандартный раствор № 2 с концентрацией трифлоксистробина 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 1 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 2 хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.3.3. Стандартный раствор № 3 с концентрацией трифлоксистробина 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 2 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.4. Стандартный раствор № 4 с концентрацией трифлоксистробина 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.5. Стандартный раствор № 5 с концентрацией трифлоксистробина 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.6. Стандартный раствор № 6 с концентрацией трифлоксистробина 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 3 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.7. Стандартный раствор № 7 с концентрацией трифлоксистробина 0,07 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 6 отбирают пипеткой 7 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 7 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.8. Стандартные растворы трифлоксистробина с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы матриц.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 2,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,2 и 0,1 мкг/см3, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.3.9. Стандартные растворы трифлоксистробина с концентрацией 0,5; 0,25; 0,1 и 0,05 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы растительного масла.
Методом последовательного разведения ацетоном из стандартного раствора № 2 готовят растворы, содержащие по 0,5; 0,25; 0,1 и 0,05 мкг/см3 и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы растительного масла. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4 Приготовление градуировочных растворов ЦГА 321113.
10.2.4.1. Стандартный раствор № 8 с концентрацией ЦГА 321113 100,0 мкг/см3.
Взвешивают 10 мг ЦГА 321113 в мерной колбе объемом 100 см3. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 8 хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.4.2. Стандартный раствор № 9 с концентрацией ЦГА 321113 10,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 8 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор № 9 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор № 9 хранится при температуре не выше (4 +/- 2) °C не более 3 месяцев.
10.2.4.3. Стандартный раствор № 10 с концентрацией ЦГА 321113 1,0 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 9 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 10 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.4. Стандартный раствор № 11 с концентрацией ЦГА 321113 0,5 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 10 отбирают пипеткой 5 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 11 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.5. Стандартный раствор № 12 с концентрацией ЦГА 321113 0,2 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 10 отбирают пипеткой 2 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 12 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.6. Стандартный раствор № 13 с концентрацией ЦГА 321113 0,1 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 10 отбирают пипеткой 1 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 13 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.7. Стандартный раствор № 14 с концентрацией ЦГА 321113 0,07 мкг/см3.
Из стандартного раствора № 13 отбирают пипеткой 7 см3, помещают в мерную колбу объемом 10 см3 и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему). Стандартный раствор № 14 используется для установления градуировочной характеристики и хранится при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.8. Стандартные растворы ЦГА 321113 с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы матриц.
Методом последовательного разведения ацетонитрилом из стандартного раствора № 9 готовят растворы, содержащие по 2,5; 1,0; 0,5; 0,25; 0,2 и 0,1 мкг/см3, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.2.4.9. Стандартные растворы ЦГА 321113 с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3 для внесения в контрольные образцы растительного масла.
Методом последовательного разведения ацетоном из стандартного раствора № 9 готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/см3, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы матриц. Стандартные растворы для внесения хранятся при температуре не выше плюс (4 +/- 2) °C не более 30 дней.
10.3. Установление и контроль стабильности градуировочной характеристики.
10.3.1. Установление градуировочной характеристики при определении трифлоксистробина.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации трифлоксистробина в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки с концентрацией 1,00; 0,50; 0,20 и 0,10 и 0,07 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
10.3.2. Установление градуировочной характеристики при определении ЦГА 321113.
Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации ЦГА 321113 в растворе (мкг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5-ти растворам для градуировки с концентрацией 1,00; 0,50; 0,20 и 0,10 и 0,07 мкг/см3.
В инжектор хроматографа вводят по 20 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 11.9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.
10.3.3 Контроль стабильности градуировочной характеристики.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.
При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание трифлоксистробина или ЦГА 321113 в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,07 до 1,00 мкг/см3.
Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:
\text{А } = \frac{(\text{Х } - \text{С }) \times 100}{\text{С}} \leq 10, (1)
где X — концентрация трифлоксистробина или ЦГА 321113 контрольного измерения, мкг/см3;
C — известная концентрация градуировочного раствора трифлоксистробина или ЦГА 321113 в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;
10 — погрешность градуировочной характеристики, %.
Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов трифлоксистробина или ЦГА 321113, предусмотренных методикой выполнения измерений. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 10.3.1 или п. 10.3.2.
10.4. Подготовка колонки с окисью алюминия (5 г) для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на ней.
10.4.1 Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 5 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 см3 ацетонитрила.
10.4.2. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с окисью алюминия.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора трифлоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 10 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки колбы и наносят раствор на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают двумя порциями по 10 см3 ацетонитрила и вносят их на колонку. Элюат после прохождения каждой порции растворителей собирают в отдельные отгонные колбы объемом по 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие трифлоксистробин, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения трифлоксистробина на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.
10.5. Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстракта и проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на ней.
10.5.1 Подготовка колонки с 5 г флорисила для очистки экстракта.
В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 5 г флорисила с зернением 60/100 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флорисила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.
В день использования колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и 10 см3 гексана. Элюаты отбрасывают.
10.5.2. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с 5 г флорисила.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора трифлоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Колонку последовательно промывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и четырьмя порциями по 5 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Каждую порцию собирают отдельно в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие трифлоксистробин, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.
Изучение поведения трифлоксистробина на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флорисила.
10.6. Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на них.
10.6.1 Подготовка концентрирующих патронов № 1 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 1 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:9, затем 10 см3 воды. Элюаты отбрасывают.
Не допускать высыхания поверхности патрона.
10.6.2. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на концентрирующих патронах № 1.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора трифлоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 воды, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и двумя порциями по 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 3:1 и вносят растворы на патрон. Элюат после прохождения каждой порции растворителей собирают в отдельные отгонные колбы объемом по 100 см3 и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие трифлоксистробин, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения трифлоксистробина на концентрирующих патронах № 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.7. Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения ЦГА 321113 на них.
10.7.1 Подготовка концентрирующих патронов № 2 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 2 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1, затем 10 см3 гексана. Элюаты отбрасывают.
Не допускать высыхания поверхности патрона.
10.7.2. Проверка хроматографического поведения ЦГА 321113 на концентрирующих патронах № 2.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора ЦГА 321113 в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 этилацетата, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1, 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 4:1 и 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1, а затем двумя порциями по 10 см3 каждая смеси гексана с этилацетатом и муравьиной кислотой в соотношении 50:50:1 и последовательно вносят эти растворы на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие ЦГА 321113, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ЦГА 321113 на концентрирующих патронах № 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.8. Подготовка концентрирующих патронов № 3 для очистки экстрактов и проверка хроматографического поведения ЦГА 321113 на них.
10.8.1 Подготовка концентрирующих патронов № 3 для очистки экстракта.
Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 см3/мин.
Патрон № 3 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 см3 (используют как емкость для элюентов).
Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 см3 ацетонитрила, затем 15 см3 воды. Элюаты отбрасывают.
Не допускать высыхания поверхности патрона.
10.8.2. Проверка хроматографического поведения ЦГА 321113 на концентрирующих патронах № 3.
В отгонную колбу объемом 100 см3 вносят 1 см3 стандартного раствора ЦГА 321113 в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/см3 и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 5 см3 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия (п. 10.2.2.3), помещают концентратор на 5 — 10 секунд в ультразвуковую ванну, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Исходную колбу обмывают 10 см3 0,005%-го водного раствора уксусной кислоты и вносят раствор на патрон. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Патрон высушивают под вакуумом примерно 2 минуты.
Исходную колбу обмывают двумя порциями 0,2%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле объемом 10 см3 каждая и последовательно вносят их на патрон. Элюаты собирают в чистые отгонные колбы объемом по 100 см3, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Отдувают холодным воздухом до исчезновения запаха уксусной кислоты.
Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 мм3 хроматографируют.
Определяют фракции, содержащие ЦГА 321113, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.
Изучение поведения ЦГА 321113 на концентрирующих патронах № 3 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.
10.9. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии.
10.9.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии при определении трифлоксистробина.
Хроматографическую колонку устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой (смесь ацетонитрила с водой в соотношении 65:35) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин.
10.9.2. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии при определении ЦГА 321113.
Хроматографическую колонку устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют ее при температуре плюс 30 °C в течение 3 — 4 часов, промывая подвижной фазой (смесь ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 60:40 по объему) при скорости подачи растворителя 1,0 см3/мин.
11.1 Трифлоксистробин в зеленой массе растений.
11.1.1. Экстракция и очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Образец измельченной зеленой массы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, добавляют 75 см3 ацетонитрила, помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в делительную воронку объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 75 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в делительную воронку объемом 250 см3.
К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 см3 гексана и встряхивают делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру очистки еще раз, используя 50 см3 гексана. Верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) собирают в отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.2 Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Сухой остаток в колбе, полученный по п. 11.1.1, растворяют в 1 см3 ацетона, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и наносят на подготовленную по п. 10.5.1 колонку с флорисилом. Элюат отбрасывают.
Колонку промывают 10 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, элюат отбрасывают.
Трифлоксистробин элюируют с колонки 15 см3 смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.1.3 Очистка экстракта на колонках с 5 г окиси алюминия.
Сухой остаток, полученный по п. 10.1.2, растворяют в 10 см3 ацетонитрила, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленную по п. 10.4.1 колонку с 5 г окиси алюминия, элюат собирают в отгонную колбу объемом 100 см3.
Исходную колбу обмывают 10 см3 ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют в отгонной колбе объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.2 Трифлоксистробин в корнеплодах моркови.
11.2.1 Экстракция.
Образец измельченных корнеплодов моркови массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 этилацетата и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 50 см3 этилацетата. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Сухой остаток растворяют в 1,0 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.3 Трифлоксистробин в зерне гороха и кукурузы.
11.3.1 Экстракция.
Образец измельченного зерна гороха или кукурузы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 этилацетата и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 50 см3 этилацетата. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают досуха (или до маслянистого остатка) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.3.2 Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
Остаток в колбе, полученный по п. 11.3.1, растворяют в 1 см3 ацетона и проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с флорисилом.
11.3.3 Очистка экстракта на колонках с 5 г окиси алюминия.
Сухой остаток в колбе, полученный по п. 11.3.2, растворяют в 10 см3 ацетонитрила и проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.3. Очистка экстракта на колонках с 5 г окиси алюминия.
11.3.4 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток в колбе, полученный по п. 11.3.3, растворяют в 1 см3 ацетонитрила, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 воды, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 и 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и вносят растворы на патрон. Элюаты отбрасывают.
Трифлоксистробин элюируют с патрона 10 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 3:1, элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 1,0 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.4 Трифлоксистробин в семенах подсолнечника.
11.4.1 Экстракция.
Образец измельченных семян подсолнечника массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 этилацетата и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Затем пробу центрифугируют 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 50 см3 этилацетата, центрифугируют 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.4.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
Маслянистый остаток в колбе, полученный по п. 11.4.1, растворяют в 2 см3 ацетонитрила, прибавляют 50 см3 гексана, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 см3.
Трифлоксистробин экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 см3, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (ацетонитрил) собирают в чистую отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с флорисилом, п. 11.1.3. Очистка экстракта на колонках с 5 г окиси алюминия и п. 11.3.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 1.
Сухой остаток растворяют в 1,0 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.5 Трифлоксистробин в растительных маслах.
11.5.1 Экстракция.
Навеску масла массой 5 г помещают в химический стакан объемом 100 см3. Переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями гексана объемом по 25 см3. Трифлоксистробин экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 см3, каждый раз встряхивая делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают досуха при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.1.2. Очистка экстракта на колонке с флорисилом и п. 11.1.3. Очистка экстракта на колонках с 5 г окиси алюминия.
Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.6 ЦГА 321113 в зеленой массе растений.
11.6.1 Экстракция.
Образец измельченной зеленой массы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 75 см3 этилацетата и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще раз в тех же условиях, используя 75 см3 этилацетата. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.6.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Сухой остаток в колбе, полученный по п. 11.6.1, растворяют в 1 см3 этилацетата, тщательно обмывают стенки колбы, добавляют 9 см3 гексана, перемешивают и вносят раствор на подготовленный патрон № 2. Элюат отбрасывают.
Исходную колбу последовательно обмывают 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1, 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 4:1 и 10 см3 смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:1 и вносят растворы на патрон. Элюаты отбрасывают.
ЦГА 321113 элюируют с патрона 10 см3 смеси гексан-этилацетат-муравьиная кислота в соотношении 50:50:1, элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
Сухой остаток растворяют в 2,5 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.7. ЦГА 321113 в зерне кукурузы и гороха, корнеплодах моркови и семенах подсолнечника.
11.7.1 Экстракция.
Образец измельченной матрицы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см3, прибавляют 50 см3 ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр низкой плотности в отгонную колбу объемом 250 см3. Экстракцию повторяют еще два раза в тех же условиях, используя по 50 см3 ацетонитрила. Экстракты фильтруют, объединяют в отгонной колбе объемом 250 см3 и выпаривают досуха (или до маслянистого остатка) на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C.
11.7.2 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
Остаток в колбе, полученный по п. 11.7.1, растворяют в 1 см3 этилацетата и проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.6.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2.
11.7.3 Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 3.
Сухой остаток, полученный по п. 11.7.2, растворяют в 5 см3 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия (п. 10.2.2.3), помещают колбу на 5 — 10 секунд в ультразвуковую ванну, обмывают стенки колбы и вносят раствор на подготовленный патрон № 3. Элюат отбрасывают.
Исходную колбу обмывают 10 см3 0,005%-го водного раствора уксусной кислоты и вносят раствор на патрон. Элюат отбрасывают. Патрон высушивают под вакуумом в течение примерно 2 минут.
ЦГА 321113 элюируют с патрона 10 см3 0,2%-го раствора уксусной кислоты в ацетонитриле, элюат собирают в чистую отгонную колбу объемом 100 см3 и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше плюс 40 °C. Отдувают током холодного воздуха до исчезновения запаха уксусной кислоты.
Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.8 ЦГА 321113 в растительных маслах.
11.8.1 Экстракция.
Навеску масла массой 10 г помещают в химический стакан объемом 100 см3. Переносят ее в делительную воронку объемом 250 см3 двумя порциями гексана объемом по 25 см3. ЦГА 321113 экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 20 см3, каждый раз встряхивая делительную воронку в течение 2 минут. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний гексановый слой отбрасывают, а нижний ацетонитрильный слой собирают в отгонную колбу объемом 250 см3 и выпаривают до маслянистого остатка при температуре не выше плюс 40 °C.
Далее проводят очистку экстракта, как указано в п. 11.7.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 2 и п. 11.7.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах № 3.
Сухой остаток растворяют в 1,0 см3 смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 (по объему) и 20 мм3 пробы вводят в хроматограф.
11.9 Условия хроматографирования.
11.9.1 Хроматографическая система.
11.9.2 Условия хроматографирования при определении трифлоксистробина.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила с бидистиллированной водой в соотношении 65:35 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме.
Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,07 — 1,00 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор трифлоксистробина с концентрацией 1 мкг/см3, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания трифлоксистробина в пробах.
11.9.3 Условия хроматографирования при определении ЦГА 321113.
Колонка хроматографическая стальная, заполненная сорбентом с привитыми неполярными группами C18.
Температура колонки: плюс 30 °C.
Подвижная фаза: смесь ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 60:40 (по объему) при хроматографировании в изократическом режиме.
Скорость потока элюента: 1,0 см3/мин.
Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.
Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,07 — 1,00 нг.
Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор ЦГА 321113 с концентрацией 1 мкг/см3, соответственно разбавляют. В этом случае разбавление учитывают в конечной формуле расчета содержания ЦГА 321113 в пробах.
XII. Обработка результатов измерения
12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используется компьютерное программное обеспечение химического анализа, которое входит в хроматографическую систему.
Альтернативная обработка результатов.
Содержание трифлоксистробина или ЦГА 321113 в пробах рассчитывают по формуле, без учета полноты извлечения вещества из проб:
где X — содержание трифлоксистробина или ЦГА 321113 в пробе, мг/кг;
A — концентрация трифлоксистробина или ЦГА 321113, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;
V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;
m — масса анализируемого образца, г.
XIII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений
13.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:
\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r, (3)
где X1, X2 - результаты параллельных определений, мг/кг;
r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .
При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.
14.1 Результат анализа представляют в виде:
(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{кг}, при вероятности P = 0,95,
где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;
\Delta = \delta \cdot \overline{X}/100,
где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 4.1), %.
В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
«Содержание трифлоксистробина или ЦГА 321113 в зеленой массе растений — менее 0,05 мг/кг; содержание трифлоксистробина или ЦГА 321113 в корнеплодах моркови, зерне гороха и кукурузы, семенах подсолнечника и в растительных маслах — менее 0,01 мг/кг».
XV. Контроль качества результатов измерений
15.1. Контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6).
Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.
Полнота извлечения трифлоксистробина из зеленой массы растений, корнеплодов моркови, зерна бобовых культур (горох, нут), зерна кукурузы, семян подсолнечника и из растительных масел (кукурузное, подсолнечное) (5 повторностей для каждой концентрации, P = 0,95)
Полнота извлечения метаболита трифлоксистробина ЦГА 321113 из зеленой массы растений, корнеплодов моркови, зерна бобовых культур (горох, нут), зерна кукурузы, семян подсолнечника и из растительных масел (кукурузное, подсолнечное) (5 повторностей для каждой концентрации, P = 0,95)
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. ГОСТ Р 8.563 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений».
3. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6) «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».
4. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
5. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».
6. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
7. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».
8. ГОСТ 12.4.009 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание».
9. ГОСТ 12.0.004 «Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».
10. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
11. ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».
12. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».
13. ГОСТ 25336 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».
14. ГОСТ 6709 «Вода дистиллированная. Технические условия».
15. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
16. ГОСТ 5556 «Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия».
17. ГОСТ 4166 «Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия».
18. ГОСТ 20490 «Реактивы. Калий марганцовокислый. Технические условия».
19. ГОСТ 2493 «Реактивы. Калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный. Технические условия».
20. ГОСТ 61 «Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия».
21. ГОСТ 4328 «Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия».
22. ГОСТ 22300 «Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия».
23. ГОСТ ISO 6497 «Корма. Отбор проб».
24. ГОСТ 32284 «Морковь столовая свежая, реализуемая в розничной торговой сети. Технические условия».
25. ГОСТ 33540 «Морковь столовая свежая для промышленной переработки. Технические условия».
26. ГОСТ 13586.3 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб».
27. ГОСТ 28674 «Горох. Технические условия».
28. ГОСТ 8758 «Нут. Требования при заготовках и поставках».
29. ГОСТ 10852 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб».
30. ГОСТ 22391 «Подсолнечник. Технические условия».
31. ГОСТ 1129 «Масло подсолнечное. Технические условия».
32. ГОСТ 32190 «Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб».